梅 琳，徐慶華，蒼 晶，盧秋巍，于 晶，張 達，馮明芳，張舒馳，梁桂花，張 超

(東北農業(yè)大學生命科學學院植物生理與分子生物學研究室，黑龍江哈爾濱 150030)

冬小麥 miR398前體的克隆及其在低溫條件下對靶基因 CSD1表達的調控

梅 琳，徐慶華，蒼 晶，盧秋巍，于 晶，張 達，馮明芳，張舒馳，梁桂花，張 超

(東北農業(yè)大學生命科學學院植物生理與分子生物學研究室，黑龍江哈爾濱 150030)

miR398是受逆境脅迫負調控的miRNA，其靶基因CSD編碼超氧化物歧化酶(SOD)，使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。為進一步了解低溫脅迫下 miR398的調控機制，從東農冬麥1號中克隆小麥 miR398前體，構建過表達載體并轉化擬南芥，用Real-time PCR檢測T0代植株中小麥 miR398及其靶基因 CSD1在低溫脅迫下的表達量。結果表明，隨著低溫脅迫時間的延長， miR398表達下調、 CSD1基因表達上調，認為小麥 miR398能響應低溫脅迫、負調控 CSD1基因表達，間接提高了擬南芥的抗寒性。

冬小麥； miR398； CSD1；抗寒性；表達調控

MicroRNAs(miRNAs)是一種重要的調控因子，在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[1]。在低溫脅迫下，miRNA不僅調控其靶基因，部分miRNA也直接參與了植物逆境脅迫應答[2-3]。miRNA的調控機制取決于其與靶基因的堿基互補配對程度，如果miRNA與靶基因完全匹配，則該復合體降解mRNA；若兩者序列部分匹配，則通過抑制靶基因的翻譯來沉默特定基因[4]。

miR398參與植物逆境應答[5]，并且在水稻和擬南芥中高度保守，暗示其可能在多種生物脅迫下都發(fā)揮調控作用[6]。已有研究表明， miR398是通過對其靶基因CSD(編碼Cu-Zn型超氧化物歧化酶)的剪切實現(xiàn)負向調控[7]。 miR398的靶基因CSD包括兩種類型，分別為細胞質 CSD1和葉綠體 CSD2[6]。已有相關研究報道， CSD1參與氧化應激、銅離子、鹽脅迫以及細菌感染等脅迫過程的應答，能夠一定程度消除脅迫中產(chǎn)生的活性氧[8]。過表達抗 miR398的 CSD2轉基因擬南芥植株中， CSD2的高表達會比正常情況下 CSD2的表達產(chǎn)生更多的 CSD2 mRNA，進而提高植株對高光強、重金屬等逆境的抵抗力[9]。目前對 miR398與其靶基因的研究主要集中在擬南芥、煙草等植物中，而在冬小麥中鮮有報道。

東北農業(yè)大學自主培育的東農冬麥1號(Dongnongdongmai 1，簡寫為DN1)是首例能在黑龍江省高寒地區(qū)越冬(返青率85%以上)的強抗寒(可耐-30 ℃低溫)栽培品種。本研究室應用Hiseq高通量技術構建了DN1在5 ℃、-10 ℃和-25 ℃低溫脅迫下的miRNA庫，對其分析表明 miR398在5 ℃時表達量微弱，在-10 ℃時表達量升高，在-25 ℃時表達量最高[10]，但對低溫脅迫調控 miR398表達的分子機制尚不清楚[11]。為了明確 miR398與低溫脅迫的關系，需要利用生物信息學和生物學試驗等方法尋找miRNA的靶基因[12]，并探索低溫下 miR398與靶基因的作用關系。植物中miRNA與靶基因之間幾乎是完全互補配對[4]，利用生物信息學篩選靶基因不僅可獲得大量候選靶基因，而且準確率較高[13]。鑒于此，本研究以DN1為材料，克隆小麥 miR398前體( pre-tae-miR398)，在利用生物信息學方法篩選小麥 miR398靶基因的基礎上，進一步轉化擬南芥，檢測轉基因擬南芥植株中 miR398及其靶基因在低溫脅迫下的表達調控，初步明確DN1中 miR398與低溫脅迫的關系，以期為揭示miRNA調控DN1強抗寒性的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

強抗寒冬小麥品種DN1(東農冬麥1號)由東北農業(yè)大學小麥育種實驗室惠贈。擬南芥(ArabidopsisthalianaL.) Col(Columbia)生態(tài)型由東北農業(yè)大學植物生理與分子實驗室提供。引物合成和測序均由哈爾濱博仕生物技術有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 冬小麥總DNA的提取

采用CTAB法提取DN1的分蘗節(jié)總DNA，用RNase I處理純化DNA。

1.2.2 pre-tae-miR398的PCR擴增及過表達載體的構建

根據(jù)實驗室前期獲得的冬小麥 miR398的前體序列[10]，應用Primer Premier 5.0設計引物P1/P2(表1)。以1.2.1中提取的總DNA為模板，以P1/P2為引物進行PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)，所擴增條帶特異性強，且與預期目的條帶大小一致，因此，在P1和P2引物的5′端分別加上含PacI酶切位點的特定序列ggcttaaU，重新合成引物P3/P4(表1)。以1.2.1中提取的總DNA為模板，以P3/P4為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用USERTM酶消化。參照Nour-Eldin等的方法[14]，采用Nt.BbvCI和PacI雙酶切質粒pCAMBIA3300(攜帶CaMV35s啟動子)，酶切后的質粒也用USERTM酶消化。然后，將USERTM酶消化后的PCR擴增產(chǎn)物和質粒經(jīng)回收、純化后進行連接，獲得過表達載體pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398。最后，將過表達載體轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌株，提取質粒后測序鑒定。

PCR擴增體系為20 μL,包括10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA模板0.8 μL、引物P3和P4各0.7 μL、1 U·μL-1Taq酶0.1 μL、ddH2O 14.1 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

酶切體系為100 μL，包括NEB4 10 μL、10×BSA 10 μL、pCAMBIA3300載體20 μL、ddH2O 58 μL、PacI和Nt.BbvCI各1 μL。酶切反應條件：PacI加入后37 ℃反應1 h，再加入Nt.BbvCI于37 ℃反應1 h。酶切反應結束后，將產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 農桿菌侵入法轉化擬南芥及其低溫脅迫培養(yǎng)

將測序鑒定正確的pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398質粒轉化農桿菌EHA105，挑取陽性克隆，菌落PCR鑒定。農桿菌侵染擬南芥參照邱 礽等[16]的方法。野生型與轉化后的擬南芥置于4 ℃培養(yǎng)箱中，并分別于0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 后取葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Real-time PCR

按照Trizol說明書中的方法提取擬南芥葉片的總RNA (寶生物工程有限公司，大連)。反轉錄總RNA (包含小RNA)用miRNA cDNA synthesis kit及Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(寶生物工程有限公司，大連)試劑盒，并按照操作說明進行。Real-time PCR利用STBR試劑盒(寶生物工程有限公司，大連)。miRNA的內參基因為 U6，靶基因的內參基因為Actin，對反轉錄產(chǎn)物cDNA樣品進行歸一化，用2-△△Ct法分析。每個樣品做3個生物重復，每個反應各設一個空白對照(cDNA模板空白)。各內參基因引物見表1。

表1 本研究所用引物序列

Table 1 Primer sequences used in this study

引物名稱 Primername引物序列(5'-3') Primersequence(5'-3')P1AGACGCGAGGAAATTCCTGP2GCGAGGAGGCTCCAGCP3GGCTTAAUAGACGCGAGGAAATTCCTGP4GGCTTAAUGCGAGGAGGCTCCAGCP5ACACTCCAGCTGGGTGTGTTCTCAGGTCGP6CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGGGGGCG反向通用引物ReverseuniversalprimerTGGTGTCGTGGAGTCGU6-FATTGGAACGATACAGAGAAGATTU6-RGGAACGCTTCACGAATTTGP7TTCCGCCCAAGTCCGGATACGCP8GGTGGTCGGGCCATCTCCCTCGTGGGTActin-FCCTTAGTACCTTCCAACAGATGTActin-RCCAGACAACTCGCAACTTAGA

1.2.5 生物信息學分析

利用miRNA在線數(shù)據(jù)庫miRBase (http://www.mirbase.org/search.shtml)篩選小麥miRNA。利用RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)分析miRNA的二級結構。利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNA-Target/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和Targetscan (http://genes.mit.edu/mirscan/)預測靶基因。

2 結果與分析

2.1 pre-tae-miR398的克隆及 miR398的靶基因預測結果

經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，實驗室前期建立的DN1小RNA數(shù)據(jù)庫(未發(fā)表)中 miR398的前體序列與miRNA在線數(shù)據(jù)庫miRBase登錄的序列(MIPF0000107)一致。利用RNAfold預測 miR398的前體序列二級結構，結果表明，其能夠形成miRNA特有的頸環(huán)結構(圖1)。

利用引物P3/P4對DN1的總DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約120 bp的單一條帶，且與預期目的片段大小一致(圖2)。將經(jīng)過酶切等處理的目的片段和pCAMBIA3300載體進行連接，轉化到大腸桿菌DH5α中，并從中隨機挑取8個陽性克隆提取質粒，送博仕生物測序。測序結果與小RNA數(shù)據(jù)庫中 pre-tae-miR398序列的堿基序列同源性為100%，即獲得了pCAMBIA330035sU- pre-tae-miR398重組質粒。通過三個靶基因預測軟件分析對比，參數(shù)均設為默認值，篩選出匹配度相對較高的靶基因，并通過NCBI檢索確定 miR398的靶基因為 CSD1(DR735568)。

圖1 DN1中 miR398前體的二級結構

M:DL 20 bp DNA marker; 1: pre-tae-miR398的擴增產(chǎn)物。

M:DL 20 bp DNA marker;1:Amplified products of wheat precursor gene ofmiR398.

圖2 DN1中 pre-tae-miR398的PCR擴增結果

Fig.2 PCR product of wheat precursor gene ofmiR398 of DN1

2.2 過表達載體轉化擬南芥及 miR398與其靶基因引物的驗證結果

提取的pCAMBIA330035sU-pre-tae-miR398轉入農桿菌，隨機挑取單菌落進行PCR，引物為P1/P2(表1)，用4%的瓊脂糖凝膠電泳得到陽性克隆產(chǎn)物(圖3)，并選取長勢一致的擬南芥進行侵染。根據(jù)miRNA特有的頸環(huán)結構與其靶基因序列分別設計引物P5/P6和P7/P8(表1)，驗證引物的特異性。以DN1的cDNA為模板，4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在80 bp處有一清晰的條帶，與預測的 miR398頸環(huán)法反轉錄擴增大小一致(圖4A)，其靶基因也與預測的125 bp大小一致(圖4B)。

M:DL 20 bp DNA marker; 1～3:菌落PCR擴增產(chǎn)物; CK:陰性對照。

M:DL 20 bp DNA marker; 1～3:Colony PCR amplification products; CK:Negative control.

圖3 重組質粒導入農桿菌后的菌落PCR檢測結果

Fig.3 PCR analysis of recombinant plasmid

M:DL 20 bp DNA marker; 1: miR398引物的驗證; 2:靶基因引物的驗證。

M:DL 20 bp DNA marker; 1:Validation of miR398 primers; 2:Validation of target gene primers.

圖4 miR398(A)及其靶基因(B)引物的特異性檢測結果

Fig.4 Specific detection of miR398 (A) and its target gene (B) primers

2.3 低溫脅迫下T0代 miR398前體轉化擬南芥植株的 miR398及 CSD1基因的表達

對野生型與轉化后的擬南芥植株進行4 ℃低溫脅迫，并檢測內源及外源 miR398及靶基因的表達情況，結果表明， pre-tae-miR398在CAM35S啟動子驅動下在擬南芥中過量表達，且與靶基因隨低溫脅迫表現(xiàn)出規(guī)律性變化(圖5)。

以未轉化的野生型擬南芥作為陽性對照，0 h侵染為陰性對照，4 ℃處理不同時間后， miR398相對表達量表現(xiàn)為先上升后下降(4 h除外)，并在12 h時達到峰值；其對應的靶基因 CSD1在0～4 h 范圍內的表達量逐漸升高，在6～24 h范圍內的表達量與陰性對照相比逐漸降低，并都顯著低于 miR398的表達量，且于12 h表達量最低。12 h后隨著 miR398表達量的降低，其靶基因表達量逐漸升高， miR398在48 h表達量再次達到最低，而其靶基因 CSD1則達到峰值，表明 miR398對其靶基因 CSD1呈負調控。

圖5 野生型及過表達 pre-tae-miR398植株的 miR398(A)及其靶基因(B)在4 ℃下的相對表達量

3 討 論

miR398是首個被報道的能夠響應多種脅迫的miRNA[6]，在調節(jié)植物銅代謝平衡、應答過量的重金屬脅迫以及臭氧、鹽害等非生物脅迫方面發(fā)揮作用。當植物遭遇非生物脅迫時，為了保護膜組織免受傷害，體內的SOD(超氧化物岐化酶)升高達到清除過量ROS的目的[17]。根據(jù)輔因子的不同，SOD分為Mn-SOD(MSD)、Cu/Zn-SOD(CSD)和Fe-SOD(FSD)三種類型，其中，CSD作為主要的SOD，在清除ROS的過程中發(fā)揮重要作用[18]。低溫和干旱脅迫對小麥CSD基因的表達影響不同。小麥MSD基因的表達受低溫和干旱誘導，但小麥CSD基因的表達只受低溫誘導[19]。蘇 群等[20]研究了外源SOD模擬物聚天冬氨酸鉀鹽(PASPK)對小油菜抗寒性的作用效果，結果表明，低溫脅迫下，外源SOD模擬物能夠促進小油菜種子的萌發(fā)并明顯增強幼苗的抗寒性。轉豌豆葉綠體CSD在煙草中的過量表達可以提高植株對強光與低溫的耐受力[21]。

當植物受到各種生物及非生物脅迫時， CSD1與 miR398始終表現(xiàn)出動態(tài)的負調控關系[6]。但在擬南芥中 CSD2表達量在重金屬、甲基紫精和強光照的脅迫下增加[22]，而在臭氧和病菌的感染脅迫下減少[23]。Dugas等[24]發(fā)現(xiàn)了 miR398與靶基因新的調控機制，蔗糖能夠正調控 miR398的表達，并導致 CSD1與 CSD2基因的mRNA轉錄水平和蛋白質水平降低，這表明不同脅迫刺激的 miR398表達不同，其參與逆境脅迫的機制十分復雜。

本研究表明，4 ℃冷處理下，在野生型與過表達 miR398擬南芥植株中，隨著低溫脅迫時間的增長， miR398表達量逐漸升高之后降低，其靶基因 CSD1出現(xiàn)與之相反的表達模式，處理4 h時 miR398表達量降低，靶基因 CDS1表達量升高，這可能與植物體對低溫信號識別、轉導、信號級聯(lián)放大、響應等一系列過程中存在某一特定應激節(jié)點有關，4 h即是過表達植株快速應答低溫脅迫的應激節(jié)點。吳紹華等[25]在研究抗冷基因 HbMKK6時，在4 ℃處理抗寒品種橡膠樹4 h時， HbMKK6表達量最高。在低溫處理24 h后，由于過表達 miR398可以增加植物對環(huán)境脅迫的靈敏度[26]，使其抗低溫脅迫，調節(jié)體內相應的生理生化功能，導致 CSD1表達上調。 CSD1的大量積累，可通過調節(jié)膜透性、增強膜結構和功能的穩(wěn)定性，使植物細胞減少損傷，降低ROS對植物造成的傷害，此時 CDS1表達量呈峰值。但隨著低溫脅迫的延長，在低溫脅迫72 h后， CSD1的表達量下降，可能是由于植物有高度復雜的抗氧化系統(tǒng)和響應低溫脅迫通路的共同作用，使體內其他防御系統(tǒng)發(fā)揮作用[27]，也可能是由于隨著低溫脅迫時間的增加，植物體受到的損害加劇，導致 CSD1 表達量的再次下降[28]。

從試驗結果推測，在低溫脅迫下，過表達 pre-tae-miR398植株通過負調控靶基因 CDS1來提高植物的抗寒性,與王健飛等[29]關于DN1低溫脅迫下miRNA表達模式的研究結果一致。可以根據(jù) miR398與 CSD1呈負調控關系，對DN1中 miR398進行沉默或者敲除，解除 miR398對靶基因的抑制提高植物的抗寒性。

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Cloning of Winter Wheat Pre- miR398 and Expression Analysis of Target Gene CSD1 under Cold Stress

MEI Lin,XU Qinghua,CANG Jing,LU Qiuwei,YU Jing,ZHANG Da,FENG Mingfang,ZHANG Shuchi,LIANG Guihua,ZHANG Chao

(Laboratory of Plant Physiology and Molecular Biology,School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

miR398 is a miRNA that is negatively regulated by the adversity. The target geneCSDencoding superoxide dismutase (SOD) can resist the toxicity of ROS in plants. In order to further understand the regulatory mechanism of miR398 under low temperature stress,the wheat miR398 precursor gene was cloned from Dongnongdongmai 1,and overexpression vector was conducted and transformed intoArabidopsisthaliana,and Real-time PCR was used to detect the expression level of miR398 and its target gene CSD1 in T0generation under cold stress.The results showed that miR398 of wheat responded to cold stress and down-regulated the expression of CSD1 inArabidopsis.With the extension of low temperature stress time,the expression of miR398 was down-regulated and the expression of CSD1 was up-regulated. It was suggested that the wheat miR398 could respond to low temperature stress and negatively regulate CSD1 gene expression,which indirectly enhanced the cold resistance ofArabidopsisthaliana.

Winter wheat; miR398; CSD1; Cold resistance; Gene expression regulation

時間：2016-11-04

2016-05-20

2016-10-17

黑龍江省自然科學基金項目(C201418)；東北農業(yè)大學科學研究基金項目(2012RCB102)；國家自然科學基金項目(31471423)；國家自然科學基金人才培養(yǎng)科研訓練項目(J1210069)；國家自然科學基金人才培養(yǎng)條件建設項目(J1120002)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541002)

E-mail:283862466@qq.com

蒼 晶(E-mail:cangjing2003@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1419-07

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