郎丹瑩，呂庚寅，梁廣旺，李瑞航，郭曉光，徐 虹,2，郭藹光,2

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學研究國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥UROS基因的可變剪接

郎丹瑩1，呂庚寅1，梁廣旺1，李瑞航1，郭曉光1，徐 虹1,2，郭藹光1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學研究國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

可變剪接是一種重要的基因表達調控機制，對植物的發(fā)育、生理、代謝、信號轉導以及外界逆境的響應等多個過程都有調控。為進一步探討小麥基因的可變剪接機制以及深入研究小麥UROS基因的功能，以返白系、矮變1號和中國春三個普通六倍體小麥品種為材料，克隆了尿卟啉原Ⅲ合成酶基因(UROS)的gDNA和cDNA序列，并利用生物信息學技術研究了小麥葉片中UROS基因的可變剪接方式。結果表明，根據(jù)在線小麥基因組數(shù)據(jù)庫，將克隆到的UROS基因組DNA序列分別定位在4BL和4DL兩個基因位點，命名為 UROS-4B和 UROS-4D。從三個品種中克隆得到大約50個不同的UROS基因cDNA序列，通過在線預測和與基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)UROS基因存在可變剪接，并鑒定出兩個UROS基因位點各有一個標準剪接轉錄本和兩個非標準剪接轉錄本?？勺兗艚臃绞揭詢?nèi)含子保留為主，還有可變的供體剪接位點和可變的受體剪接位點，品種間的剪接方式不完全相同。由不同轉錄本預測編碼的多肽氨基酸序列也存在差異，兩個基因位點選取的六個轉錄本所編碼的多肽有12個氨基酸位點的變異。

小麥；返白系；尿卟啉原Ⅲ合成酶；可變剪接；標準剪接與非標準剪接

可變剪接也被稱為選擇性剪接，是高等真核生物細胞中廣泛存在的一種基因表達調控機制。在mRNA的轉錄后加工過程中，通過剪接位點的可變選擇，一個基因可以產(chǎn)生多個mRNA的轉錄本，翻譯為多種多肽序列，增加了蛋白質的多樣性，并影響mRNA的穩(wěn)定性[1-4]。一些剪接方式導致編碼區(qū)的提前終止，引起無義mRNA降解[5]?？勺兗艚拥倪^程是由剪接體來完成，剪接體是一個大的RNA-蛋白復合體，由5個小RNA分子和大約180個具有不同功能的蛋白亞基組成[6]。1977年，Berget等[7]和Chow等[8]在對腺病毒2型mRNA的研究過程中發(fā)現(xiàn)，基因內(nèi)含子序列可以在轉錄后加工過程中被移除，當時稱之為特定重排。1981年，Rosenfeld 等[9]首次報道在高等哺乳動物小鼠降血鈣素基因中發(fā)現(xiàn)了多種RNA分子?，F(xiàn)有研究表明，在人體中大約有95%以上的基因都存在可變剪接[10]。1989年，在擬南芥和菠菜中發(fā)現(xiàn)1,5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶活化酶(Rubisco activase)基因存在可變剪接[11]。二十幾年的研究表明，可變剪接也是植物基因表達的重要調控方式[4]，涉及到植物的很多生理代謝過程、信號轉導以及對外界生物和非生物脅迫的響應[12-17]，大約60%的植物基因都存在可變剪接[12]。對擬南芥[18-24]、玉米[25-28]、水稻[29]、二穗短柄草[30]、馬鈴薯[31]、山葡萄[32-33]等的研究表明，植物中主要有5種前體mRNA的剪接方式，其中最多的是內(nèi)含子保留(intron rention，IR)[5,15-16,29,34]。

I型淀粉分支酶基因 Sbe1是最早報道的小麥可變剪接基因[35]，基因全長5.4 kb，大約有14個外顯子，有三個不同的轉錄本，在胚乳的不同階段表達。此后，分別有光周期響應基因 Ppd-B1[36]、干旱脅迫響應轉錄因子編碼基因 DREB2[37-38]、多酚氧化酶基因 Ppo-A1[39]、ε-環(huán)化酶基因ε-LCY和八氫血紅素合成酶基因 Psy-A1的相關研究報道[40]，這些基因涉及到了小麥的發(fā)育、生理生化代謝、逆境脅迫響應等多個過程，也揭示出小麥中基因的可變剪接具有普遍性。

尿卟啉原Ⅲ合成酶(Uroporphyrinogen Ⅲ synthase，UROS)是天然四吡咯化合物生成過程中的關鍵酶之一，它催化線性的四吡咯底物羥甲基膽素經(jīng)過一次重要的分子內(nèi)重排形成天然四吡咯化合物的共同前體——尿卟啉原Ⅲ[41-42]。1975年Higuchi等[43]開展了小麥UROS的分離鑒定工作。筆者所在實驗室在研究小麥低溫誘導階段性白化突變材料返白系的白化機理過程中發(fā)現(xiàn)，返白系葉綠素合成途徑中從膽色素原至尿卟啉原Ⅲ位點受阻[44-47]，進而對小麥UROS分離純化[48]，并用同源比對和電子克隆的方法獲得UROS基因的cDNA序列[49]。本研究克隆了返白系、矮變1號和中國春三個普通六倍體小麥UROS基因的gDNA與cDNA序列，利用生物信息學軟件探索不同染色體位點UROS基因對應的可變剪接方式，以期為進一步研究小麥基因的可變剪接機制以及深入研究小麥UROS基因的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其處理

以普通六倍體小麥品種中國春、返白系及其對照親本矮變1號為材料，種子最初由郭藹光教授惠贈，由本實驗室長期保存。

小麥種子先用70%乙醇溶液消毒1 min，再用10% NaClO溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次，浸泡24 h出芽后，移植在營養(yǎng)缽中，在25 ℃下培養(yǎng)10 d，至三葉期，剪取葉片用于提取基因組DNA與總RNA。

1.2 基因組DNA的分離與UROS基因gDNA序列的擴增

采用CTAB法提取基因組DNA，利用NanoDrop 1000分光光度計檢測總DNA濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠檢測。參考本實驗室前期克隆且已發(fā)表的UROS基因cDNA序列(GenBank No. EF160077.1)[49]設計基因組DNA擴增引物UROS-F/UROS-R(UROS-F:5′-CTCCGCAAC GGAAGCCGCGGGATCG-3′; UROS-R: 5′-GG GAACACTTGTGCATATGCCGTGCCCG-3′)。擴增體系(20 μL)：10×LA Buffer 2.0 μL、上下游引物各0.5 μL、DMSO 0.2 μL、LATaq(TaKaRa)0.2 μL、DNA 1 μL、dNTPs 1 μL、RNase Free ddH2O 14.6 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。用1%瓊脂糖電泳檢測等體積的PCR產(chǎn)物，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相，圖片采用Gel-pro analyzer軟件進行分析。

1.3 總RNA的分離、cDNA的合成及UROS基因cDNA序列的擴增

用Trizol試劑(TaKaRa)提取總RNA。用NanoDrop 1000分光光度計檢測不同樣品的總RNA純度。配制1%的甲醛變性膠，通過電泳檢測RNA質量。以1 μg總RNA為模板進行RT-PCR。RT-PCR體系為20 μL，包括50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.3)、75 mmol·L-1KCl、3 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1DTT、1 μL oligo dT primer、50 μmol·L-1dNTPs、200 U M-MLV(Invitrogen)，最終用RNase Free ddH2O補充足總體積。RT-PCR條件：37 ℃ 60 min，80 ℃ 5 min。

將獲得的cDNA第一鏈用RNase Free ddH2O稀釋5倍，用于擴增UROS基因cDNA。cDNA擴增所用引物同1.2中基因組擴增所用引物。擴增體系20 μL:10×Ex Buffer 2.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DMSO 0.2 μL、ExTaq(Takara) 0.2 μL、cDNA 1 μL、dNTPs 1 μL、RNase Free ddH2O 14.1 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。用1%瓊脂糖電泳檢測等體積的PCR產(chǎn)物，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相，圖片采用Gel-pro analyzer軟件進行分析。

1.4 gDNA與cDNA的克隆測序

從凝膠上切割目標條帶，用凝膠回收試劑盒(TaKaRa)回收PCR產(chǎn)物，得到的回收產(chǎn)物用凝膠檢測，并連接在pMD18-T Vector(TaKaRa)上， 熱激轉化E.coilDH5α感受態(tài)，挑取陽性克隆送Invitrogen測序。凝膠回收和克隆測序嚴格按照操作手冊進行。

1.5 序列比對與在線分析

在GrainGenes(http://wheat.pw.usda.gov/GG3/)和IWGSC(http://www.wheatgenome.org/)中進行EST序列和基因組序列比對及染色體電子定位；在Ensembl plants(http://plants.ensembl.org/index.html)和PGSB(Plant Genome and Systems Biology, http://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/ plantsdb.jsp)中進行基因轉錄本預測等分析；用DNAMAN 6.0對已克隆測序的基因序列進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 返白系和矮變1號中UROS基因gDNA序列的擴增及測序結果

2007年曹 鳳等[49]從返白系中克隆到UROS基因cDNA序列(GenBank No. EF160077.1)，全長1 077 bp，編碼308個氨基酸，并預測1～63位氨基酸是葉綠體信號導肽，這是關于小麥UROS基因的最早報道。根據(jù)這個cDNA序列，本研究設計了引物UROS-F/UROS-R，包括部分5′-UTR和3′-UTR序列，從小麥品種矮變1號與返白系中擴增UROS基因的gDNA，結果如圖1所示，擴增條帶大約3.3 kb。

1：返白系；2：矮變1號；M:DL5000。

1:Albinism line; 2:Aibian No.1; M:DL5000.

圖1 返白系和矮變1號中UROS基因gDNA的擴增結果

Fig.1 PCR fragments ofUROSgene amplified from genomic DNA of Albinism line and Aibian 1

對PCR擴增產(chǎn)物進行回收和克隆，每個品種送10個克隆去測序，分別在返白系中測通8個克隆的全長(兩個克隆未測通)，得到6個不同長度的序列；在矮變1號中測通10個克隆，得到9個不同長度的序列(表1)。用DNAMAN 6.0軟件進行序列比對分析表明，序列間的相似性是99%。經(jīng)在線軟件和數(shù)據(jù)庫GrainGenes(http://wheat.pw.usda.gov/GG3/)、PGSB(Plant Genome and Systems Biology)比對分析，分別將這些序列定位在小麥的4BL和4DL染色體上，并將兩個基因位點分別命名為 UROS-4B 和 UROS-4D。

返白系4D基因位點gDNA序列平均長度為3 307 bp，矮變1號4D位點gDNA序列平均長度為3 305 bp；返白系4B位點僅得到一個gDNA序列，長度為3 325 bp，矮變1號4B位點gDNA平均長度為3 332 bp。除了PCR過程或測序造成的堿基替換或插入、缺失外，可以看出同一位點的同源基因存在品種間差異。

表1 在返白系與矮變1號中擴增得到的UROS基因的gDNA序列

Table 1UROSclones from gDNA of Albinism line and Aibian 1

品種CultivargDNA長度LengthofgDNA/bp克隆數(shù)No．ofclones染色體定位Chromosomelocation返白系332514BLAlbinismline330524DL330824DL330414DL331014DL331114DL矮變1號333014BLAibian1333114BL333214BL333714BL330024DL330214DL330614DL330914DL331414DL

長度相同的序列并不完全一致。下同。

Sequences with equal length are not absolutely the same.The same as below.

2.2 返白系和矮變1號中UROS基因cDNA序列的擴增及測序結果

利用與擴增UROS基因gDNA序列一致的引物，在返白系和矮變1號的第一鏈反轉錄產(chǎn)物中擴增得到UROS基因cDNA條帶，結果如圖2所示，擴增條帶約在1.2 kb。

對PCR產(chǎn)物進行回收和克隆，每個品種送20個克隆去測序，返白系成功得到20個克隆的全長，矮變1號得到19個克隆的全長(表2)。在返白系中， UROS-4B基因位點可以轉錄出兩個不同的轉錄本，本研究將它們命名 UROS-4B-a與 UROS-4B-b，后者較前者有一段54 bp序列的插入。由 UROS-4B-a 克隆測序得到1 231 bp與1 233 bp兩種不同長度的序列，序列間有99.5%的同源性，存在個別堿基的替換與缺失。該位點可編碼3種多肽，最長有299個氨基酸，其余兩種多肽序列較短，應屬于編碼區(qū)終止密碼子提前。 UROS-4D基因位點也轉錄出2個不同的轉錄本，分別命名為 UROS-4D-a與 UROS-4D-b，分別主要編碼含有308和299個氨基酸的多肽， UROS-4D-b位點還可編碼一個含有199個氨基酸的多肽，也是因終止密碼子提前造成。上述結果表明，返白系兩個UROS等位基因位點，可轉錄4個轉錄本，預測編碼6種多肽。矮變1號與返白系略有差異， UROS-4B位點僅轉錄出一個轉錄本 UROS-4B-a，可編碼含有299和314個氨基酸的兩種多肽序列，后者是由于堿基序列突變，終止密碼子后移。 UROS-4D位點與返白系類似，也有兩個轉錄本，主要編碼兩種多肽， UROS-4D-b還可編碼含有65、183及314個氨基酸的多肽。所以，矮變1號的兩個UROS基因位點，可轉錄3個轉錄本，預測編碼7種多肽。

1：返白系；2：矮變1號；M:DL2000。

1:Albinism line;2:Aibian 1;M:DL2000.

圖2 返白系和矮變1號中UROS基因cDNA的擴增結果

Fig.2 PCR fragments ofUROSgene amplified from cDNA of Albinism line and Aibian 1

根據(jù)不同轉錄本的克隆所占比例及其編碼的多肽序列，推測各轉錄本中， UROS-4B-a與 UROS-4D-a是標準剪接(canonical splicing)方式，而 UROS-4B-b與 UROS-4D-b是非標準剪接(non-canonical splicing)。在預測編碼的多肽中，本研究推測含有299、308、314個氨基酸的多肽具有UROS活性，其余多肽由于序列缺失，可能會喪失UROS活性或活性降低。

表2 在返白系與矮變1號中擴增得到的UROS基因的cDNA序列

Table 2 URPOS clones amplified from cDNA of Abian 1 and Albinism line

品種CultivarcDNA長度LengthofcDNA/bp克隆數(shù)No．ofclones染色體定位Chromosomelocation轉錄本命名Transcriptname預測最長ORF氨基酸殘基數(shù)TheaminoacidnumberofpredicatedORF多肽命名Polypeptidename返白系123114BLUROS?4B?a199F?4B?a1Albinismline123334BLUROS?4B?a299F?4B?a2128724BLUROS?4B?b192F?4B?b115654DLUROS?4D?a308F?4D?a122684DLUROS?4D?b299F?4D?b1122614DLUROS?4D?b199F?4D?b2矮變1號123214BLUROS?4B?a314A?4B?a1Aibian1123384BLUROS?4B?a299A?4B?a2115634DLUROS?4D?a308A?4D?a122514DLUROS?4D?b314A?4D?b1122514DLUROS?4D?b65A?4D?b2122644DLUROS?4D?b299A?4D?b3122614DLUROS?4D?b183A?4D?b4

2.3 中國春中UROS基因gDNA與cDNA的擴增及測序結果

在線數(shù)據(jù)庫GrainGenes、IWGSC、PGSB中的小麥基因組序列主要源自中國春，為了鑒定UROS基因在品種間是否有差異，以及上述試驗結果的可靠性，對中國春的gDNA與cDNA也進行了擴增、克隆和測序，方法同前。結果表明，中國春中 UROS-4B和 UROS-4D兩個基因位點基因組序列分別為3 339 bp和3 310 bp，與前兩個品種類似，但有差異。

在IWGSC中序列比對結果顯示，中國春4AS染色體上也有UROS基因同源序列，即4AS存在UROS基因位點，將其命名為 UROS-4A。序列分析結果表明，該基因位點的UROS基因編碼區(qū)上下游的序列與 UROS-4B、 UROS-4D差異較大，所以用前文設計的引物UROS-F/UROS-R是不能擴增出其gDNA和cDNA的，故重新設計引物UROS-4A-F/UROS-4A-R(UROS-4A-F:5′-GTTGCTCTGTGGTTCATCTAGTG-3′，UR OS-4A-R:5′-AGCCAAGAGGAAGAAGTTGT AGT-3′)。用引物UROS-4A-F/UROS-4A-R從中國春中克隆、測序得到 UROS-4A基因gDNA序列，全長3 379 bp，與網(wǎng)上的中國春序列比對有99.5%的同源性。本研究對中國春 UROS-4B和 UROS-4D位點的cDNA序列也進行了PCR擴增、克隆和測序，得到12個克隆的全長，結果如表3所示。

經(jīng)過序列分析表明，中國春的 UROS-4B位點有兩個轉錄本，其中一個與在返白系和矮變1號中的不同，將其命名為 UROS-4B-c； UROS-4D位點有三個轉錄本，一個在前兩個品種中沒有出現(xiàn)，將其命名為 UROS-4D-c。所以，在中國春的兩個UROS基因位點上共鑒定出5個轉錄本，預測編碼5種多肽序列。

2.4 小麥中UROS基因的可變剪接

對前文得到的 UROS-4B與 UROS-4D兩個基因位點的幾個轉錄本進行分析，初步認為在這兩個位點上的mRNA前體加工過程中，分別有1個標準剪接和2個非標準剪接方式，在不同品種間存在差異(表4、圖3)。

UROS-4B的3個轉錄本中， UROS-4B-a是標準剪接方式，共有9個外顯子(長度分別是250、88、68、119、96、56、86、135、541 bp)和8個內(nèi)含子區(qū)，5′-UTR是52 bp，3′-UTR是486 bp。 UROS-4B-b與 UROS-4B-a相比，在第6個外顯子區(qū)5′端有54 bp的內(nèi)含子區(qū)轉錄，可變剪接方式屬于可變的受體剪接位點(alternative acceptor introns，AA)，也稱為可變的3′端(alternative 3′ splicing)。 UROS-4B-c轉錄本中，第1和第2外顯子區(qū)中間的第一內(nèi)含子區(qū)(208 bp)轉錄，可變剪接方式屬于IR。

表3 中國春中擴增得到的UROS基因的cDNA

Table 3UROSclones amplified from cDNA of Chinese Spring

cDNA長度LengthofcDNA/bp克隆數(shù)No．ofclones染色體定位Chromosomelocation轉錄本命名Transcriptname預測最長ORF氨基酸殘基數(shù)TheaminoacidnumberofpredicatedORF多肽命名Polypeptidename123314BLUROS?4B?a282CS?4B?a1143414BLUROS?4B?c88CS?4B?c115654DLUROS?4D?a308CS?4D?a122644DLUROS?4D?b299CS?4D?b1133414DLUROS?4D?c118CS?4D?c

表4 本研究鑒定的小麥 UROS-4B與 UROS-4D基因位點的可變剪接

Table 4 Alternative splicings of UROS-4B and UROS-4D identified in this research

基因位點Genelocation轉錄本名稱Transcriptname剪接方式Splicingwayofpre?mRNAcDNA長度LengthofcDNA/bp出現(xiàn)的品種Cultivar預測ORF氨基酸殘基數(shù)PredictedaminoacidnumberUROS?4BUROS?4B?a標準剪接Canonicalsplicing1233A、F、CS299UROS?4B?b非標準剪接Non?canonicalsplicing1287F192UROS?4B?c非標準剪接Non?canonicalsplicing1434CS88UROS?4DUROS?4D?a標準剪接Canonicalsplicing1156A、F、CS308UROS?4D?b非標準剪接Non?canonicalsplicing1226A、F、CS299UROS?4D?c非標準剪接Non?canonicalsplicing1334CS138

A代表矮變1號；F代表返白系；CS代表中國春。

A indicated Aibian 1; F indicated Albinism line; CS indicated Chinese Spring.

虛線框表示內(nèi)含子區(qū)；實線框表示外顯子區(qū)；黑色實線框表示蛋白編碼區(qū)。

Dashed frames indicate introns; Solid frames indicate exons; Solid and dark frames indicate protein coding regions.

圖3 小麥 UROS-4B (A)與 UROS-4D (B)的可變剪接

Fig.3 Alternative splicings of UROS-4B (A) and UROS-4D (B) in wheat

UROS-4D基因位點的3個轉錄本中， UROS-4D-a是標準剪接方式，共有10個外顯子(長度分別是245、88、68、118、96、56、86、135、51、315 bp)和9個內(nèi)含子區(qū)，5′-UTR是47 bp，3′-UTR 是284 bp。與 UROS-4D-a相比， UROS-4D-b的第9個內(nèi)含子區(qū)70 bp序列轉錄，可變剪接方式屬于IR，而 UROS-4D-c除了具有IR，在第3外顯子3′端有一段108 bp的內(nèi)含子區(qū)轉錄，剪接方式還有可變的供體剪接位點(alternative donor introns,AD)，也稱為可變的5′端(alternative 5′ splicing)。

選取返白系和中國春不同轉錄本中的一個克隆，對其預測編碼的多肽序列進行比對，如圖4所示。標準剪接的兩個轉錄本 UROS-4B-a和 UROS-4D-a分別編碼299和308個氨基酸殘基的多肽?？勺兗艚拥霓D錄本中，只有 UROS-4D-b可以編碼較完整的多肽序列，其余剪接方式均造成肽段序列的缺失。 UROS-4B-a、 UROS-4D-a與 UROS-4D-b編碼的3個多肽有95.8%的氨基酸殘基序列一致，共有12個位點發(fā)生替換。在預測的信號肽區(qū)(前63位氨基酸)，序列相對保守，僅第7位返白系中是丙氨酸(A)，中國春中是纈氨酸(V)，雖然表現(xiàn)出品種間的差異，但都是疏水氨基酸。這些變異位點是否會造成UROS空間結構和活性的差異，值得進一步研究。

方框表示 UROS-4B-a、 UROS-4D-a與 UROS-4D-b三個轉錄本預測編碼多肽的12個變異位點。

Frames indicated twelve variant sites of polypeptides encoded by UROS-4B-a, UROS-4D-a and UROS-4D-b.

圖4 由UROS基因不同轉錄本預測的6種多肽氨基酸序列(用DNAMAN軟件預測)

Fig.4 Six predicted amino acid sequences ofUROSgene

3 討 論

PGSB網(wǎng)站可以在線預測基因的多種可變剪接方式。輸入本研究得到的基因組序列，PGSB預測出 UROS-4B位點有一種標準剪接、12種非標準剪接轉錄本，標準剪接與本研究測序得到的 UROS-4B-a一致，非標準剪接包括本研究鑒定的 UROS-4B-b和 UROS-4B-c兩種可變剪接方式。不同的是，預測 UROS-4B-c可以編碼含有335個氨基酸的多肽，而本研究測序得到的序列預測僅編碼含有88個氨基酸的多肽，推測是PCR擴增或測序引起序列變異造成的。PGSB網(wǎng)站預測 UROS-4D有一種標準剪接、5種非標準剪接轉錄本，標準剪接方式與 UROS-4D-a一致，非標準剪接包括 UROS-4D-b，但沒有預測出本研究測序得到的 UROS-4D-c。網(wǎng)站也預測了UROS-4A具有一種標準剪接和3種非標準剪接方式。本研究沒有檢測 UROS-4A位點的可變剪接，有待后續(xù)工作繼續(xù)完成。

在線預測UROS基因有多種可變剪接方式，而本研究只鑒定到了4個非標準剪接轉錄本，可能是有些轉錄本的表達量比較低，沒有被克隆到，也有可能在線預測的結果并非十分準確。在本研究所鑒定到的3種可變剪接方式，主要是以IR方式進行的，24個可變剪接克隆中，有22個屬于或包含IR剪接方式，這與已有的文獻報道是一致的[5,15-16,29,34]。我們發(fā)現(xiàn) UROS-4D-c可以同時有兩種可變剪接方式，如果這也是普遍存在的，就會顯著增加轉錄后加工的復雜性。

本文研究表明，在矮變1號、返白系與中國春三個小麥品種中UROS基因可變剪接的方式存在差異，矮變1號中的可變剪接最少，返白系在 UROS-4B和 UROS-4D位點兩個基因位點各有一個可變剪接轉錄本，中國春有3個可變剪接轉錄本。這種品種間差異的分子機理及其可能具有的功能值得進一步探討。

UROS在植物葉綠素合成代謝中具有重要的功能，已有的研究也表明在返白系與矮變1號中的UROS活性存在差異[46-47]，特別是在持續(xù)低溫條件下，返白系中的UROS受到抑制，是一個葉綠素合成受阻的位點，對于UROS與白化之間的關系也一直是我們所關注的。從基因組序列和啟動子序列(已經(jīng)克隆測序)的比對來看，兩個材料間差異不大，99%的序列一致。本文的研究結果啟示我們，是否由于UROS基因可變剪接方式的差異，引起UROS活性在矮變1號和返白系中不同，這些不同的可變剪接方式，是否受到發(fā)育階段、環(huán)境條件的調控，是否與返白系受到低溫誘導白化的現(xiàn)象有關，尚需要研究。

關于小麥基因的可變剪接已有較多報道[35-40]，本研究結果再次證實了小麥基因的可變剪接很可能是廣泛存在的，同一基因位點可以轉錄出多個不同的轉錄本，而且可以編碼出多個不同的多肽序列。加之，小麥是異源六倍體，存在多個等位基因位點，這些更增加了小麥基因表達調控的復雜性。我們有理由相信對小麥基因可變剪接機理的研究，及其對小麥發(fā)育和逆境響應的調控研究將會成為小麥分子遺傳學及小麥分子育種研究的新熱點[4]。

致謝:本試驗主要在西北農(nóng)林科技大學生命科學學院生物化學與分子生物學科研教學平臺完成，對段 敏研究員、范寧娟老師和魏蘭蘭老師提供的幫助和支持表示衷心的感謝！

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Alternative Splicing of Uroporphyrinogen Ⅲ Synthase Genes in Wheat

LANG Danying1,Lü Gengyin1,LIANG Guangwang1,LI Ruihang1,GUO Xiaoguang1,XU Hong1,2,GUO Aiguang1,2

(1.College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Alternative splicing (AS) is a key regulatory mechanism of gene expression,which is related to the development,physiology,metabolism,signal transduction and stress-response of plant. In this experiment,we cloned the Uroporphyrinogen Ⅲ synthase(UROS) genes from gDNA and cDNA of wheat and investigated the AS ofUROSgenes in wheat with bioinformatics techniques,using Albinism line,Aibian 1 and Chinese Spring as materials. TheUROSgDNA sequences are located on 4BL and 4DL chromosomes based on the wheat genome sequences online database,which are designated as UROS-4B and UROS-4D,respectively. About 50 differentUROScDNA sequences were cloned and sequenced from three cultivars. We found the AS inUROSpre-mRNA processing through the online predication and the comparison between cDNA and gDNA sequences,and there are one canonical and two non-canonical transcripts of each gene location. Intron retention is the primary alternative splicing type,as well as alternative donor introns and alternative receptor introns were found,and different varieties showed diverse splicing types. In addition,the predicated amino acid sequence of these transcripts were dissimilar,twelve variant amino acid sites were identified from six polypeptides encoded by six clones from different transcripts,respectively.

Wheat;Albinism line;Uroporphyrinogen Ⅲ synthase(UROS);Alternative splicing; Canonical and non-canonical splicing

徐 虹(E-mail:xuh73@163.com)

2016-05-21

2016-10-20

國家自然科學基金項目 (30971769,31371541)

E-mail：278436477@qq.com(郎丹瑩)；411427580@qq.com(呂庚寅，與第一作者同等貢獻)；545601366@qq.com(梁廣旺，與第一作者同等貢獻)

時間：2016-12-07

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)12-1553-10

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161207.1750.020.html