李程鵬, 孫一丁, 劉 輝, 曾千春, 王炎炎, 馬繼瓊,楊 奕, 許明輝 *

(1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室， 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室,云南 昆明 650223；3.中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

類重金屬ATP酶基因序列遺傳變異分析

李程鵬1, 孫一丁2, 劉 輝3, 曾千春1, 王炎炎2, 馬繼瓊2,楊 奕2, 許明輝2 *

(1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室， 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室,云南 昆明 650223；3.中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

OsHMA2 是水稻根和地上部一個主要的Zn和Cd的轉(zhuǎn)運蛋白，在水稻基因組OsHMA2位點存在OsHMA2類似基因OsHMA2-like，編碼蛋白包含水稻P1B型ATP酶重金屬轉(zhuǎn)運蛋白的功能域。對來自世界不同稻區(qū)的27份亞洲栽培稻和8份野生稻基因OsHMA2-like編碼區(qū)序列進行了測序分析，以了解水稻OsHMA2-like序列的多樣性,為發(fā)掘基因資源提供信息。OsHMA2-like核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,在 471 bp 的編碼序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)了6個變異位點；Tajima'sD檢驗表明均不顯著，說明這些位點屬中性進化狀態(tài)；6個變異位點中，第15、78、132、214、417位點堿基不引起氨基酸的變異，而第457位的變異使得5個供試材料(1個O.nivara，4個ARO品種和1個粳稻品種)由于提前形成終止子在C末端少3個氨基酸，ARO類品種在此位點上與TRJ、IND、TEJ存在顯著差異，這暗示ARO類品種可能由O.nivara演化而來。

亞洲栽培稻；野生稻；OsHMA2-like基因；進化

鋅是生物生長和發(fā)育的一種重要的金屬營養(yǎng)元素。300多個酶的輔因子的形成都需要鋅離子的參與[1]而且它在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中起著非常關(guān)鍵的作用[2-3]。缺鋅已對人類的健康造成很大的威脅，據(jù)官方統(tǒng)計，超過全世界25 %的人口受到了缺鋅的影響[4]。在植物中，鋅在許多生化過程中扮演著非常重要的角色。鋅缺乏時植物的生長會受到嚴重影響，然而，過量鋅又會在植物體內(nèi)產(chǎn)生毒性物質(zhì)。因此在植物中,鋅的吸收和運輸必須受到嚴格的控制和調(diào)控。

鎘是一種有毒重金屬[5]。鎘作為第一類致癌物質(zhì)通過食物鏈在人體內(nèi)不斷的積累會導致嚴重的健康問題[6]。水稻是亞洲人的主要糧食作物，來自水稻谷粒中鎘的含量越來越受到人們的密切關(guān)注[7-11]。

在眾多的金屬轉(zhuǎn)運蛋白家族中，P1B型ATP酶重金屬轉(zhuǎn)運蛋白(HMAs)，廣泛存在于低等和高等植物中，參與植物生長發(fā)育過程中所必需的微量金屬營養(yǎng)元素的吸收、運輸與積累[12-13]。根據(jù)它們轉(zhuǎn)運底物的不同，HMAs被分為2個亞類，即銅/銀組和鋅/鈷/ 鎘 /鉛組[14]。

水稻中共有9個HMA基因。OsHMA1-3屬于Zn/Co/Cd/Pb類,而OsHMA4-9屬于Cu/Ag類。OsHMA3在水稻的根細胞中將Cd轉(zhuǎn)運到液泡中,行使Cd解毒功能[15-16]。OsHMA9屬于Cu/Ag子類，定位在細胞質(zhì)膜上，參與重金屬從細胞質(zhì)向細胞外的運輸[17]。OsHMA2具有鋅/鎘 /鉛底物特異性，它不僅參與Zn+的運輸，也參與Cd2+的解毒過程[18-19]。OsHMA2定位在細胞質(zhì)膜上，能將Zn+和Cd2+排出細胞外。OsHMA2主要在水稻根部的維管束中表達，當鋅缺乏時會降低OsHMA2在根部的表達量[20]。這些結(jié)果表明，OsHMA2在鋅和鎘卸載到木質(zhì)部的過程中起作用，并參與這些金屬從地下部到地上部的運輸。對花序形成過程中及種子成熟階段的鋅運輸也起到作用[21]。

在水稻基因組OsHMA2位點上，存在P1B型ATP酶重金屬轉(zhuǎn)運蛋白(HMAs)類似基因(OsHMA2-like),OsHMA2-like編碼P1B型ATP酶重金屬轉(zhuǎn)運蛋白(HMAs)，蛋白序列比重金屬ATP酶2(OsHMA2)短得多，但也包含由30多個氨基酸組成的HMA結(jié)構(gòu)域和位于N-端和C-端金屬結(jié)合位點MBD。OsHMA2-like基因包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，編碼區(qū)序列長度為471 bp(http://www.ricedata.cn/gene/list/1948.htm)。

目前對OsHMA2-like的研究很少，文章對來自世界不同稻區(qū)的27份亞洲栽培稻和8份野生稻基因OsHMA2-like編碼區(qū)序列進行了分析，以了解水稻自然群體中OsHMA2-like序列的多態(tài)性,為加深OsHMA2-like的進化、調(diào)節(jié)鎘和鋅離子運輸機制的研究和找尋水稻群體中對Cd2+高效解毒的OsHMA2-like等位基因提供信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料包括27份亞洲栽培稻品種和8份野生稻，來自亞洲稻作主要分布國家，具有一定的多樣性(表1), 27份栽培稻中包含熱帶粳稻(TRJ )9個， 溫帶粳稻(TEJ)6個，香稻(ARO)4個，秈稻(IND)8個；8份野生稻包括3份O.nivara，5份O.rufipogon。Xu[22]等人對這些材料已進行了重測序，以日本晴為測序?qū)φ掌贩N。

1.2 OsHMA2-like基因同源序列的獲取及分析

OsHMA2-like基因位于第6染色體 30,354,951——30,357,907,35份材料同源序列用軟件Editplus v3.40,序列用軟件DNASTAR V7.10進行比對。根據(jù)Neighbor-joining法，用軟件MEGA V5.10構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[23]。

1.3 核苷酸多態(tài)性分析

根據(jù)Rozas的方法，用軟件DnaSP v5.10 .01來分析核苷酸多態(tài)性[24]，并進行S(多態(tài)性位點數(shù)量)，p(核酸多態(tài)性)，θ(Watson核酸位點多樣性)，Tajima’sD(中性檢測統(tǒng)計學數(shù)據(jù))，P(當數(shù)據(jù)P<0.05，表示Tajima’sD數(shù)據(jù)顯著)的計算。

表1 供試材料

續(xù)表1 Continued table 1

標記Label材料名稱Nameofaccessions編號Plantidentification材料類型Status材料來源Origin材料類群VarietygroupIRGC55471＿TEJChodongjiIRGC55471LandraceSouthKoreaTEJIRGC8191＿TEJMansakuIRGC8191LandraceJapanTEJIRGC11010＿TRJMaintmolotsyIRGC11010EliteMadagascarTRJIRGC328＿TRJAZUCENAIRGC328LandracePhilippinesTRJIRGC38698＿TRJNPE844IRGC38698LandracePakistanTRJIRGC43675＿TRJTrembeseIRGC43675LandraceIndonesia(EastJava)TRJIRGC43397＿TRJGotakGatikIRGC43397LandraceIndonesia(C．Java)TRJIRGC50448＿TRJCanellaDeFerroIRGC50448EliteBrazilTRJIRGC66756＿TRJLemontIRGC66756EliteTX，USATRJIRGC8244＿TRJDavaoIRGC8244LandracePhilippinesTRJIRGC106105?nivaraMV89?80IRGC106105wildriceMedinipur，IndianivaraP46＿rufipogonP46P46wildriceHainan，ChinarufipogonYJ＿rufipogonYuan3?9Yuan3?9wildriceYunnan，ChinarufipogonIRGC9148＿INDTD2IRGC9148EliteThailandINDIRGC105958＿rufipogonPADIPADIANIRGC105958wildriceKromatWatu，IndonesiarufipogonIRGC105960＿rufipogonDALDHANIRGC105960wildriceChakaria，BangladeshrufipogonVOC4＿rufipogonVOC4VOC4wildriceNepalrufipogonIRGC89215?nivaraCA97?053IRGC89215wildriceSopoirTep，CambodianivaraIRGC32399＿TEJPhudugeyIRGC32399LandraceBhutanTEJIRGC12793＿AROKitrana508IRGC12793EliteMadagascarAROIRGC43325＿TRJAriasIRGC43325LandraceIndonesia(WestJava)TRJIRGC9060＿AROJC101IRGC9060EliteIndiaAROIRGC9062＿AROJC111IRGC9062EliteIndiaARORA4952＿AROFiroozRA4952LandraceIranAROIRGC106154?nivaraL89?12IRGC106154wildriceVientiane，Laosnivara

2 結(jié)果與分析

2.1 OsHMA2-like編碼區(qū)序列分析

在所有研究材料中, ATP酶重金屬轉(zhuǎn)運蛋白OsHMA2-like基因的編碼區(qū)長度為471 bp。該范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)6個變異位點，分別位于15,78,132,214,417,457位(表2)。 位點214處的突變頻率最高，為31.4 %，其余位點的突變頻率在15 %～25 %。位點78,132,214處的堿基替換在栽培稻和野生稻中均有發(fā)生，而位點15,417,457處的變異只發(fā)生在栽培稻和nivara中。

35個供試材料中,分別有1～6個位點發(fā)生堿基替換(表3)。位點15處的變異發(fā)生在ARO，TEJ，和nivara中。位點78處的變異發(fā)生在ARO，TEJ和2種野生稻中。位點132處的變異在ARO，IND和2種野生稻中發(fā)現(xiàn)。在粳稻中位點15,78，417,457處的變異被發(fā)現(xiàn)，而秈稻只在位點132，214處發(fā)生變異。TEJ和 TRJ發(fā)生變異的位點存在明顯差異。

表2 OsHMA2-like基因編碼區(qū)序列的變異

表3 OsHMA2-like基因的不同單倍型

注：“-”代表在此位點上與日本晴相同。

Notes: ‘-’ represented that this locus was the same with Nipponbare.

2.2 單倍型分析

通過序列比對，OsHMA2-like基因的編碼區(qū)存在10種不同的單倍型(H)(表4)，其中日本晴屬于單倍型H1。從表4可以看出, 大多數(shù)的 TEJ(83.3 %) ，TRJ(88.9 %)和IND(87.5 %)歸為單倍型H1，同時有1個nivara和2個rufipogon也歸入該單倍型；H1～H9單倍型僅各出現(xiàn)1個材料，其中H2為IND 所特有，H3，H4，H5為O.rufipogon特有，H6為nivara特有，H7為TEJ特有，H8為ARO特有，H9為TRJ特有；H10為ARO和nivara共有。

2.3 Tajima's D檢驗

用DNASP軟件對OsHMA2-like等位基因編碼區(qū)的核苷酸多態(tài)性分析表明，在6個變異位點中，栽培稻和野生稻都發(fā)生變異(表5)，野生稻中的p和T值均高于栽培稻，在栽培稻中，溫帶粳稻 TEJ的p和T值較高，而TRJ， IND和 ARO中的p和T值較低，Tajima'sD檢驗表明，Tajima'sD值均不顯著。

表4 不同單倍型在各水稻類群中的分布

表5 OsHMA2-like 等位基因的核苷酸多態(tài)性分析

2.4 氨基酸變異分析

對OsHMA2-like10個單倍型所編碼的氨基酸序列進行分析表明，其中有 1 個多態(tài)性位點使得供試材料中的1個Oryza.nivara，4個ARO和1TRJ品種由于提前形成終止子在C末端少3個氨基酸,其余的氨基酸序列完全相同(圖1)。

2.5 進化樹構(gòu)建

為檢測35個材料之間的親緣關(guān)系，根據(jù)它們的核苷酸序列建立進化樹(圖2)。35份材料分為二大枝，其中所有的野生稻O.rufipogon、TRJ、IND、大部分TEJ歸為I枝，所有的ARO和2個nivara、1個TEJ歸為II枝?？梢夾RO類品種在此位點上與TRJ、IND、TEJ存在顯著差異。

3 討 論

水稻基因組測序分析顯示, 分布于整個基因組單核苷酸多態(tài)性(SNPs)非常豐富[25-28]。該研究中，在OsHMA2-like編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)6個變異位點，分別位于15,78,132,214,417,457位，OsHMA2-like基因的編碼區(qū)存在10種不同的單倍型(H)，秈稻和粳稻存在共享基因型，無明顯分化，而 ARO與秈稻和粳稻在此位點上存在明顯的分化。

圖1 OsHMA2-like等位基因的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of OsHMA2-like alleles

圖2 Neighbor-joining 法構(gòu)建水稻過氧化物酶基因OsHMA2-like系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with the nucleotide sequences of OsHMA2-like genes from 40 rice accessions by Neighbor-joining

OsHMA2-like作為未來作物育種中一個重要的靶基因，特定位點在基因發(fā)揮功能中起著非常重要的作用,在自然界可能存在能對Cd2+高效解毒的OsHMA2-like等位基因,因此鑒定自然群體中該基因的等位變異, 有可能篩選到相應的OsHMA2-like等位基因。在本研究中，發(fā)現(xiàn)一種ARO和O.nivara共有的OsHMA2-like新的單倍型，由于提前形成終止子在編碼蛋白C末端少3個氨基酸，這暗示ARO可能由O.nivara演化而來。

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(責任編輯 王家銀)

Genetic Variation Analysis of Heavy Metal ATPase-Like Gene in Rice

LI Cheng-peng1, SUN Yi-ding2, LIU Hui3, ZENG Qian-chun1,WANG Yan-yan2, MA Ji-qiong2, YANG Yi2, XU Ming-hui2 *

(1.College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650205, China；2.Key Laboratory of Biotechnology Research of Yunnan Province, Key Lab of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture, Institute of Biotechnology and Genetic Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650223, China；3. Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Yunnan Kunming 650223, China)

OsHMA2 was a major zinc and Cd transporter in the root and aboveground of rice,OsHMA2 loci in the rice genome existed a similar gene,OsHMA2-like, containing the functional domain of heavy metal transport protein. The variations ofOsHMA2-likein 35 rice accessions from different areas of the world including 27 ofOryzasativaand 8 accessions of wild rice relatives were analyzed using resequenced ORF sequences in order to understand the riceOsHMA2-likesequence diversity and provide information for genetic resources. The nucleotide sequence and amino acid sequence analysis ofOsHMA2-likeshowed that there were six mutation loci in 471 bp coding sequence. The Tajima'sDvalues of the total group and all subgroups suggested that theOsHMA2-likealleles belonged to neutral selection in rice. Interestingly the 15th, 78th, 132th, 214th, 132th mutation didn’t cause the variation of amino acids, and the 457th mutation led to a elimination of three amino acids in 5 accessions, ARO existed significant difference on these sites compared to TRJ, IND and TEJ, which suggested that ARO was bred byO.nivara.

Oryzasativa; Wild rice; GeneOsHMA2-like; Evolution

1001-4829(2016)09-2009-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.001

2014-04-15

國家自然科學基金“抗稻瘟病基因Pid2進化與?；剐苑肿訖C制研究”(31360331)；科技部基礎(chǔ)性工作專項“貴州農(nóng)業(yè)生物資源調(diào)查”(2012FY110200)；云南省自然科學基金“云南地方稻種Pi-d2同源基因序列及專化抗性分子機制研究”(2013FZ146)

李程鵬(1987-)，男，碩士，研究方向為生化與分子生物學，E-mail：xuminghuiynnky@163.com，*為通訊作者，E-mail: xuminhui@sohu.com。

S511

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