谷元亮， 周 琪， 林夏露， 王 欣， 周 飛， 趙進(jìn)順， 鄒寶波

(寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 浙江 寧波 315211)

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·實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與安全·

顯微外科血管插管模型中的小鼠福利倫理關(guān)懷

谷元亮， 周 琪， 林夏露， 王 欣， 周 飛， 趙進(jìn)順， 鄒寶波

(寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 浙江 寧波 315211)

小鼠顯微外科血管插管手術(shù)模型是一種用途廣泛的實(shí)驗(yàn)研究模型，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比，更接近人體的實(shí)際狀況。但在動物模型制作與使用過程中，應(yīng)充分考慮實(shí)驗(yàn)動物的福利倫理，決不可因?yàn)閯游飳?shí)驗(yàn)的不可替代性而忽視動物的福利倫理。該文就制作與使用該模型實(shí)驗(yàn)過程中，如何使小鼠享有充分的福利倫理關(guān)懷進(jìn)行了闡述，目的是促進(jìn)動物實(shí)驗(yàn)福利倫理的改善，以便更好地推動小鼠血管插管顯微外科手術(shù)模型在生物醫(yī)學(xué)中的正確應(yīng)用。

血管插管模型； 福利倫理關(guān)懷； 小鼠； 顯微外科

0 引 言

在現(xiàn)代生命科學(xué)研究中，動物實(shí)驗(yàn)往往是不可替代的。在對人的各種生理現(xiàn)象和病理機(jī)制的研究中，大多都需要借助動物實(shí)驗(yàn)加以闡明或證實(shí)。有人統(tǒng)計(jì)，生物醫(yī)學(xué)科研課題中，有60%以上需要動物實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)在整個生物醫(yī)學(xué)發(fā)展的歷程中有舉足輕重的作用，如早在1912年，Carrel通過動物實(shí)驗(yàn)[1]開創(chuàng)了血管與器官移植研究，并因此獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎。近年來，動物顯微外科活體模型技術(shù)的逐步成熟，進(jìn)一步推動了實(shí)驗(yàn)外科向更高更深層次的發(fā)展。

在既往的顯微外科手術(shù)模型研究中，實(shí)驗(yàn)往往采用大型動物(如豬、狗、兔等)，利用大鼠制作動物模型的也有許多報道。但是，由于大動物價格相對昂貴以及純系品種來源困難等，大大限制了其推廣應(yīng)用。近年來，小鼠由于具有品系較純、來源廣、價格便宜、免疫學(xué)檢測方便，且其在食物結(jié)構(gòu)、生理生化和發(fā)育過程與人類較為接近，基因和人類基因有大于80%的同源性等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于制作顯微外科手術(shù)模型。

小鼠顯微外科血管插管活體手術(shù)模型是一種用途廣泛的實(shí)驗(yàn)研究模型。目前，國外研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)開始采用該模型進(jìn)行諸多方面的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[2-12]，國內(nèi)也已經(jīng)開始有該手術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图夹g(shù)建立和應(yīng)用的研究報道[13-14]。但在該活體動物模型的制作和實(shí)驗(yàn)中，采取的外科操作必然對正常組織結(jié)構(gòu)、生理功能產(chǎn)生影響，如炎性反應(yīng)、出血、創(chuàng)傷、疼痛等。另外，若粗暴地對待動物，動物的心理和生理都會處于不正常的應(yīng)激狀態(tài)。這些反應(yīng)既會干擾動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也與生命倫理學(xué)尊重、行善、不傷害和公正對待動物的福利倫理原則相沖突。

本文就小鼠血管插管顯微外科活體手術(shù)模型建立與實(shí)驗(yàn)過程中的福利倫理關(guān)懷進(jìn)行簡述，以促進(jìn)動物實(shí)驗(yàn)福利倫理的改善，確保該技術(shù)模型在動物實(shí)驗(yàn)中的正確應(yīng)用。

1 小鼠血管插管顯微外科手術(shù)模型的種類及應(yīng)用

常用的手術(shù)模型有股動、靜脈血管插管手術(shù)模型，頸動、靜脈血管插管手術(shù)模型等。這種活體動物模型是模擬人體活體環(huán)境，讓動物在清醒、自由活動與進(jìn)食的狀態(tài)下，通過靜脈插管及動脈插管采集血樣檢測各種因素的動態(tài)變化。因此，該模型在生理、病理、器官移植、藥物代謝及毒理學(xué)等研究領(lǐng)域中用途廣泛。

目前，應(yīng)用該模型進(jìn)行營養(yǎng)與代謝的研究比較多。如Hanaya等[3]應(yīng)用STOP KO小鼠在股動、靜脈插管后3h，研究小鼠大腦對糖的利用；Levitt等[4]利用股、動靜脈插管模型研究糖刺激對人類胰腺β細(xì)胞的增殖作用；Pascoe等[5]用該模型研究游離脂肪酸對糖刺激胰腺β細(xì)胞增殖的抑制作用；Alonso等[6]在小鼠自由活動狀態(tài)下，研究糖刺激下的胰島素敏感性、胰島素分泌及其分泌指數(shù)。Lee等[7]通過該模型研究間歇性缺氧對糖代謝的影響。另外也有進(jìn)行毒物的毒性研究，如Woodske等[8]利用股動、靜脈插管研究LPS的毒性作用，以及高胰島素血癥預(yù)測高血糖的嚴(yán)重性。也有進(jìn)行藥物代謝研究的報道，Rippe等[9]報道用股動脈與頸靜脈插管建立的腹腔透析模型研究高分子腹膜清除時的基礎(chǔ)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)影響因子；Rodriques等[10]、Lataro等[11]使用小鼠進(jìn)行心血管的動力學(xué)研究；Ferl等[12]在注入F-FDG掃描藥劑后從股動脈采樣60 min連續(xù)采血15次，研究血漿的數(shù)據(jù)效應(yīng)曲線。

由此可見，利用該活體動物模型，通過對藥物、毒物或營養(yǎng)物等在體內(nèi)的代謝、生理和病理作用的動態(tài)觀察，可以探索人類疾病的發(fā)病機(jī)理、藥物的作用機(jī)制、疾病預(yù)防的效果等。

2 維護(hù)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理的重要性

作為一名生物醫(yī)學(xué)工作者，必須清醒的認(rèn)識到，維護(hù)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理是人類進(jìn)步和社會發(fā)展的必然結(jié)果。我們在不斷通過動物實(shí)驗(yàn)為生命科學(xué)發(fā)展和人類健康提供更多更有益成果的同時，必須積極采納動物保護(hù)主義者的合理意見，通過科學(xué)、高效、經(jīng)濟(jì)的方法和人道主義原則，不斷改進(jìn)和提高研究方法和質(zhì)量，盡量減少實(shí)驗(yàn)動物的數(shù)量，減輕實(shí)驗(yàn)動物的痛苦，維護(hù)實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)有的福利倫理。

盡管實(shí)驗(yàn)動物是一群不會說話的生靈，它們沒有能力去維護(hù)自身的生存權(quán)力和利益，但它們也是有感覺的生命實(shí)體。它們有享受快樂、回避痛苦和恐懼的需求，人類有責(zé)任與義務(wù)去尊重、善待它們，而落實(shí)到行動中就是要重視和維護(hù)實(shí)驗(yàn)動物福利。

國際上普遍承認(rèn)的動物福利倫理原則是享受“五大自由”[15]，即：免于饑渴的自由；免于不適的自由；免于疼痛、傷害和疾病的自由；表達(dá)正常天性的自由；免于恐懼與憂傷的自由。也就是說，在飼養(yǎng)管理和使用實(shí)驗(yàn)動物活動中，必須采取有效措施，保證實(shí)驗(yàn)動物能夠受到良好的管理與照料，為其提供清潔、舒適的生活環(huán)境，提供保證健康所需的充足的食物、飲用水和空間，使實(shí)驗(yàn)動物減少或避免不必要的傷害、饑渴、不適、驚恐、疾病和疼痛。

維護(hù)實(shí)驗(yàn)動物福利并不是排斥動物實(shí)驗(yàn)，而是體現(xiàn)在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中對這些動物進(jìn)行全方面的關(guān)愛和呵護(hù)。保證為人類做出貢獻(xiàn)和犧牲的實(shí)驗(yàn)動物在康樂的狀態(tài)下生存，在無痛苦的狀態(tài)下死亡。盡可能為它們提供舒適的環(huán)境、標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)的飼料和清潔的飲用水，做好疾病的預(yù)防保健與診治，讓它們免受各種額外的痛苦，保持身心愉悅，享受生存的樂趣。3R原則也是國際上公認(rèn)的改善實(shí)驗(yàn)動物福利的重要內(nèi)容，特別對避免諸如毒性實(shí)驗(yàn)、人類疾病動物模型等給動物造成的傷害尤為重要。動物倫理福利不僅能保證實(shí)驗(yàn)動物身心健康，同時也能保證研究結(jié)果客觀、準(zhǔn)確、真實(shí)、科學(xué)、可靠。

在小鼠顯微外科插管活體手術(shù)模型的制作和應(yīng)用中，由于存在麻醉、手術(shù)、術(shù)后活體給藥、活體病理生理反應(yīng)觀察記錄、動物飼養(yǎng)等諸多環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)都會涉及到動物的福利倫理。因此，做好動物的福利倫理關(guān)懷，對于正確使用該模型和確保得到正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是十分重要的。

3 充分保障動物的福利倫理

近年來，小鼠活體血管插管顯微外科技術(shù)已經(jīng)在藥物代謝、糖尿病與肥胖機(jī)理研究中得到了應(yīng)用[3-8]。鑒于該類模型動物是在清醒、自由活動與進(jìn)食狀態(tài)下進(jìn)行的連續(xù)動態(tài)實(shí)驗(yàn)，手術(shù)的麻醉方式、手術(shù)過程中的失血量多少、手術(shù)中的保暖措施、手術(shù)過程中的無菌技術(shù)、手術(shù)所用的導(dǎo)管粗細(xì)及材料等均可以對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。另外，在實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動物的福利保障，也直接影響到實(shí)驗(yàn)動物日常的生理指標(biāo)。保障動物福利也是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，保證其完整與準(zhǔn)確性的重要因素。

作者在美國從事小動物顯微外科模型制作多年，回國后繼續(xù)從事實(shí)驗(yàn)動物管理工作，有多年制作小鼠顯微外科活體動物模型經(jīng)驗(yàn)。完成了多系統(tǒng)，多器官模型的制作，并建立了多種實(shí)驗(yàn)動物模型。使用的小鼠種類也很多，如C57BL/6、BALB/c、ICR、SCID等?，F(xiàn)就建立小鼠血管插管顯微外科活體手術(shù)模型中，實(shí)驗(yàn)小鼠應(yīng)該享有的福利進(jìn)行簡介，以期對相關(guān)工作者有所借鑒。

3.1 手術(shù)前的準(zhǔn)備要充分

建立小鼠血管插管手術(shù)模型是利用顯微外科技術(shù)在小鼠動、靜脈血管分別置入一根很細(xì)的塑料軟管，兩管在頸背部固定后與自動給藥系統(tǒng)連接。該模型通過靜脈插管給予研究因素，動脈插管采集血樣，檢測各種因素的動態(tài)變化。因?yàn)槭中g(shù)精細(xì)，熟練的手術(shù)人員也需要1 h左右才能完成1例手術(shù)。由于手術(shù)時間長，手術(shù)前的準(zhǔn)備工作就顯得更為重要。就像醫(yī)生給病人做手術(shù)，充分術(shù)前準(zhǔn)備，可以減少手術(shù)中的忙亂，縮短手術(shù)時間，減少動物的痛苦，利于手術(shù)后的小鼠盡快恢復(fù)，這是保障本實(shí)驗(yàn)成功的前提條件。

手術(shù)中使用的器械與物品要按其特點(diǎn)選用不同的消毒方法，如手術(shù)器械使用熱力消毒，塑料血管插管選用環(huán)氧乙烷消毒，手術(shù)后的自動給藥系統(tǒng)用含氯消毒液與75%乙醇處理等等。嚴(yán)格按規(guī)定配置手術(shù)中使用的抗菌素、肝素、去痛劑、麻醉劑及生理鹽水等。由于血管插管手術(shù)模型是將動物血液與外界系統(tǒng)連接，因此在配置各種液體的過程中必須嚴(yán)格無菌技術(shù)，避免污染配置液體，從而大大減少手術(shù)中與手術(shù)后小鼠的感染機(jī)會，減少了實(shí)驗(yàn)動物的痛苦。

3.2 手術(shù)中的操作要輕柔

外科手術(shù)是一門熟能生巧的技術(shù)，每一個步驟，每一處細(xì)節(jié)都要經(jīng)歷細(xì)致的培訓(xùn)和精確的操作。在手術(shù)前除了進(jìn)行必要的撫摸安撫，還要為它們注射麻醉藥(或吸入麻醉)，并確保麻醉到位。在具體手術(shù)操作過程中，手術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)開始前要充分了解實(shí)驗(yàn)動物的生理結(jié)構(gòu)，熟練掌握抓取、注射、取樣、測量等操作技巧，應(yīng)遵循“溫和保定，善良撫慰，減少痛苦和應(yīng)激反應(yīng)”的原則，使對動物身體的強(qiáng)制性限制減少到最低程度。在進(jìn)行備皮、游離血管、傷口縫合這些操作的時候，應(yīng)盡最大的可能減少動物承受的痛苦。

另外，在手術(shù)中要盡量減少出血，嚴(yán)格無菌技術(shù)操作，防止傷口與血液系統(tǒng)感染。由于手術(shù)時間長，手術(shù)過程中動物的保溫也很重要。將麻醉后的小鼠固定在37℃恒溫床上進(jìn)行手術(shù)，可以預(yù)防手術(shù)期間動物的體溫下降，有利于其手術(shù)后的盡快康復(fù)。

3.3 手術(shù)后的護(hù)理與安樂死

為減少小鼠手術(shù)后的疼痛與感染，手術(shù)后連續(xù)2 d給予鎮(zhèn)痛、消炎處理。手術(shù)后的小鼠動、靜脈插管與自動給藥系統(tǒng)連接，通過插管持續(xù)的輸入肝素以保持動、靜脈插管的暢通。因此，手術(shù)后的自動給藥系統(tǒng)與血管插管應(yīng)該連接緊密，更換液體時要嚴(yán)格無菌技術(shù)，以防止小鼠血液系統(tǒng)的感染。手術(shù)后的小鼠放置在單籠中飼養(yǎng)，由于使用旋轉(zhuǎn)臂固定插管，小鼠可以在飼養(yǎng)籠中自由運(yùn)動、進(jìn)食，充分保障了動物的福利倫理。手術(shù)2 d后，動物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，取血與給藥必須在沒有驚嚇、痛苦的狀態(tài)下完成的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對實(shí)驗(yàn)動物采用吸入性麻醉實(shí)施安樂死。處死動物場所要遠(yuǎn)離其他動物，以避免動物產(chǎn)生心理恐懼。動物死亡后，放置在專用的塑料袋中存放在專用的冰柜中，由專業(yè)部門統(tǒng)一回收焚燒處理。

3.4 在動物實(shí)驗(yàn)過程中倫理委員會的作用

在美國，對涉及動物實(shí)驗(yàn)研究項(xiàng)目的倫理審查已經(jīng)形成一種制度，明文規(guī)定未經(jīng)倫理委員會審查的項(xiàng)目不準(zhǔn)立項(xiàng)，未提交倫理審查報告的論文不能發(fā)表，未通過倫理審查的新技術(shù)不得應(yīng)用。倫理委員會的審查工作獨(dú)立、透明、公正、科學(xué)、民主，不受利益沖突的影響。審查時他們考慮以下要素：研究資質(zhì)、實(shí)驗(yàn)設(shè)施和條件；研究者是否在廣泛收集數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上精心設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)方案；肯定沒有其他替代方法或更好的選擇；使用了最少的動物和最合適的動物種類；動物被飼養(yǎng)在較好的環(huán)境中；使用了合適的麻醉、鎮(zhèn)痛方式；對實(shí)驗(yàn)動物的處置方法恰當(dāng)?shù)鹊?。倫理委員會有跟蹤審查的責(zé)任和權(quán)力，對所有批準(zhǔn)的項(xiàng)目進(jìn)行監(jiān)督檢查。作者在匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心工作期間，實(shí)驗(yàn)室被特別批準(zhǔn)有飼養(yǎng)小鼠與制作小鼠動物模型的權(quán)利。匹茲堡大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心每周派專人到實(shí)驗(yàn)室檢查動物飼養(yǎng)與使用情況，并利用“哨兵鼠”每月檢查小鼠飼養(yǎng)環(huán)境是否合格。如發(fā)現(xiàn)有異常情況，他們立即反饋。因此，實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人及所有實(shí)驗(yàn)人員，人人都自覺遵守動物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定，否則倫理委員會有權(quán)暫?；蚪K止實(shí)驗(yàn)。一旦被停止動物實(shí)驗(yàn)，這個實(shí)驗(yàn)室在3～4年后才有權(quán)利再次申請動物實(shí)驗(yàn)，手續(xù)繁瑣且時間長。可見，美國動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的審查與跟蹤不是只停留在制度和形式上，而是在保護(hù)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理中發(fā)揮真正有效的作用。

4 展 望

在醫(yī)學(xué)研究飛速發(fā)展的今天，新的藥物和食物不斷研制成功，新的毒物或潛在的毒物也在不停的產(chǎn)生。為了確保人類的健康與安全，研究者需要通過活體動物模型對藥物、毒物，營養(yǎng)物等在體內(nèi)的代謝、生理和病理作用進(jìn)行動態(tài)連續(xù)觀察，以探索人類疾病的發(fā)病機(jī)理、藥物的作用機(jī)制、疾病預(yù)防的效果等。由于小鼠與人類基因的同源性及其研究價格的低廉，利用小鼠制作活體顯微外科手術(shù)模型將成為一種趨勢，在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中必將得到廣泛應(yīng)用。但在進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)的過程中必須充分考慮實(shí)驗(yàn)動物的福利倫理關(guān)懷。不能因?yàn)閯游飳?shí)驗(yàn)對生物醫(yī)學(xué)的重要性而不受生命倫理學(xué)的監(jiān)督和限制，當(dāng)然，也不能因?yàn)閯游锏母＠麄惱矶耆箘游飳?shí)驗(yàn)。在創(chuàng)造良好的實(shí)驗(yàn)倫理環(huán)境下，讓生物醫(yī)學(xué)研究與倫理道德文明同步、協(xié)調(diào)和諧發(fā)展。

為做到科學(xué)、人道地實(shí)驗(yàn)，應(yīng)充分利用已有的數(shù)據(jù)，優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)程序、技術(shù)和方法，避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在符合科學(xué)的前提下盡可能使用替代方法，減少活體動物的使用。整個實(shí)驗(yàn)應(yīng)確保用最少的動物獲得最多的科學(xué)研究結(jié)果。

有專家建議[16]，國家相關(guān)部門應(yīng)該盡快將分散在各單位、課題組和個人手中的大量的動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集起來，運(yùn)用現(xiàn)代信息處理技術(shù)分門別類地進(jìn)行整理、加工、存儲和開發(fā)利用，建立實(shí)驗(yàn)動物資源數(shù)據(jù)庫，通過網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的資源共享，以避免不必要的動物實(shí)驗(yàn)，減少實(shí)驗(yàn)動物的使用數(shù)量。

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Ethical Welfare Care during Preparation and Application of a Microsurgical Vascular Catheter Model in Mice

GUYuan-liang,ZHOUQi,LINXia-lu,WANGXin,ZHOUFei,ZHAOJin-shun,ZOUBao-bo

(Medical School of Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Microsurgical vascular catheterization is a widely used experimental mouse model in biomedical research. It is much closer to the actual human conditions than the in vitro experiments. However, during preparation and application of this animal model, ethical welfare concerns should be fully taken into consideration. In this paper, how to ensure the animals to get full ethical welfare care during the preparation and application of the model is discussed. The aim of this paper includes improving animal ethical welfares and ensuring a proper application of microsurgical vascular catheter model in the biomedical field.

vascular catheter model; ethical welfare care; mice; microsurgery

2015-03-15

國家自然科學(xué)基金(81273111);寧波市科技項(xiàng)目(2012C5019)

谷元亮(1989-)，男，安徽馬鞍山人，碩士生，主要研究方向：勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)。 E-mail: gurice@yeah.net

鄒寶波(1962-)，女，山東海陽人，副主任技師，主要研究方向：實(shí)驗(yàn)動物與管理。

Tel.:0574-87609599; E-mail: zoubaobo@nbu.edu.cn

R 332; R 052

A

1006-7167(2016)01-0271-04