李晶 沈震亞 陳超 文萍#

（1江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046；2江中藥業(yè)股份有限公司 江西 南昌 330046）

南丹參不同提取部位體外抗氧化活性比較*

李晶1沈震亞2陳超1文萍1#

（1江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046；2江中藥業(yè)股份有限公司 江西 南昌 330046）

目的：研究南丹參不同提取部位對(duì)1,1-二苯基苦肼（DPPH）的清除能力，結(jié)合化學(xué)成分分析，初步揭示南丹參抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：用回流提取法、水煎煮提取法結(jié)合不同溶劑梯度萃取法制備南丹參8個(gè)不同提取部位，通過(guò)觀察其對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定南丹參提取部位的體外抗氧化活性，并結(jié)合HPLC化學(xué)成分分析揭示其抗氧化作用物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果：南丹參各提取物中5個(gè)提取部位均有不同程度的體外抗氧化活性，其中以水-萃取后水部位抗氧化效果最佳，其次為醇-水沉部位，按每克藥材計(jì)DPPH清除量分別為155.269 mg和109.305 mg。結(jié)論：通過(guò)對(duì)南丹參不同提取部位抗氧化活性能力比較結(jié)合HPLC成分分析，發(fā)現(xiàn)其主要抗氧化活性成分為其中所含的原兒茶醛、丹酚酸B、丹參素鈉和丹參酮ⅡA。

南丹參；提取部位；DPPH

南丹參是江西省廣泛分布的野生藥用資源，收載于2014年版江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)，為唇形科植物南丹參Salvia bowleyana Dunn的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效[1]，在我國(guó)部分地區(qū)作為丹參的替代用藥使用[2]。郭巧茹等[3]通過(guò)1,1-二苯基苦肼（DPPH）清除法對(duì)南丹參不同器官的抗氧化能力進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)酚酸類(lèi)成分是南丹參抗自由基的主要活性成分。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)南丹參藥材各個(gè)提取部位進(jìn)行抗氧化活性研究，從中篩選出DPPH清除能力強(qiáng)的活性部位并通過(guò)HPLC法對(duì)其抗氧化活性成分進(jìn)行了鑒定。現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料

1.1 提取部位的制備

1.1.1 藥材來(lái)源南丹參藥材采自江西省都昌縣武三鎮(zhèn)武山林場(chǎng)（經(jīng)度：116°28'12.36"，緯度：29° 31'54.12"），原植物經(jīng)我院虞金寶研究員鑒定為南丹參，采集后除去雜質(zhì)，低溫烘干，并粉碎成過(guò)40目篩的粉末，備用。

1.1.2 醇溶性各提取部位的制備取南丹參藥材粉末20 g置平底燒瓶中，加6倍量乙醇回流提取2次，每次2 h，濾過(guò)，合并乙醇提取液，取適量稀釋至藥材含量為0.4 g/ml，備測(cè)，剩余部分減壓回收乙醇，加純凈水稀釋成藥材含量為1 g/ml的混懸液，依次以等量石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取2次，分別收集各部位及水沉部位。

1.1.3 水溶性各提取部位制備取上述回流提取后的藥渣，揮去乙醇加6倍量水煎煮提取2次，每次2 h，濾過(guò)，合并水煎煮液，取適量稀釋至藥材含量為0.4 g/ml，備測(cè)，剩余部分減壓濃縮至藥材含量1g/ml，先后以等量乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取2次，分別收集各部位及水部位。

1.2 儀器與試劑SHIMADZU UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；1,1-二苯基苦肼（美國(guó)Sigma公司），無(wú)水乙醇（分析純），娃哈哈純凈水。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

2.1 DPPH自由基清除測(cè)定法分別精密吸取1 ml南丹參各提取部位，配1 mg/ml濃度的待測(cè)溶液，加入0.102 mg/ml的DPPH溶液3 ml，搖勻后放置60 min，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，測(cè)定517 nm處的吸收度值，記為A1；再測(cè)定上述1 ml無(wú)水乙醇與3 ml DPPH溶液混合后517 nm處的吸收值，記為A2，通過(guò)以下公式計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除量。清除量（mg/g）=（A1－A2）÷A1×0.102×3×1 000。

2.2 線性關(guān)系考察取0.102 mg/ml DPPH母液以無(wú)水乙醇梯度稀釋成每毫升含DPPH為89.25、76.50、51.00、38.25、25.50、10.20 μg的溶液并測(cè)定吸光度，分別以DPPH濃度和吸光度為X、Y值進(jìn)行線型回歸，得回歸方程Y=0.011 128 86X+0.668 711，R2=0.992。結(jié)果表明：DPPH含量在10.2～102 μg/ml之間濃度與吸光度呈線性相關(guān)。

2.3 反應(yīng)時(shí)間考察參照文獻(xiàn)[4]并稍作改進(jìn)，精密吸取1 ml南丹參水提取部位溶液，加入0.102 mg/ml的DPPH溶液3 ml，搖勻后放置90 min，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，于517 nm處每隔2 min測(cè)定吸收度，通過(guò)制備吸收度-反應(yīng)時(shí)間曲線確定反應(yīng)完全時(shí)間為60 min，見(jiàn)圖1。

圖1 吸收度-反應(yīng)時(shí)間曲線

2.4 各提取部位抗氧化能力測(cè)定取南丹參藥材各提取部位，以無(wú)水乙醇稀釋分別至每毫升含藥材量為72、120、240、400、800、1 200和4 000 μg的待測(cè)液，按2.1項(xiàng)下分別測(cè)定吸收度，并計(jì)算各提取部位DPPH清除量。研究發(fā)現(xiàn)南丹參醇提取物中正丁醇部位、水提取物中乙醚和乙酸乙酯部位基本無(wú)DPPH清除能力，其他各部位DPPH清除量較高，依次為水-萃取后水>醇-水沉>水-正丁醇>醇-石油醚>醇-乙酸乙酯，同時(shí)構(gòu)建各提取物加入量與DPPH清除量的量效關(guān)系曲線，并分別計(jì)算每克南丹參藥材各提取物的DPPH清除量。見(jiàn)表1。

表1 南丹參各提取部位DPPH清除能力測(cè)定

2.5 各提取部位抗氧化活性物質(zhì)HPLC分析基于前期南丹參藥材指紋圖譜研究基礎(chǔ)，為探明各提取部位中抗氧化活性成分，我們對(duì)有較好DPPH清除能力的各提取部位進(jìn)行了HPLC色譜分析，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些提取部位所含化學(xué)成分主要為丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素、丹參酮ⅡA以及丹參酮Ⅰ。

3 討論

在各提取部位DPPH清除能力測(cè)定方法制定中，我們參照文獻(xiàn)[3～5]，采用1 ml待測(cè)液加上3 ml DPPH母液的混合液作為底色，對(duì)清除量進(jìn)行修正，結(jié)果通過(guò)對(duì)濃度在線性范圍內(nèi)的多批提取物進(jìn)行吸收度測(cè)定，結(jié)果均顯示在517 nm處無(wú)吸收。因此，對(duì)DPPH清除量計(jì)算進(jìn)行了優(yōu)化。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證南丹參中具有抗氧化活性部位所含主成分的抗氧化活性，我們同時(shí)對(duì)HPLC分析出的各成分的對(duì)照品溶液進(jìn)行了DPPH清除能力測(cè)定，結(jié)果顯示每微克丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素、丹參酮ⅡA以及丹參酮Ⅰ對(duì)照品DPPH清除量依次為：4.398 mg、13.026 mg、4.256 mg、0.790 mg和0 mg，提示南丹參抗氧化活性成分為丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素和丹參酮ⅡA。

南丹參、丹參同屬唇形科中藥材，丹參是植物丹參的干燥根及根莖，南丹參是植物南丹參的干燥根及根莖，因兩者在功效方面存在相同性，且南丹參在我國(guó)部分地區(qū)為地方習(xí)用藥材，在江西、浙江民間亦作丹參入藥。我們通過(guò)參加全國(guó)第四次資源普查發(fā)現(xiàn)南丹參廣泛分布于江西省多個(gè)地區(qū)，且有一定蘊(yùn)藏量。為擴(kuò)大南丹參藥用的使用范圍，本研究對(duì)其化學(xué)成分和藥理藥效等方面進(jìn)行了部分研究，為相關(guān)南丹參的臨床應(yīng)用和深入開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐。

[1]江西省食品藥品監(jiān)督管理局.江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2014.230-231

[2]衛(wèi)生部藥政管理局.中藥材手冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1990.54

[3]郭巧茹,陳鶯鶯,李琳,等.南丹參不同器官提取物清除DPPH能力的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,28(1):98-101

[4]李紅,張?jiān)?應(yīng)用DPPH法測(cè)定蘋(píng)果提取物的抗氧化能力[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,35(1):35-38

[5]王桂芹,鄭玉華,錢(qián)進(jìn)芳.虎杖根莖中蒽醌類(lèi)成分的體外抗氧化活性[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2011,20(2):43-48

R965

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.10.045

2016-09-13）

江西省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：20142BAB215065）

#通訊作者：文萍，E-mail：14834129@qq.com