竇潤(rùn)芝，陳 靜，楊中州，由婷婷，高 翔，王 麗

(東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所，吉林 長(zhǎng)春 130024)

金納米簇的制備、表征及對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響

竇潤(rùn)芝，陳 靜，楊中州，由婷婷，高 翔，王 麗

(東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所，吉林 長(zhǎng)春 130024)

選用模式植物玉米為研究材料，初步評(píng)估了金納米簇在植物中的安全性.結(jié)果表明：金納米簇對(duì)玉米種子發(fā)芽率沒有影響，50～400 mg/L的金納米簇能夠促進(jìn)發(fā)芽期間玉米幼苗根和芽的生長(zhǎng).通過切片觀察了金納米簇在玉米幼苗細(xì)胞和組織中的吸收情況，發(fā)現(xiàn)金納米簇能夠進(jìn)入玉米根尖脫落細(xì)胞以及根部皮層細(xì)胞.另外，通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)測(cè)定了金納米簇在玉米幼苗中的吸收量，證實(shí)了金納米簇未從玉米根部向地上運(yùn)輸.

金納米簇；玉米種子萌發(fā)；吸收；運(yùn)輸

納米材料是指在三維空間中至少有一個(gè)維度的尺寸處于1～100 nm之間或由小于100 nm的基本單元組成的材料[1-2].隨著納米科學(xué)與技術(shù)的快速穩(wěn)步發(fā)展，納米材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品、日用品等眾多領(lǐng)域中[3-5].然而在生產(chǎn)、使用和處理等過程中納米材料會(huì)不可避免地被傳播到生態(tài)環(huán)境當(dāng)中，可能對(duì)生物體和生態(tài)環(huán)境造成不可預(yù)知的影響，因而納米材料的環(huán)境行為及其毒性效應(yīng)已經(jīng)引發(fā)研究人員的廣泛關(guān)注[6-8].

金納米簇(AuNCs)是一種新型的熒光納米材料，通常由幾個(gè)到100個(gè)金原子組成，尺寸小于2 nm[9].它們具有熒光強(qiáng)度大、毒性低、水溶性良好、生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，因而在生物傳感和生物成像等方面應(yīng)用廣泛[11].目前關(guān)于金納米簇在細(xì)胞中的吸收和毒性研究?jī)H在動(dòng)物細(xì)胞中有報(bào)道[12-13]，而對(duì)于金納米簇在植物中的吸收和毒性研究尚未見報(bào)道.

本文選用USEPA(美國(guó)環(huán)境保護(hù)署)推薦的研究農(nóng)藥和有毒物質(zhì)生態(tài)效應(yīng)的模式植物玉米為對(duì)象，通過觀察金納米簇對(duì)玉米早期萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響，探究了金納米簇在植物中的安全性，并通過切片觀察及等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)測(cè)定研究了金納米簇在玉米細(xì)胞和組織中的吸收情況，為金納米簇在植物中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 金納米簇的制備、純化與表征

實(shí)驗(yàn)制備和盛裝試劑的玻璃容器均用王水浸泡處理并洗凈晾干.金納米簇的制備參照Xie等[14]的方法：將50 mL的氯金酸(HAuCl4)水溶液(10 mmol/L，37℃)加入到50 mL的牛血清白蛋白(BSA)水溶液(50 mg/L，37℃)中，攪拌5min后加入5 mL的氫氧化鈉(NaOH)水溶液(1 mol/L)，37℃水浴反應(yīng)12 h.將制得的金納米簇14 000 r/min離心30 min，取上清加入到透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為14 000)中透析4 d，之后用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，4℃放置備用.利用JEOL JEM-2100F高分辨透射電子顯微鏡(HR-TEM，日本電子株式會(huì)社)、Nano Measure軟件、Zetasizer Nano ZS激光粒度儀(馬爾文儀器有限公司，英國(guó))、Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(瓦里安公司，美國(guó))及Thermo Nanodrop 1000分光光度計(jì)(Nanodrop，美國(guó))檢測(cè)金納米簇的粒徑大小、ζ電勢(shì)、熒光以及紫外可見吸收光譜.

1.2 金納米簇對(duì)玉米的暴露處理及其對(duì)萌發(fā)期玉米的影響

玉米種子(鄭單958，北京德農(nóng)種業(yè)有限公司)先用70%乙醇處理2 min，再用無菌水清洗5次.將不同質(zhì)量濃度的金納米簇(50，100，200，400 mg/L)以5 mL/皿的量加入到培養(yǎng)皿中(含單層濾紙)，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻地放入10粒種子，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，空白對(duì)照用超純水處理.將培養(yǎng)皿放置于人工氣候室中，設(shè)定溫度為25℃，濕度為80%，光照為24 h黑暗.分別統(tǒng)計(jì)不同濃度金納米簇處理的玉米種子每天的發(fā)芽數(shù)，以及金納米簇處理第5天玉米的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和鮮重.

1.3 玉米根部細(xì)胞壓片、組織切片及熒光顯微觀察

暴露結(jié)束后，將玉米根用超純水沖洗，切取根尖(約0.5 mm長(zhǎng))進(jìn)行壓片處理并在Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡(尼康公司，日本)下觀察.同時(shí)取根部成熟區(qū)用5%瓊脂糖包埋，利用LEICA VT1000 S振動(dòng)切片機(jī)(徠卡公司，德國(guó))制作橫切切片.

1.4 樣品消解及組織中金元素含量的ICP-AES測(cè)定

暴露結(jié)束后，將玉米幼苗切分成根和芽?jī)刹糠?，分別用自來水沖洗并在超純水中超聲5 min；用超純水洗凈并吸干水分，105℃殺青15 min，70℃烘干至恒重.

將烘干的樣品磨成粉末，取干樣0.05 g置于100 mL錐形瓶中，向其中加入5 mL濃硝酸(HNO3)，用保鮮膜封口，浸泡過夜，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù).把錐形瓶轉(zhuǎn)移到電熱板上，120℃加熱1 h后，加1 mL王水浸泡1 h；之后將其置于65℃烘箱中繼續(xù)溶解1 h.將瓶?jī)?nèi)液體吸出定容至1.5 mL，利用ICP-AES(Aodigy型，利曼公司，美國(guó))檢測(cè)金元素含量.空白設(shè)置：加等量的濃硝酸，操作同樣品.

1.5 分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用軟件SPSS 19.0，用ANOVA(analysis of variance，Tukey-HSD檢驗(yàn)法)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 金納米簇的表征

制備的金納米簇在高分辨透射電子顯微鏡(HR-TEM)下呈圓球形顆粒，平均粒徑為(2.05±0.41)nm(見圖1a，b).金納米簇在紫外-可見范圍內(nèi)并沒有特征的吸收峰(見圖1c)，利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)得的熒光光譜顯示金納米簇在480 nm激發(fā)下于638 nm處有吸收峰(見圖1c)，且在紫外燈(365 nm)下呈鮮紅色(見圖1d).利用Zetasizer Nano ZS激光粒度儀測(cè)得金納米簇的ζ電勢(shì)為(-14.70±0.96) mV，表明金納米簇帶負(fù)電荷.

a金納米簇的HR-TEM圖像；b金納米簇的粒徑分布圖；c金納米簇的UV-Vis吸收(黑線)及熒光光譜(紅線，激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm)；d日光和紫外燈(365 nm)下的金納米簇

2.2 金納米簇對(duì)玉米萌發(fā)的影響

不同質(zhì)量濃度的金納米簇處理玉米種子5 d后的形態(tài)見圖2a.以玉米根長(zhǎng)超過2 cm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)[15]，發(fā)現(xiàn) 50～400 mg/L的金納米簇對(duì)玉米的發(fā)芽率沒有影響.統(tǒng)計(jì)金納米簇處理玉米5 d后的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，100，200，400 mg/L的金納米簇對(duì)玉米根的伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用，與對(duì)照相比分別增加了18.37%，20.87%和18.26%(見圖2b)；而4個(gè)質(zhì)量濃度(50，100，200，400 mg/L)的金納米簇對(duì)芽的伸長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，與對(duì)照相比分別增加了21.19%，24.86%，21.19%和22.60%(見圖2c).

通過分析金納米簇處理玉米5 d后根與芽的鮮重發(fā)現(xiàn)，所有濃度的金納米簇對(duì)根的鮮重均沒有影響(見圖2d)；但對(duì)芽的鮮重有促進(jìn)作用，與對(duì)照相比50，100，200，400 mg/L的金納米簇處理玉米5 d后芽的鮮重分別增加了11.88%，20%，15%和24.38%(見圖2e).

a不同質(zhì)量濃度金納米簇處理玉米種子5 d后的形態(tài)；b根長(zhǎng)；c芽長(zhǎng)；d根鮮重；e芽鮮重

2.3 玉米對(duì)金納米簇的吸收及運(yùn)輸

2.3.1 玉米幼根壓片及切片

分別對(duì)超純水和400 mg/L金納米簇處理第三天的玉米幼根根尖(約0.5 mm)進(jìn)行壓片，發(fā)現(xiàn)400 mg/L 金納米簇處理后的玉米根尖脫落細(xì)胞中存在紅色熒光物質(zhì)(見圖3a，b)，說明金納米簇可以穿透玉米細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，進(jìn)入根尖脫落細(xì)胞內(nèi).同時(shí)我們對(duì)玉米幼根進(jìn)行橫切，在金納米簇處理的玉米根成熟區(qū)的皮層細(xì)胞中也觀察到了少量紅色熒光物質(zhì)(見圖3c，d)，說明金納米簇能夠進(jìn)入玉米根部.

a超純水處理的玉米第3天的根部細(xì)胞壓片(40×物鏡)；b 400 mg/L金納米簇處理的玉米第3天的根部細(xì)胞壓片(40×物鏡)；

2.3.2 玉米體內(nèi)金元素含量的測(cè)定

圖4 ICP-AES測(cè)定玉米根部組織中的金元素含量

利用ICP-AES對(duì)玉米根和芽中的金元素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖4.由圖4可見，對(duì)照組的根中未檢測(cè)到金元素的存在；金納米簇處理5 d后的玉米根系中金元素的含量隨著處理濃度的增加而升高，最大質(zhì)量濃度400 mg/L金納米簇處理的玉米根系中金含量(1 604.11 μg/g)是50 mg/L 處理(57.90 μg/g)的27.7倍.而在玉米芽中，ICP-AES的結(jié)果顯示未檢測(cè)到金元素的存在.

3 討論

許多研究表明納米材料對(duì)植物的萌發(fā)率沒有影響，但是對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)育卻能產(chǎn)生影響[16].如檸檬酸包被的金納米粒子在較低濃度就能抑制水稻根的伸長(zhǎng)，但是對(duì)水稻種子的萌發(fā)率沒有影響[17].本研究發(fā)現(xiàn)，金納米簇對(duì)玉米種子的萌發(fā)率未產(chǎn)生影響，但是一定濃度的金納米簇能夠促進(jìn)發(fā)芽期間玉米幼苗根和芽的生長(zhǎng).Kumar等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，10和80 μg/mL的金納米粒子(24 nm)能下調(diào)參與種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)以及根伸長(zhǎng)的miR( microRNA )398和miR408的表達(dá)從而促進(jìn)擬南芥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng).我們推測(cè)金納米簇促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)的原因可能是金納米簇改變了一些與玉米生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的miR的表達(dá).

粒徑是納米粒子重要的特征，也是進(jìn)入植物體并產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵因素.與動(dòng)物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞多了一層細(xì)胞壁(孔徑≤10 nm)[19-20]，有報(bào)道表明，小粒徑的納米粒子可以進(jìn)入到植物細(xì)胞[21-23].我們的課題組已經(jīng)報(bào)道了粒徑在3 nm左右的碳量子點(diǎn)可以進(jìn)入玉米根部細(xì)胞[23]，本實(shí)驗(yàn)同樣在玉米根尖脫落細(xì)胞中觀測(cè)到了金納米簇的存在，這可能是由于3 nm的金納米簇粒徑小于細(xì)胞壁孔徑導(dǎo)致的結(jié)果.

利用ICP-AES在玉米根中能檢測(cè)到大量金元素的存在，而利用熒光顯微鏡僅能在玉米根中的皮層細(xì)胞中檢測(cè)到少量金納米簇的存在，結(jié)合金納米簇能夠被過氧化氫淬滅[24]，推測(cè)玉米根中被吸收的金納米簇的熒光可能被組織中的過氧化氫淬滅，也有可能是植物組織中的其他成分改變了金納米簇的表面結(jié)構(gòu)致使其熒光性質(zhì)改變.

在金納米簇暴露下的玉米，其根中可以檢測(cè)出金元素,而在其地上部分并未發(fā)現(xiàn),說明金納米簇在玉米體內(nèi)不能向地上運(yùn)輸.金納米簇不能從玉米根組織進(jìn)一步運(yùn)輸?shù)窖靠赡苁鞘艿接衩變?nèi)皮層凱氏帶的阻礙，因而金納米簇?zé)o法進(jìn)入維管束隨著水分向上運(yùn)輸.這與Wang等[25]的研究結(jié)果一致：CdSe/CdZnS量子點(diǎn)能夠被楊樹根部吸收但不能運(yùn)輸?shù)降厣喜糠?

本實(shí)驗(yàn)探究了金納米簇對(duì)玉米種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)這種納米材料對(duì)玉米早期萌發(fā)階段根和芽的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯：方 林)

Fabrication and characterization of gold nanoclusters and their effects on maize(ZeamaysL.) seed germination

DOU Run-zhi，CHEN Jing，YANG Zhong-zhou，YOU Ting-ting，GAO Xiang，WANG Li

(Institute of Genetics and Cytology，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

Maize，as a model plant，was chosen in this research to assess the safety of gold nanoclusters in plants.The results showed that gold nanoclusters had no effect on germination rate of maize seeds.However，gold nanoclusters at 50～400 mg/L could significantly promote the elongation of roots and shoots during the germination.The fluorescence of gold nanoclusters in the cells and tissue of maize roots was tracked by slicing and fluorescent microscope.Fluorescent microscope graphs showed that gold nanoclusters were existed in detached root-cap cells and cortex of roots，suggesting that gold nanoclusters were absorbed by maize.Moreover，the content of gold element in maize was determined by inductively coupled plasma atomic emission spectrometer(ICP-AES)，which suggested that gold nanoclusters can not be translocated to the shoots from the roots of maize.

gold nanoclusters; maize seed germination; uptake; transport

1000-1832(2016)04-0100-06

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.04.022

2016-05-06

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2014DFA31740)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130604037TC).

竇潤(rùn)芝(1992—)，女，碩士研究生；王麗(1957—)，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物遺傳學(xué)研究.

Q 943 [學(xué)科代碼] 180·5155

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