薛鵬舉，敖俊，趙利濤，郭明柯，呂海文，姬文慧，黃歡歡

（1.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科，河南 洛陽(yáng) 471000；2.遵義醫(yī)學(xué)院脊柱外科，貴州 遵義 563003；3.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471000；4.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，河南 洛陽(yáng) 471000）

臨床論著

人髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)及凍存的實(shí)驗(yàn)研究*

薛鵬舉1，敖俊2，趙利濤1，郭明柯1，呂海文1，姬文慧3，黃歡歡4

（1.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科，河南 洛陽(yáng) 471000；2.遵義醫(yī)學(xué)院脊柱外科，貴州 遵義 563003；3.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471000；4.河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，河南 洛陽(yáng) 471000）

目的研究頸椎手術(shù)所取髓核組織培養(yǎng)髓核細(xì)胞的可行性，適合作為種子的代次，凍存復(fù)蘇是否影響其傳代。方法測(cè)量傳1～5代次髓核細(xì)胞免疫組織化學(xué)法照片光密度（OD）值，觀察胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白含量的差異。通過(guò)噻唑藍(lán)（MTT）試驗(yàn)觀察凍存（實(shí)驗(yàn)組）與未凍存（對(duì)照組）髓核細(xì)胞增殖活力的差異。通過(guò)免疫組織化學(xué)法觀察凍存對(duì)髓核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白含量的影響。結(jié)果①采用酶消化法可成功分離并培養(yǎng)出人髓核細(xì)胞，傳1、2代細(xì)胞形態(tài)呈短梭型、三角形或多邊形，傳3代以后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭型。②Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)法測(cè)OD值，傳1與2代比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)法測(cè)得OD值與對(duì)照組細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞MTT比色法測(cè)OD值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論①經(jīng)頸椎手術(shù)取得的髓核組織，可體外培養(yǎng)出髓核細(xì)胞，并可獲得傳代細(xì)胞。②傳1、2代髓核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白含量差異較小，細(xì)胞形態(tài)分化不明顯，適宜做髓核組織工程學(xué)種子細(xì)胞。③凍存復(fù)蘇處理未能使髓核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白含量減少，細(xì)胞增殖活力亦未降低。

髓核細(xì)胞；組織工程學(xué)；種子細(xì)胞；Ⅱ型膠原蛋白

腰腿痛的發(fā)病率正在不斷增高，現(xiàn)階段認(rèn)為腰腿痛由椎間盤(pán)退行性變引起[1]。椎間盤(pán)退行性變存在高致殘率[2-3]。髓核細(xì)胞數(shù)降低、胞質(zhì)Ⅱ型膠原蛋白降低是椎間盤(pán)退行性變重要原因[4]。傳統(tǒng)治療方法可能造成椎間不穩(wěn)、椎體間植骨不融合、醫(yī)源性脊髓神經(jīng)根損傷等后果[5]，而且治療費(fèi)用對(duì)社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，組織工程學(xué)方法有望用于針對(duì)椎間盤(pán)退行性變的臨床治療[7]，椎間盤(pán)組織工程學(xué)日益成為研究熱點(diǎn)[8]。大量髓核細(xì)胞作為種子細(xì)胞是科研及臨床的必要條件[9]。但現(xiàn)階段多使用脊柱側(cè)凸矯形術(shù)中切除的椎間盤(pán)，來(lái)源有限。腰椎間盤(pán)突出癥患者雖較為常見(jiàn)，但患者年齡偏大，椎間盤(pán)內(nèi)髓核組織存在老化及髓核細(xì)胞數(shù)量較少，體外培養(yǎng)困難。筆者發(fā)現(xiàn)臨床因創(chuàng)傷引起的頸椎骨折患者較多，許多患者選擇頸椎前路椎體次全切椎間植骨融合手術(shù)術(shù)式進(jìn)行治療。本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法對(duì)所獲椎間盤(pán)髓核組織進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 人髓核細(xì)胞來(lái)源

選取2013年5月-2013年12月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科病區(qū)明確診斷為頸椎骨折，自愿選擇頸椎前路椎體次全切椎間植骨融合手術(shù)術(shù)式并具備手術(shù)指證的患者，年齡≤45歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能異常者；②肝炎、梅毒、艾滋病患者；③因腫瘤、結(jié)核等原因引起的病理性骨折。受試者知情同意后，頸椎前路手術(shù)中，用生理鹽水濕潤(rùn)紗布，包裹術(shù)中取出頸椎間盤(pán)髓核組織，放入無(wú)菌標(biāo)本袋中，采集標(biāo)本后30 min內(nèi)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

F12-達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）（美國(guó)Hyclone公司），磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）粉劑（北京中彬金橋公司），胰蛋白酶粉劑（北京索萊寶公司），Ⅱ型膠原蛋白酶粉劑（美國(guó)Sigma公司），4%多聚甲醛（北京博奧森生物工程有限公司），TritionⅩ-100（北京索萊寶公司），鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體濃縮液（北京中彬金橋公司），免疫組織化學(xué)法試劑盒（北京中彬金橋公司），雙花扁豆凝集素顯色試劑盒（dolichos bifows agglutinin，DBA）（北京中彬金橋公司）；Clearmont封片劑（北京中彬金橋公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人頸椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的取材與體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)人員與納入的患者溝通，簽訂同意書(shū)。全身麻醉下X線C臂定位傷椎平面。常規(guī)消毒鋪巾，術(shù)者顯露至病椎臨近椎間盤(pán)，撐開(kāi)釘固定椎間盤(pán)臨近椎體并適當(dāng)撐開(kāi)，尖刃刀切開(kāi)椎間盤(pán)，髓核鉗夾出椎間盤(pán)纖維環(huán)及髓核組織，將組織用無(wú)菌生理鹽水紗布包裹，放入無(wú)菌的標(biāo)本袋內(nèi)，交予實(shí)驗(yàn)人員。于30 min內(nèi)運(yùn)至細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序。用0.01 mol等滲PBS溶液反復(fù)沖洗術(shù)中所得組織表面血液，剪除纖維環(huán)，以及與髓核組織的交界組織，再用PBS反復(fù)沖洗髓核組織。將洗凈的髓核組織置于無(wú)菌彎盤(pán)內(nèi)，并剪成小塊，體積約為1 mm3；用0.25%胰蛋白酶溶液3 ml，37℃消化20min。加入含胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的完全培養(yǎng)基3 ml，使胰蛋白酶的消化停止，5000r/min離心5min，倒除上清液。加入0.2%濃度的Ⅱ型膠原酶溶液3 ml，于37℃下消化4 h后終止消化，通過(guò)120目不銹鋼網(wǎng)篩獲得濾液，1 000 r/min離心5min，倒除上清液。PBS溶液懸浮細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，倒除上清液，加入2 ml完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。取19μl懸浮細(xì)胞液，加入1μl 4%臺(tái)盼蘭染液，常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡中計(jì)數(shù)。用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，調(diào)整密度為2×104個(gè)/ml時(shí)，將其移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。將培養(yǎng)瓶放置在孵箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃、5%二氧化碳CO2。5 d后為細(xì)胞第1次換液，此后每隔1 d換液1次，并在倒置相差顯微鏡鏡下觀察髓核細(xì)胞狀況。用0.25%胰蛋白酶溶液消化貼壁率＞80%的髓核細(xì)胞進(jìn)行傳代。將原代細(xì)胞、傳2及傳4代細(xì)胞以1× 104個(gè)/ml為密度移入24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得傳1代、傳3代和傳5代髓核細(xì)胞，于37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日消化3孔細(xì)胞。分別在第1～7天時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)髓核細(xì)胞計(jì)數(shù)，并據(jù)此繪制傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。每日于倒置相差顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞培養(yǎng)情況，對(duì)處于傳代后生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的髓核細(xì)胞進(jìn)行于倒置相差顯微鏡拍照。

1.3.2 Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)法鑒定在6孔培養(yǎng)板的每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)放入蓋玻片，將傳1代細(xì)胞以2×104個(gè)/ml為密度培養(yǎng)，制備為傳2代細(xì)胞爬片，隔1 d換液，每日觀察培養(yǎng)的髓核細(xì)胞。細(xì)胞爬片以髓核細(xì)胞貼比率至30%為宜，用預(yù)彎的注射器針頭挑出爬片。滴加4%多聚甲醛覆蓋玻片，10 min后細(xì)胞爬片固定完畢。滴加2%TritionⅩ-100溶液，于37℃破膜10 min。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法染色試劑盒中山羊血清對(duì)髓核細(xì)胞爬片進(jìn)行封閉，37℃條件下進(jìn)行封閉10 min；加入經(jīng)稀釋后的一抗工作液，以使鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體與爬片上Ⅱ型膠原蛋白特異性結(jié)合，放置在4℃冰箱中，進(jìn)行孵育過(guò)夜。加入免疫組織化學(xué)法染色試劑盒中辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體工作液，37℃孵育15 min。使用DBA顯色試劑盒中稀釋后的DBA工作液，添加至液體覆蓋細(xì)胞爬片靜置15 min，滴加蘇木素染液靜置2 min，加入Clearmont進(jìn)行封片處理。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察染色情況，并每張爬片上隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行拍照，胞質(zhì)被染為黃棕色的細(xì)胞為髓核細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇將原代髓核細(xì)胞按是否做凍存復(fù)蘇處理分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于-80℃冰箱中凍存2周后復(fù)蘇，繼續(xù)置于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，此時(shí)細(xì)胞為傳1代髓核細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞為未經(jīng)凍存復(fù)蘇的原代髓核細(xì)胞，繼續(xù)置于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2周后傳代，此時(shí)細(xì)胞為傳1代細(xì)胞。將兩組細(xì)胞分別制備成傳2代髓核細(xì)胞的細(xì)胞爬片，測(cè)量免疫組織化學(xué)法的平均光密度（optical density，OD）值；將兩組細(xì)胞以1×104個(gè)/ml分別培養(yǎng)到96孔培養(yǎng)板中，應(yīng)用噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]比色法在酶標(biāo)儀中測(cè)OD值。消化離心原代髓核細(xì)胞，應(yīng)用1ml細(xì)胞凍存液稀釋髓核細(xì)胞，以1×106個(gè)/ml為密度移入凍存管內(nèi)，在4℃、-20℃先后保存2 h后，置于-80℃冰箱冷凍保存。將實(shí)驗(yàn)組凍存的原代髓核細(xì)胞從-80℃冰箱迅速取出，并立即使用37℃水浴鍋進(jìn)行快速?gòu)?fù)蘇。待完全解凍后，將細(xì)胞以1× 104個(gè)/ml培養(yǎng)在25 cm2培養(yǎng)瓶中，可得到傳1代髓核。對(duì)照組細(xì)胞置于CO2孵箱中繼續(xù)傳代培養(yǎng)得到傳1代髓核細(xì)胞。處理后，將兩組分別制備傳2代細(xì)胞爬片，應(yīng)用Ⅱ型膠原蛋白為目的蛋白，行免疫組織化學(xué)法進(jìn)行顯色。將兩組細(xì)胞以1×104個(gè)/ml分別培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，用MTT比色法測(cè)傳2代細(xì)胞增殖活力。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量平均每個(gè)髓核細(xì)胞OD值。在Image-Pro Plus 6.0軟件中打開(kāi)免疫組織化學(xué)法顯色后的照片。在校準(zhǔn)選項(xiàng)中選擇強(qiáng)度選擇標(biāo)準(zhǔn)OD曲線，在分割中吸取細(xì)胞內(nèi)黃棕色區(qū)域，在測(cè)量指標(biāo)選項(xiàng)中選擇平均OD值，查看選項(xiàng)中點(diǎn)擊統(tǒng)計(jì)得出的平均OD值。分別測(cè)量傳1～5代的髓核細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)法照片中髓核細(xì)胞的OD值；分別測(cè)量?jī)山M傳2代細(xì)胞爬片髓核細(xì)胞的OD值。

1.3.4 MTT比色法測(cè)OD值MTT比色法檢測(cè)兩組傳2代細(xì)胞的增殖能力。兩分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，完全培養(yǎng)基稀釋至1×104個(gè)/ml濃度的髓核細(xì)胞懸液。以每孔100μl細(xì)胞懸液用移液器培養(yǎng)在96孔的培養(yǎng)板中，置于CO2孵箱，以37℃、5%CO2為條件培養(yǎng)，每日換液，換液時(shí)每孔加完全培養(yǎng)基150μl。培養(yǎng)48 h后，單個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)添加20μl MTT工作液。以37℃、5%CO2為條件孵箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。用移液器吸凈各孔培養(yǎng)液，并避免將培養(yǎng)孔底部形成的結(jié)晶吸出，單個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)打入150μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）液。使用搖床調(diào)整為低速狀態(tài)下，進(jìn)行震蕩大約10 min，溶解培養(yǎng)孔底部結(jié)晶物質(zhì)。應(yīng)用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)條件下，測(cè)各孔OD值，記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同代次的OD值比較，用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法；兩組標(biāo)本密度值和OD值的比較，用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核細(xì)胞鑒定

細(xì)胞形態(tài)呈短梭形或多邊形，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)散在深色顆粒，細(xì)胞核較大形態(tài)明顯（見(jiàn)圖1A）。采用Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)法對(duì)傳2代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，胞內(nèi)顯色為黃棕色為陽(yáng)性，證實(shí)是髓核細(xì)胞（見(jiàn)圖1B），設(shè)置同代次未添加一抗鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體的細(xì)胞爬片作陰性對(duì)照（見(jiàn)圖1C）。

圖1 髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及免疫組織化學(xué)法鑒定（倒置相差顯微鏡及免疫組織化學(xué)法染色）

2.2 原代髓核細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)

酶消化法獲得的原代細(xì)胞，需5 d才能觀察到極少細(xì)胞的貼壁現(xiàn)象（見(jiàn)圖2A）。但因?yàn)橘N壁量少，使獲得的傳代和增殖的細(xì)胞種類(lèi)純凈。第9天后細(xì)胞增殖迅速（見(jiàn)圖2B），15 d細(xì)胞整體貼壁率＞80%，局部細(xì)胞聚集（見(jiàn)圖2C）。由傳代髓核細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖可見(jiàn)，傳代后第5天正處于細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，故取第5天的髓核細(xì)胞拍照觀察其形態(tài)學(xué)特征，且當(dāng)髓核細(xì)胞持續(xù)傳代使代次增加，其生長(zhǎng)速度將變慢。傳1、3和5代細(xì)胞較原代髓核細(xì)胞貼壁速度加快，1 d以內(nèi)可以貼壁。形態(tài)學(xué)上傳1代髓核細(xì)胞尚無(wú)形態(tài)變化，仍呈短梭形（見(jiàn)圖2D）。部分傳3代髓核細(xì)胞形態(tài)由短梭形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形（見(jiàn)圖2E）。傳5代髓核細(xì)胞長(zhǎng)梭形細(xì)胞大量出現(xiàn)，胞質(zhì)區(qū)域變小，增殖緩慢（見(jiàn)圖2F）。

圖2 原代與傳代髓核細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)（倒置相差顯微鏡×100）

2.3 不同代次髓核細(xì)胞的OD值

不同代次髓核細(xì)胞的OD值比較，經(jīng)SNK法檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.745，P=0.000）。傳1與傳2代之間髓核細(xì)胞OD值接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.192），傳3、4和5代之間髓核細(xì)胞OD值接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.411）。見(jiàn)附表和圖3。

附表不同代次髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白含量比較（n=30±s）

附表不同代次髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白含量比較（n=30±s）

組別Ⅱ型膠原蛋白傳1代0.195±0.075傳2代0.181±0.060傳3代0.143±0.081傳4代0.123±0.064傳5代0.113±0.048

圖3 不同代次髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白含量OD值比較（±s）

2.4 凍存復(fù)蘇處理對(duì)髓核細(xì)胞的影響

2.4.1 凍存復(fù)蘇處理后細(xì)胞與未處理細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較未凍存復(fù)蘇的傳1代細(xì)胞生長(zhǎng)呈短梭形或多邊形（見(jiàn)圖4A）；用倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)凍存復(fù)蘇后的髓核細(xì)胞形態(tài)仍呈短梭形或多邊形（見(jiàn)圖4B）。復(fù)蘇后的細(xì)胞與未凍存復(fù)蘇的髓核細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)比較，無(wú)明顯變化。

圖4 凍存復(fù)蘇處理后細(xì)胞較未處理的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較（倒置相差顯微鏡×100）

2.4.2 MTT比色法檢測(cè)的OD值凍存復(fù)蘇處理的與未凍存復(fù)蘇處理的髓核細(xì)胞OD值接近，實(shí)驗(yàn)組OD值為（0.180±0.045），對(duì)照組細(xì)胞OD值為（0.182±0.048），兩組增殖能力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.133，P=0.895）。

2.4.3 免疫組織化學(xué)法顯色的OD值凍存復(fù)蘇處理與未凍存復(fù)蘇處理的髓核細(xì)胞OD值接近，實(shí)驗(yàn)組OD值為（0.172±0.070），對(duì)照組細(xì)胞OD值為（0.183±0.071），兩組胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.499，P=0.620）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)頸椎前路手術(shù)取得的髓核組織，可體外培養(yǎng)出的髓核細(xì)胞，并可獲得傳代細(xì)胞。傳1、2代髓核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白含量差異較小，細(xì)胞形態(tài)分化不明顯，可能適宜做髓核組織工程學(xué)研究的種子細(xì)胞。凍存復(fù)蘇處理未能使髓核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白含量減少，細(xì)胞增殖活力亦未降低。

目前，治療椎間盤(pán)退變方法包括牽引等非手術(shù)保守治療，以及椎間盤(pán)摘除術(shù)、椎間融合術(shù)等手術(shù)治療。近來(lái)來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究集中在采用組織工程學(xué)技術(shù)直接修復(fù)髓核，使椎間盤(pán)退行性變逆轉(zhuǎn)。MEISEL等[10]成功延遲椎間盤(pán)退行性變進(jìn)程。研究兔源性髓核細(xì)胞移植的WATANABE等[11]發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞移植可以使退變的椎間盤(pán)恢復(fù)同種異體椎間盤(pán)高度。髓核細(xì)胞合成Ⅱ型膠原蛋白能力下降，是椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)變化和功能減退的關(guān)鍵[12]。IWASHINA等[13]使用腺病毒SV40改善髓核組織內(nèi)蛋白成分。然而，椎間盤(pán)種子細(xì)胞尤其是人髓核細(xì)胞培養(yǎng)較為困難[14]。髓核細(xì)胞本身在培養(yǎng)過(guò)程中，常常出現(xiàn)過(guò)早過(guò)多的老化現(xiàn)象[15]。髓核細(xì)胞從細(xì)胞分類(lèi)上其實(shí)是一種類(lèi)軟骨細(xì)胞[16]。若持續(xù)傳代則出現(xiàn)纖維樣變，與原代細(xì)胞形態(tài)相差較大[17]。利用間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的特性，可能培養(yǎng)出大量的類(lèi)似髓核細(xì)胞特征的細(xì)胞。韋葛堇等[18]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)具備這一特性。而即使在非接觸共培養(yǎng)的條件下，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞也有向髓核細(xì)胞分化的潛能[19]。方煌等[20]應(yīng)用脂肪源性干細(xì)胞培養(yǎng)出椎間盤(pán)細(xì)胞。本研究成功從頸椎骨折且需頸椎前路手術(shù)患者的椎間盤(pán)組織提取分離出髓核細(xì)胞，一定程度上解決髓核組織來(lái)源匱乏的問(wèn)題。該類(lèi)組織來(lái)源的患者年齡不高，未發(fā)生椎間盤(pán)退行性變，髓核組織內(nèi)髓核細(xì)胞量較多，且未發(fā)生髓核細(xì)胞的過(guò)度老化，仍有較強(qiáng)的增殖能力，具備合成和分泌Ⅱ型膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的能力。張榮峰等[21]用MTT比色法測(cè)不同代次髓核細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)傳3代以后的髓核細(xì)胞的增殖能力明顯下降。但未有文獻(xiàn)對(duì)人各傳代代次髓核細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。凍存是否影響髓核細(xì)胞增殖及Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)亦未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)比較不同代次體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞免疫組織化學(xué)法測(cè)得OD值的差異，可見(jiàn)傳1、2代可用于做椎間盤(pán)組織工程學(xué)研究的種子細(xì)胞。凍存復(fù)蘇處理并不能改變髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、增殖活力及Ⅱ型膠原蛋白合成能力，可以正常傳代，為椎間盤(pán)組織工程學(xué)優(yōu)良種子細(xì)胞提供更廣的來(lái)源，并為其存儲(chǔ)方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)于髓核細(xì)胞的研究需要進(jìn)一步完善的地方還有很多，如依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，涉及髓核細(xì)胞鑒定部分采用Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學(xué)法進(jìn)行鑒定[22]。該方法雖然簡(jiǎn)便可靠，但是鑒定方法單一，有關(guān)髓核細(xì)胞的其他鑒定方法本身就是一個(gè)課題。除本文討論部分提及的與干細(xì)胞共培養(yǎng)的基礎(chǔ)研究方向，臨床上還可以在倫理學(xué)許可基礎(chǔ)上，使用干細(xì)胞經(jīng)椎間孔鏡入路植入椎間盤(pán)等方法，嘗試治愈椎間盤(pán)突出等疾病。所以髓核細(xì)胞相關(guān)科學(xué)研究及臨床試驗(yàn)有著廣闊的空間。

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（童穎丹 編輯）

Culture of human nucleus pulposus cellsin vitro and cryopreservation*

Peng-ju Xue1,Jun Ao2,Li-tao Zhao1,Ming-ke Guo1, Hai-wen Lyu1,Wen-hui Ji3,Huan-huan Huang4
(1.The First Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471000,China;2.Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,China;3. Department of Anesthesiology;4.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471000,China)

Objective To search for the best generation of the nucleus pulposus cells suitable as seed cells in tissue engineering,which come from the nucleus pulposus tissues of anterior cervical operation,and study the effects of cryopreservation and recovery process on typeⅡcollagen synthesis and proliferation of nucleus pulposus cells.Methods The mean optical density of the first,second,third,fourth and fifth generations of nucleus pulposus cells in immunohistochemical staining photographs was measured,so as to observe the difference between typeⅡcollagen content in cytoplasm.The primary nucleus pulposus cells were divided into groups A and B.The cells in the group A were frozen and the cells of the group B were not cryop－reserved.The proliferation activity of the nucleus pulposus cells in the group A and the group B was measured by MTT method and compared.The mean optical density values of immunohistochemical staining photos of the nucleus pulposus cells in the groups A and B were measured.Results Using enzyme digestion method, human nucleus pulposus cells were successfully extracted from the human nucleus pulposus tissues obtained from anterior cervical operation and cultured.The first and second generation cells were short fusiform,triangle or polygon.After the cells passaged to the third generation,they became spindle.The mean optical density of the first generation and the second generation of nucleus pulposus cells had no significant difference in the typeⅡcollagen immunohistochemical staining(P＞0.05).There was no obvious statistical difference in the mean optical density of typeⅡcollagen between the two groups(P＞0.05).There was no significant difference in optical density of MTT assay between the groups A and B(P＞0.05).Conclusions The cells of the human nucleus pulposus tissues obtained from anterior cervical operation could be culturedin vitroand passaged cells could be obtained.The first and the second generations of nucleus pulposus cells have little difference in the content of intracellular typeⅡcollagen and unobvious cell morphological differentiation,and could act as seed cells of nucleus pulposus tissue engineering.The cryopreservation and recovery processing could not reduce the content of typeⅡcollagen in the cytoplasm or cell proliferation.

nucleus pulposus cell;tissue engineering;seed cell;typeⅡcollagen

R681.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.011

1005-8982（2016）23-0053-06

2015-12-14

貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金（No：黔科合J字20102179號(hào)）

敖俊，E-mail：ao00jun@163.com，Tel：13984989345