嚴(yán)心濤， 鐘金鳳， 吳云良， 王 策， 武曉東

(中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163)

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流式細(xì)胞儀氣動(dòng)穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)設(shè)計(jì)與測(cè)試

嚴(yán)心濤， 鐘金鳳， 吳云良， 王 策， 武曉東

(中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163)

基于氣動(dòng)穩(wěn)流方法，研制了一種流式細(xì)胞儀三維液流聚焦的液流系統(tǒng)。通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析了所搭建系統(tǒng)的鞘液流量與氣動(dòng)裝置中氣壓之間的關(guān)系，得出了細(xì)長(zhǎng)孔動(dòng)態(tài)流動(dòng)的流量經(jīng)驗(yàn)公式適用于所搭建的系統(tǒng)。利用CCD熒光成像方法對(duì)系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性進(jìn)行了定性測(cè)試。使用Matlab軟件對(duì)APD探測(cè)的多組樣品聚焦的熒光信號(hào)進(jìn)行了計(jì)算和分析，定量地評(píng)定了系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，研制的液流系統(tǒng)的樣品聚焦寬度14 μm時(shí)，脈動(dòng)低于0.5 μm；聚焦樣品流的熒光信號(hào)的波動(dòng)方差低于0.606。

流式細(xì)胞儀； 穩(wěn)流； 聚焦； 氣動(dòng)

0 引 言

流式細(xì)胞儀是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中先進(jìn)的儀器之一，是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且能夠同時(shí)檢測(cè)快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單個(gè)微粒(0.2～100 μm)的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，用以分析定量也可對(duì)特定群體加以分選的儀器，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)、海洋微生物學(xué)、藥物代謝檢測(cè)以及臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等方面[1-5]。

目前，實(shí)現(xiàn)單個(gè)微?？焖僦本€聚焦的方法主要有傳統(tǒng)的三維鞘液動(dòng)力學(xué)聚焦、微流管毛細(xì)作用聚焦[6]、超聲波聚焦[7-8]、慣性流體聚焦[9]以及芯片上的液流聚焦[10-11]等。其中，三維鞘液動(dòng)力學(xué)聚焦方法實(shí)現(xiàn)單個(gè)微粒的聚焦檢測(cè)速度最快，但此方法對(duì)微粒聚焦位置和流動(dòng)速度的穩(wěn)定性提出很高的要求，而鞘液對(duì)微粒聚焦位置和流動(dòng)速度的穩(wěn)定性又起著關(guān)鍵性作用[1,12]。為實(shí)現(xiàn)鞘液對(duì)微粒穩(wěn)定地聚焦，現(xiàn)采用的手段主要有注射泵控制鞘液的傳輸[13]，因注射泵每次傳輸?shù)牧髁坑邢?，該方法難以實(shí)現(xiàn)樣品長(zhǎng)時(shí)間高速檢測(cè)；蠕動(dòng)泵傳輸鞘液，并在管路中加入多種穩(wěn)流裝置[14]，該方法對(duì)穩(wěn)流裝置的設(shè)計(jì)制作的要求較高；利用氣動(dòng)裝置實(shí)現(xiàn)鞘液的穩(wěn)定流動(dòng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)微粒檢測(cè)的穩(wěn)定性[15]，該專利控制鞘液穩(wěn)流的氣動(dòng)裝置比較復(fù)雜。

本文基于這種氣動(dòng)穩(wěn)流方法，在該專利的基礎(chǔ)上研制出一種簡(jiǎn)易的氣動(dòng)-液流系統(tǒng)；通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算結(jié)果的比較，評(píng)估了鞘液流量與氣動(dòng)裝置中的氣壓大小關(guān)系，并以此為滿足所需要的鞘液流量，反算出氣動(dòng)裝置所需要的控制氣壓大?。谎芯苛嗽摎鈩?dòng)穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性的定性和定量的測(cè)試方法。

1 氣動(dòng)穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)原理

本系統(tǒng)的工作原理簡(jiǎn)圖如圖1所示，鞘液通過(guò)水泵(電磁泵或隔膜泵等)抽取，并經(jīng)鞘液入口11流入到儲(chǔ)氣罐12中；之后鞘液在儲(chǔ)氣罐12的控制壓力p0下經(jīng)節(jié)流孔接頭8穩(wěn)定地流入流動(dòng)室2中；其中，儲(chǔ)氣罐12中的氣壓由精密氣壓調(diào)節(jié)閥9控制；樣品由樣品泵4抽取，再經(jīng)樣品針管3進(jìn)入流動(dòng)室2中；根據(jù)液流動(dòng)力學(xué)聚焦原理，進(jìn)入流動(dòng)室2中的樣品在鞘液作用下聚焦，之后經(jīng)混合液出口流出。

圖1 氣動(dòng)穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)原理簡(jiǎn)圖

2 氣動(dòng)穩(wěn)流系統(tǒng)壓力與流量關(guān)系

2.1 氣動(dòng)穩(wěn)流聚焦系統(tǒng)搭建

為分析本系統(tǒng)儲(chǔ)氣罐中控制壓力值與鞘液流量間的關(guān)系，搭建的系統(tǒng)采用Air Control公司的精密氣壓調(diào)節(jié)閥，其輸出氣壓的控制精度±344 Pa，利用該調(diào)節(jié)閥來(lái)維持儲(chǔ)氣罐中的恒壓狀態(tài)；采用西安儀表廠的精密壓力表，其量程160 kPa，精度等級(jí)0.25級(jí)，用于測(cè)試本系統(tǒng)管路中的壓力值；水泵可采用隔膜泵；流動(dòng)室鞘液入口位置比節(jié)流孔鞘液出口位置的高度約高10 cm；采用的節(jié)流孔接頭的長(zhǎng)度l1=10 mm，直徑d1=230 μm；流動(dòng)室節(jié)流孔的截面是一正方形，其邊長(zhǎng)a=250 μm，節(jié)流孔的長(zhǎng)度l2=11.6 mm，流動(dòng)室的水力直徑d2與a之間的關(guān)系為：

d2=4Rh, Rh=A/P

(1)

式中:A為液流流過(guò)流動(dòng)室節(jié)流孔的橫截面積;P為流動(dòng)室節(jié)流孔的濕周周長(zhǎng),則流動(dòng)室節(jié)流孔的水力直徑d2為250 μm；流路中的其他管子直徑d3為3 mm。

2.2 系統(tǒng)控制壓力與流量關(guān)系實(shí)驗(yàn)

為了分析系統(tǒng)控制壓力與流量關(guān)系，在不同控制壓力下，測(cè)試節(jié)流孔接頭前后的壓力值p11和p12，鞘液在流動(dòng)室中聚焦前后的壓力值p21和p22，以及混合液塞滿(100±0.05)mL量瓶時(shí)間t。其中，在不同控制壓力下，鞘液的流量Q見(jiàn)表1。表1中也顯示出系統(tǒng)在不同控制壓力下，兩組測(cè)試實(shí)驗(yàn)的流量誤差δ均在1%以下，說(shuō)明鞘液流動(dòng)的穩(wěn)定性很好。

本系統(tǒng)采用的節(jié)流孔接頭和流動(dòng)室節(jié)流孔均是細(xì)長(zhǎng)孔，其流量Q與其前后的壓力差Δp之間的經(jīng)驗(yàn)公式為：

Δp=128μlQ/(πd2)

(2)

其中:μ為液流的黏度；l為細(xì)長(zhǎng)孔的長(zhǎng)度;d為細(xì)長(zhǎng)孔的直徑；鞘液為去離子純凈水，其黏度μ約0.001 N·s·m-2。根據(jù)式(2)不難計(jì)算出節(jié)流孔接頭和流動(dòng)室聚焦前后壓力差，以及與實(shí)驗(yàn)測(cè)得的壓力差的誤差大小。表2和表3顯示在不同控制壓力下，系統(tǒng)中2個(gè)節(jié)流孔的壓力差的測(cè)量值與經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算值的誤差均在10%以內(nèi)，引起壓力誤差的原因除了經(jīng)驗(yàn)公式與實(shí)際管路模型存在一些偏差外，還由精密壓力表的測(cè)量精度(測(cè)量精度為±400 Pa)和精密氣壓調(diào)節(jié)閥的穩(wěn)

表2 節(jié)流孔接頭前后測(cè)量的壓力差與細(xì)長(zhǎng)孔動(dòng)態(tài)流動(dòng)的流量經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算的壓力差

表3 流動(dòng)室聚焦前后測(cè)量的壓力差與細(xì)長(zhǎng)孔動(dòng)態(tài)流動(dòng)的流量經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算的壓力差

壓精度(控制精度為±344 Pa)引起；在該誤差范圍內(nèi)，本系統(tǒng)的節(jié)流孔前后的壓力差可由經(jīng)驗(yàn)公式進(jìn)行初步評(píng)估；若再結(jié)合液流連續(xù)方程：

(3)

以及伯努利定理：

(4)

就可以通過(guò)系統(tǒng)所需要的鞘液流量大小，計(jì)算出儲(chǔ)氣罐中所需要控制的氣壓大小。其中:D為管道的直徑;z為測(cè)量點(diǎn)的相對(duì)高度;ρ為鞘液的密度;v為流速，p為壓力大小。

3 系統(tǒng)樣品聚焦穩(wěn)定性測(cè)試

3.1 基于CCD成像的樣品聚焦穩(wěn)定性定性測(cè)試

在該測(cè)試方法中，所測(cè)試的樣品采用稀釋的羅丹明，其在532 nm激光器下可激發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；為了降低CCD成像的背景噪聲，在顯微物鏡前安裝一高通濾波片，用于濾除流動(dòng)室上的散射激光；調(diào)節(jié)反射鏡，使得激光照射在樣品聚焦的位置上；羅丹明受激激發(fā)的熒光經(jīng)過(guò)一高通濾波片和顯微物鏡后即可在CCD上成像，并通過(guò)數(shù)據(jù)線上傳到顯示屏上，實(shí)時(shí)顯示樣品聚焦的狀態(tài)，其測(cè)試原理如圖2所示。

圖2 CCD成像的樣品聚焦穩(wěn)定性測(cè)試方法原理圖

為了定性地測(cè)試氣動(dòng)穩(wěn)流系統(tǒng)的穩(wěn)定性，將其與不含儲(chǔ)氣罐的液流系統(tǒng)(其他條件都一樣)作對(duì)比；同時(shí)，為了排除樣品流自身脈動(dòng)的影響，采用低脈動(dòng)的流量穩(wěn)定的注射泵抽取樣品，其中，注射泵的針管容量為50 μL，流量設(shè)定20 μL/min。在顯示屏可觀測(cè)到，經(jīng)隔膜泵直接抽取的鞘液對(duì)樣品聚焦時(shí)，樣品流的聚焦寬度為12～16 μm之間周期性脈動(dòng)，其中，脈動(dòng)的周期與隔膜泵的運(yùn)動(dòng)周期一致；氣動(dòng)穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品流的聚焦寬度為14 μm，脈動(dòng)在0.5 μm以內(nèi)。通過(guò)該CCD成像方法，可以直觀、定性地觀測(cè)到本氣動(dòng)穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性還是很好的。

3.2 基于APD熒光探測(cè)的樣品聚焦穩(wěn)定性定量測(cè)試

在該測(cè)試的方法中，所測(cè)試的樣品仍采用羅丹明，其在532 nm激光器下所激發(fā)的熒光經(jīng)兩個(gè)透鏡聚焦后匯聚到APD上；為了提高信噪比，在APD前裝配一高通濾波片和一帶通濾波片；APD探測(cè)的熒光信號(hào)上傳到示波器上；之后，再將示波器存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Matlab軟件中，經(jīng)數(shù)據(jù)提取，輸出脈動(dòng)圖像以及作進(jìn)一步地?cái)?shù)據(jù)分析，其測(cè)試原理如圖3所示。

圖3 基于APD熒光探測(cè)的樣品聚焦穩(wěn)定性定量測(cè)試方法原理圖

同樣，為測(cè)試氣動(dòng)穩(wěn)流系統(tǒng)的穩(wěn)定性，將其與不含儲(chǔ)氣罐的液流系統(tǒng)(其他條件都一樣)作對(duì)比；采用低脈動(dòng)的流量穩(wěn)定的注射泵抽取樣品，以盡量排除樣品流自身脈動(dòng)的影響，其中，注射泵的針管容量為50 μL。本方法采用樣品公差這一統(tǒng)計(jì)值對(duì)樣品流的聚焦穩(wěn)定性作定量地評(píng)定：

(5)

圖4 在注射泵流量為20 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號(hào)波動(dòng)圖

圖5 在注射泵流量為20 μL/min下，隔膜泵直接抽取鞘液的聚焦樣品流熒光信號(hào)波動(dòng)圖

圖6 在注射泵流量為40 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號(hào)波動(dòng)圖

在Matlab中利用式(5)計(jì)算熒光信號(hào)的波動(dòng)方差。其中，在注射泵流量為20 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號(hào)的波動(dòng)方差為0.606，隔膜泵直接抽取鞘液下聚焦樣品流的熒光信號(hào)的波動(dòng)方差為2.592；在注射泵流量為40 μL/min下，氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的聚焦樣品流熒光信號(hào)的波動(dòng)方差為0.521，隔膜泵直接抽取鞘液下聚焦樣品流的熒光信號(hào)的波動(dòng)方差為5.534。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，可以定量地評(píng)定本文研制的氣壓穩(wěn)流系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性。

圖7 在注射泵流量為40 μL/min下，隔膜泵直接抽取鞘液的聚焦樣品流熒光信號(hào)波動(dòng)圖

4 結(jié) 語(yǔ)

基于鞘液三維動(dòng)力學(xué)聚焦原理，本文研制了一種簡(jiǎn)易的氣動(dòng)穩(wěn)流裝置，通過(guò)精密控制該裝置的氣壓可實(shí)現(xiàn)鞘液的穩(wěn)定流動(dòng)，以此來(lái)滿足流式細(xì)胞儀樣品中微粒的高速穩(wěn)定的聚焦和檢測(cè)，并進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和測(cè)試，可以得出以下結(jié)論：

本系統(tǒng)中節(jié)流孔前后的壓力差的實(shí)際測(cè)量值與經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算的理論值偏差在10%以內(nèi)，可以采用經(jīng)驗(yàn)公式估算本系統(tǒng)的節(jié)流孔前后的壓力差，再結(jié)合液流連續(xù)方程和伯努利定理，就可以根據(jù)系統(tǒng)所需的鞘液流量大小來(lái)反算出氣動(dòng)裝置所需要精密控制的氣壓大小；通過(guò)本文提出的CCD成像測(cè)試方法，可以直觀定性地觀測(cè)到本系統(tǒng)的樣品聚焦穩(wěn)定性非常好；利用本文提出的APD熒光探測(cè)測(cè)試方法，可以定量地比較本氣動(dòng)穩(wěn)流系統(tǒng)與不含儲(chǔ)氣罐的液流系統(tǒng)(其他條件都一樣)的穩(wěn)定性大小，結(jié)果顯示出本系統(tǒng)的樣品脈動(dòng)比后者要小的多。

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Design and Test of Flow Cytometer Focusing System Based on Pneumatic Steady Flow Method

YANXin-tao，ZHONGJin-feng，WUYun-liang，WANGCe，WUXiao-dong

(Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology, Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, China)

A three-dimensional (3-D) hydrodynamic focusing system was designed based on pneumatic steady flow method in flow cytometer. Through a large number of experimental data collected from the building platform, the relationship between the sheath flow rate and the pressure which in the pneumatic devices was analyzed, and the empirical traffic formula of dynamic flow in the elongated hole was gotten, and the formula could be applicable to build platform. The fluorescence imaging method was used to take charge-coupled device (CCD), qualitatively, the stability of the focusing sample in the system was tested. Using Matlab software, fluorescence signals of the focusing sample which detected by Avalanche Photo Diode (APD) were calculated and analyzed. The stability of the focusing sample were quantitatively evaluated. The results showed that the sample pulsating size of the flow system developed was below 0.5 μm. When the focus width of the sample was 14 μm; the fluctuation variance of the focused sample stream’s fluorescence signal was lower than 0.606.

flow cytometer; steady flow; focusing; pneumatic

2015-03-07

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011AA02A106)；蘇州市醫(yī)療器械與新醫(yī)藥專項(xiàng)(ZXY201428)

嚴(yán)心濤(1987-)，男，湖北仙桃人，助理研究員，從事機(jī)電液一體化研究。Tel.:0512-69588273；E-mail: yanxt@sibet.ac.cn

武曉東(1968-)，男，吉林舒蘭人,研究員，從事光學(xué)工程和醫(yī)用光學(xué)方面研究。E-mail：wuxiaodong2000@hotmail.com

TH 776

A

1006-7167(2016)01-0039-04