劉 艷，遲 銘，王寶祥，宋兆強，楊 波，盧白關，李 健，秦德榮，徐大勇

(江蘇徐淮地區(qū)連云港農(nóng)業(yè)科學研究所/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222006)

利用稻瘟病菌粗毒素篩選水稻抗病突變體

劉 艷，遲 銘，王寶祥，宋兆強，楊 波，盧白關，李 健，秦德榮，徐大勇*

(江蘇徐淮地區(qū)連云港農(nóng)業(yè)科學研究所/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222006)

從江蘇省稻瘟病不同優(yōu)勢小種菌株的液體培養(yǎng)液中提取稻瘟病菌粗毒素，以本地區(qū)較感病中粳稻新品系L119為材料，研究不同稀釋濃度粗毒素對水稻種子萌發(fā)、成熟胚愈傷組織誘導及分化的影響；在誘導和分化培養(yǎng)基中分別加入適宜的稻瘟病菌粗毒素進行脅迫培養(yǎng)，以獲得抗病性有所增強的變異植株。結(jié)果表明，種子萌發(fā)后胚芽的長度隨著粗毒素濃度的提高而降低，在濃度達到1 mL/10 mL時種子萌發(fā)完全受到抑制。種胚愈傷組織的生長隨著粗毒素濃度的增加受抑制程度逐漸增強，在濃度為25 %時無愈傷產(chǎn)生；愈傷組織在分化時對粗毒素較敏感，在粗毒素濃度為5 % 時分化成苗數(shù)急劇下降。對誘導、分化2個階段雙重粗毒素脅迫培養(yǎng)的組培再生植株進行田間抗病性鑒定，抗病性較對照品種有所提高，說明利用稻瘟病菌粗毒素對水稻成熟胚組織的脅迫培養(yǎng)可以誘導愈傷組織的抗病性變異。

水稻；稻瘟病菌；粗毒素；抗病性

稻瘟病(rice blast)是世界各稻區(qū)危害最重的一種水稻病害。每年都發(fā)病較重，流行性強，嚴重影響水稻產(chǎn)量，輕則減產(chǎn)，重則顆粒無收。很多農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻品種因為抗病性差而無法應用于水稻生產(chǎn)，成為水稻育種中的一個瓶頸。稻瘟病一般采用的化學防治成本高，易造成環(huán)境污染且無長期有效的殺菌劑；稻瘟病病原菌小種的遺傳多樣性和致病性的快速衍變致使抗性品種種植幾年后就喪失抗性[1]。長期實踐表明，水稻抗稻瘟病品種的選育和利用是避免或減輕該病最經(jīng)濟、最有效、最直接的途徑之一。在作物抗病育種的實踐中，傳統(tǒng)的育種手段和鑒定方法容易受到人為因素的影響和氣候條件的限制，周期長，工作量大[2]。隨著生物技術的發(fā)展，利用離體篩選技術作為獲得抗病、耐鹽、耐重金屬等突變體的重要手段已廣泛應用于多種作物。從細胞水平上進行突變體篩選，將生物技術和常規(guī)育種技術相結(jié)合培育新抗病品種，可從大量細胞中篩選到所需要的個體，且篩選群體大、效率高、時間短、操作簡單易行、不涉及安全性問題[3]。

利用病原菌液體培養(yǎng)產(chǎn)生的活性物質(zhì)(粗毒素)作為選擇壓力，離體篩選抗病突變體已成為抗病育種的有效途徑，在茄子抗黃萎病、蘇丹草抗葉斑病、小麥抗赤霉的突變育種研究中已有成功報道[3]。一些研究結(jié)果表明稻瘟病粗毒素在水稻稻瘟病害中的作用為致病性因素[4]，用粗毒素接種可產(chǎn)生與病原菌侵染相同或類似的病癥[5]，并且具有誘導抗病性活性[6]。相繼，高立宏等[7]、楊國濤等[8]、李楠等[2]研究了稻瘟病菌粗毒素對水稲愈傷組織的生長和分化的影響，并經(jīng)過層層篩選得到了分化苗；但分析分化苗的抗病性仍尚未報道。本研究分析了稻瘟菌粗毒素對水稻種胚誘導分化的影響，并對篩選出的分化苗進行了抗性分析。

1 材料與方法

1.1 稻瘟病菌與水稻品種

稻瘟病菌ZB/ZC/ZD/ZE/ZG1種群及混合孢子懸浮液：由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所劉永峰研究員饋贈；水稻品種為抗稻瘟病有待改良的中間品系L119。

1.2 稻瘟病菌粗毒素的制備與毒性鑒定

1.2.1 粗毒素的制備 將混合稻瘟病菌接種于平面擴繁培養(yǎng)基(酵母膏2 g，可溶性淀粉10 g，瓊脂15～20 g，定容1000 mL，pH 5.6～6.3)上擴繁，待長出菌絲體并產(chǎn)生孢子后轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基(KH2PO4，0.5 g，K2HPO4，0.5 g，MgSO40.5 g，葡萄糖20 g，酵母粉5 g，定溶至1000 mL)中。在25 ℃條件下振蕩培養(yǎng)20 d，用無菌紗布濾去菌，離心20 min (1000 r/min)，取上清液進行高溫滅菌20 min，所獲無菌濾液為稻瘟病菌粗毒素。

1.2.2 種子發(fā)芽抑制率試驗 取 30 粒萌發(fā)一致的種子，均勻地擺在含有粗毒素濃度分別為0.1, 0.5, 1 mL/10 mL 的培養(yǎng)皿中，每個處理重復 3 次，以蒸餾水作為對照。在(20±1)℃發(fā)芽箱中培育5 d 后取出。測定種子芽鞘長度，以芽鞘生長的抑制率來評價稻瘟病菌毒素的毒力。

芽抑制率(%)=(1 - 處理芽鞘平均長度/對照芽鞘平均長度)×100 %

1.3 水稻種胚的組織培養(yǎng)

1.3.1 水稻種子的消毒處理 選取籽粒飽滿的水稻種子，剝?nèi)シf殼后，切取含胚的半粒，在70%的酒精溶液中浸泡30 s，用無菌水沖洗后加入0.2%的升汞溶液消毒7～10 min，然后用無菌水沖洗3～4 次。

1.3.2 粗毒素對種胚愈傷誘導的影響 把經(jīng)常規(guī)消毒過的水稻種子接種于含有不同濃度(0，5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %)稻瘟病菌粗毒素的MS誘導培養(yǎng)基中，每個處理接種 4 瓶，每瓶 12 個，在26 ℃條件下暗培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計其誘導率。

1.4 粗毒素對愈傷組織分化成苗能力的影響

將分化能力旺盛的新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)入不同濃度(0，5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %)粗毒素的MS分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d 后統(tǒng)計分化成苗數(shù)。粗毒素篩選誘導和分化培養(yǎng)基見表1。

1.5 抗稻瘟病變異體的雙重脅迫篩選

根據(jù)粗毒素對水稻種胚愈傷誘導率的影響，選取粗毒素稀釋濃度為20 %的誘導培養(yǎng)基進行愈傷組織的誘導；將脅迫培養(yǎng)誘導出的新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)入到含有5 %粗毒素的分化培養(yǎng)基中，獲得再生幼苗。

1.6 組培苗移栽與植株抗病性鑒定

1.6.1 組培苗移栽 當組培苗長出 3 至 4 片葉和2至3條根時打開瓶蓋，在培養(yǎng)室煉苗2～3 d，移到幼苗培養(yǎng)營養(yǎng)土中培養(yǎng)10 d 后移到試驗田中。

1.6.2 植株抗病性鑒定 收獲的R1代種子種植后，在孕穗期用稻瘟病菌混合孢子懸浮液進行接種，每株注射1 mL，于水稻成熟后以原品種作對照按調(diào)查標準調(diào)查結(jié)果。穗頸瘟鑒定標準[9]如下，0 級：無病，免疫；1級：1/4 以下枝梗發(fā)病或穗頸有斑點，抗??；2 級：1/4 以上枝梗發(fā)病或主軸中部發(fā)病，或頸部有病，但對產(chǎn)量影響不大，中抗；3級：主軸中部或頸部發(fā)病,對產(chǎn)量有顯著影響，感??；4級：穗頸發(fā)病造成白穗，高感。

表1 愈傷組織誘導與分化篩選培養(yǎng)基

表2 不同粗毒素濃度誘導的愈傷分化成苗能力分析

表3 粗毒素脅迫培養(yǎng)水稻植株的稻瘟病抗性鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌粗毒素毒力的測定

種子在發(fā)芽箱中萌發(fā)5 d 后，對照組種子的胚芽平均長度為(2.13±0.13) cm，粗毒素濃度為1 %的種子胚芽鞘平均長度為(1.62±0.17) cm，粗毒素濃度為5 %的種子胚芽鞘平均長度為(0.78±0.15) cm，粗毒素濃度為10 %時種子萌發(fā)完全受到抑制。由此可見，隨著粗毒素濃度的增加，種子胚芽長度逐漸降低，說明本實驗制備的粗毒素具有一定的毒力。

2.2 粗毒素對水稻種胚愈傷組織誘導率的影響

培養(yǎng)基中加入粗毒素對幼胚愈傷誘導有很大的抑制作用, 從圖1可看出隨著毒素濃度的升高胚性愈傷的誘導率明顯下降, 當加入5 %濃度的毒素時, 愈傷的誘導率由對照的91 %降至76 %，下降了15 %；當毒素濃度達到20 %時, 則愈傷的誘導率降至10 %；當毒素濃度大于等于25 %時愈傷組織基本無法正常誘導。由此可見，粗毒素濃度在20 %～25 % 是產(chǎn)生誘導愈傷變異的臨界濃度。

2.3 粗毒素對水稻種胚愈傷組織分化成苗的影響

在未加粗毒素的誘導培養(yǎng)基得到的愈傷放入含有不同濃度粗毒素的分化培養(yǎng)基中進行分化成苗，經(jīng)一段時間的觀察發(fā)現(xiàn)，隨著分化培養(yǎng)基粗毒素濃度的增加, 愈傷出現(xiàn)褐化且沒有分化能力的幾率提高。從表2可看出，在接入同等愈傷數(shù)的分化培養(yǎng)基中，在毒素濃度為5 %時分化出苗能力就明顯受到抑制，且在5 %、10 %和15 % 3 個濃度間分化能力無明顯差異，在20 %時愈傷無分化成苗能力。

2.4 脅迫培養(yǎng)再生植株的獲得及其田間抗病性分析

以上述研究為基礎，水稻種胚經(jīng)粗毒素濃度分別為20 %和5 %的誘導、分化培養(yǎng)基脅迫培養(yǎng)后，獲得愈傷分化幼苗，經(jīng)過室內(nèi)外煉苗移栽入試驗田中獲得再生植株。脅迫培養(yǎng)獲得的水稻再生植株在孕穗期進行病菌孢子接種鑒定，對鑒定材料的穗莖瘟等級進行評價(表3)。從抗性鑒定結(jié)果可看出，在誘導、分化培養(yǎng)基中加入粗毒素脅迫培養(yǎng)得到的水稻植株，其整體抗病性較對照有所提高。

3 討論與結(jié)論

水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)中毀滅性病害，嚴重制約水稻的生產(chǎn)產(chǎn)量，傳統(tǒng)的抗稻瘟病育種研究主要是利用篩選的抗病品種作為親本與已有的品種進行雜交配組，從中選育抗病新品種，其周期長，工作量較大[10]；通過組織培養(yǎng)途徑對水稻抗瘟性進行細胞突變體篩選，將生物技術和常規(guī)育種技術相結(jié)合培育抗病新品種，其縮短了育種周期，是抗病育種的一種新方法。

圖1 種胚在不同粗毒素濃度誘導培養(yǎng)基中的誘導率Fig.1 Induction rate of seed embryo callus in MS media under different concentrations of toxin

據(jù)報道，粗毒素與致病菌株之間存在相應的對應關系[5]，粗毒素對水稻的影響與病原菌相似[11]，并且對水稻植株生長特性、細胞結(jié)構(gòu)、相關酶活性以及光系統(tǒng)Ⅱ產(chǎn)生較大影響[11-13]；潘哲超等用低濃度稻瘟菌毒素作為激發(fā)子來提高水稻抗性的研究，表明一定濃度的毒素能夠作為激發(fā)子來誘導水稻的抗性[14]；張君等研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌粗毒素處理水稻幼苗根部后相關病害防衛(wèi)基因的表達也有所增強[21]。由此，本研究通過分析稻瘟菌粗毒素對水稻種胚愈傷的誘導與分化的影響作用，結(jié)果表明粗毒素對愈傷組織的生長抑制作用隨濃度的提高呈梯度增強，在20 %～25 %出現(xiàn)了生長轉(zhuǎn)折點，毒素濃度在20 %時種胚的出愈率下降到10 %左右，在25 %時種胚無愈傷誘導出；在愈傷組織分化成苗階段，粗毒素濃度在5 %時對出苗率就有明顯抑制，并且在5 %、10 %和15 %之間出苗數(shù)無明顯差別，在毒素濃度達到20 %時無分化苗出現(xiàn)。據(jù)粗毒素對該品系種胚的抑制影響作用，確定了有利于突變體產(chǎn)生的組織培養(yǎng)誘導和分化培養(yǎng)基中粗毒素濃度脅迫的最佳濃度，進行了抗病突變體的篩選，最終得到5株抗病性比對照品種較高的突變體再生植株。但不同的水稻品種對稻瘟病的抗病性存在差異，在粗毒素作用下進行脅迫培養(yǎng)時也存在著差異性[7-8]，因此在進行抗稻瘟病篩選時，特別是在誘導階段粗毒素臨界濃度的選擇應和品種的抗性相對應。針對本實驗篩選出的抗病變異株，其抗病性產(chǎn)生的抗性機理有待進一步深入研究，為稻瘟菌毒素誘導產(chǎn)生抗性突變體提供研究基礎。

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(責任編輯 陳 虹)

Anti-Blast Mutant Screened from Tissue Cultured with Crude Toxin fromPyriculariaoryzae

LIU Yan, CHI Ming, WANG Bao-xiang, SONG Zhao-qiang, YANG Bo, LU Bai-guan, LI Jian, QIN De-rong, XU Da-yong*

(Lianyungang Agriculture Science Institute/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Corp Production, Jiangsu Lianyungang 222006, China)

The crude toxin was extracted from liquid of different Jiangsu province’s physiological races of rice blast fungus, the local rice variety which was sensitive to rice blast was chosen as tested material. The effects of crude toxin on its seed germination, mature embryo callus’s growth and differentiation were studied. Under appropriate concentrations of crude toxin, the blast-resistant mutant during the whole time of embryo callus’s growth was screen out. The results showed that the seeds’ germination was inhibited strongly with the increasing of the toxin concentration, and the germination was totally inhibited when the concentration was 1 mL/10mL. The growth of embryo callus was inhibited gradually with the increasing of toxin’s concentration, and the callus’s growth was completely stopped when the concentration was 25 %. The differentiation of embryo callus was sensitive to toxin, and the differentiation rate of seedling was dropped significantly when the concentration was 5 %. The rice seedlings from the mature embryo cultured with crude toxin were injected by rice blast fungus in the field, their disease resistance was improved compared with CK. This study suggested that the method of using the media including toxin to induct mutant was a effective protocol to improve the rice resistance of rice-blast.

Rice;Pyriculariaoryzae; Crude toxin; Rice blast resistance

1001-4829(2016)09-2016-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.002

2015-09-24

連云港市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項目“中粳水稻品種抗稻瘟病資源遺傳分析及種質(zhì)創(chuàng)新”(CN1502); 連云港市科技攻關項目“利用分子標記聚合育種技術改良水稻品種抗病性”(CN1415)；江蘇省科技支撐計劃“優(yōu)質(zhì)多抗超高產(chǎn)中粳稻新品種選育”(BE2014314)；國家水稻產(chǎn)業(yè)體系“推進粳稻生產(chǎn)關鍵技術研究與示范”(CARS-01-01A)

劉 艷(1982-)，女，山西高平人，博士，主要研究方向：水稻育種，E-mail:ly516.bester@163.com，Tel：15996112982，*為通訊作者：徐大勇，E-mail:xudayong3030@sina. com。

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