溫先勇，唐敏，鄧正華，李寶林

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 瀘州 646000）

臨床論著

中國西南三地HCV基因型的分布及臨床特征

溫先勇，唐敏，鄧正華，李寶林

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 瀘州 646000）

目的了解丙型肝炎病毒（HCV）基因型在四川（川）、云南（滇）、貴州（黔）等中國西南地區(qū)漢族丙型肝炎患者中的分布及臨床特征，為丙型肝炎的防治提供依據(jù)。方法對(duì)221例來自川、滇、黔地區(qū)的丙型肝炎患者，采用焦磷酸測序法進(jìn)行HCV基因分型并分析不同基因型丙型肝炎致病性的差異。結(jié)果①216例HCVRNA陽性的丙肝患者被成功分型，共發(fā)現(xiàn)1、2、3、6等4種常見基因型和1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a等7種常見基因亞型，其所占比例為：1a型5.1%（11/216）、1b型36.1%（78/216）、2a型3.7%（8/216）、2b型0.9%（2/216）、3a型7.4%（16/216）、3b型27.8%（60/216）、6a型17.1%（37/216），此外，還發(fā)現(xiàn)其他少見亞型（4a/6n）共4例，占1.9%（4/216）。②川、滇、黔分布前3位的基因亞型分別是3b、1b、6a和3b、1b、2a/3a及1b、6a、3b；男、女患者比例最高的亞型分別是3b（33.1%）和1b（48.3%）；＞40歲患者以1b（39.8%）、3b（18.6%）、6a（15.9%）為主；＜40歲患者以3b（37.9%）、1b（32.1%）、6a（18.4%）為主；感染方式以輸血（血制品）40.1%為主，其他及不明原因者也占較大比例（33.8%）。③急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、丙肝后肝硬化和肝癌4種臨床類型的丙型肝炎均以1b型比例最高，其次是3b、6a型；1b型患者的HCV載量及肝功能損害指標(biāo)均高于其他亞型患者（P＜0.05）。結(jié)論川、滇、黔等中國西南部地區(qū)HCV-RNA陽性的漢族HCV感染者以1b、3b、6a為優(yōu)勢基因，且呈多樣化分布；HCV載量較高的1b亞型，可能更容易導(dǎo)致患者肝功能的損害以及丙型肝炎的慢性化、肝臟的纖維化和癌變。

丙型肝炎病毒；基因型；臨床特征；焦磷酸測序

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是僅次于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一。由于HCV復(fù)制所依賴的聚合酶缺乏校對(duì)功能，其基因組序列容易發(fā)生變異而呈現(xiàn)高度的異質(zhì)性。研究人員依據(jù)HCV基因組核苷酸序列的差異，將HCV分為6種基因型大約80余種亞型[1-2]，其分布與種族、地域、性別、年齡及感染方式等多種因素有關(guān)，且各基因型引起的丙型肝炎其臨床表現(xiàn)和轉(zhuǎn)歸也存在較大的差異，因此，對(duì)丙型肝炎的預(yù)防和治療都有重要價(jià)值。瀘州地處四川（川）、云南（滇）、貴州（黔）三地結(jié)合部，患者來源廣泛，本文采用焦磷酸測序法對(duì)來自我國西南地區(qū)的川、滇、黔三地共221例不同臨床類型的漢族丙型肝炎患者進(jìn)行HCV基因分型，并比較不同亞型之間的臨床差異，旨在為丙型肝炎的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年8月-2016年5月本院就診的門診和住院患者，包括四川（163例）、云南（25例）、貴州（33例）漢族丙型肝炎患者共計(jì)221例，完成分型216例。其中，男性127例，女性89例；年齡13～76歲，平均（49.26±15.43）歲，均符合2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。包括急性丙型肝炎6例，慢性丙型肝炎149例，丙型肝炎后肝硬化37例，丙肝后肝癌24例，排除其他型別的病毒性肝炎及其他導(dǎo)致肝臟病變的疾病，分型前所有患者未接受過抗病毒治療。

1.2 主要儀器、試劑

1.2.1 標(biāo)本處理清晨空腹采集患者EDTA-K2抗凝靜脈血5 ml，2 h內(nèi)室溫3 300 r/min離心，分離血漿，置入-70℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。

1.2.2 HCV-RNA檢測①HCV-RNA提?。喝?.2.1備檢血漿200 μl，采用柱式提取法在QIA cube核酸提取儀上進(jìn)行（德國QIAGEN公司），試劑由廣東深圳凱杰生物工程有限公司提供。②HCVRNA擴(kuò)增：采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司）上進(jìn)行患者HCV-RNA擴(kuò)增，試劑盒由廣東深圳凱杰生物工程有限公司提供，每次實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置陰性、臨界陽性、強(qiáng)陽性對(duì)照和低值、高值質(zhì)控。③HCV基因測序和分型：采用德國QIAGEN公司Pyro-Mark Q24型焦磷酸測序-遺傳分析系統(tǒng)對(duì)HCV-RNA檢測結(jié)果＞5×104IU/ml的標(biāo)本進(jìn)行基因測序和分型：將②操作中的擴(kuò)增產(chǎn)物在Pyro-Mark Q24序列分析儀上測序，再用Pyro-Mark Q24分析軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)基因型的堿基序列比較，獲取被檢樣品的基因型別。所有試劑均由QIAGEN公司提供，操作按說明書進(jìn)行。④肝功能檢測：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl endopeptidase，GGT）等肝功能指標(biāo)在AVDIA 2400生化分析儀上測定，儀器和試劑均由德國Siemens公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，若方差齊則用LSD-t檢驗(yàn)作兩兩比較，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 221例HCV基因分型結(jié)果

221例HCV-RNA濃度＞5.0 E+04 IU/ml標(biāo)本中，有216例完成分型（5例未能分型者：川4例，黔1例），各種基因分型比例從高到低依次為1b型36.1%（78例）、3b型27.8%（60例）、6a型17.1%（37例）、3a型7.4%（16例）、1a型5.1%（11例）、2a型3.7%（8例）、2b型0.9%（2例），前3種基因型占到總數(shù)的81.0%。其他少見類型包括：4a/6n等共4例（1.9%）。

2.2 川、滇、黔三地HCV基因分型結(jié)果

川、滇、黔三地基因亞型分別有8、6和5種，比例最高基因亞型分別是1b、3b、6a和3b、1b、2a/3a及1b、6a、3b。1b、3b、6a 3種優(yōu)勢基因亞型在川、滇、黔三地分布比較經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.953、1.374和4.257，P=0.146、0.502和0.132）。見表1。

表1 川、滇、黔HCV基因分型結(jié)果比較例（%）

2.3 性別、年齡、感染方式與基因型的關(guān)系

在216例HCV患者中，男性患者3b比例最高（33.1%），其次是1b型（27.6%）和6a型（18.8%）；女性患者1b比例最高（48.3%），其次是3b型（20.2%）和6a型（14.7%）。1b、3b亞型在不同性別組比較經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.771和4.304，P= 0.000和0.036），6a亞型性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.679，P=0.438）。見表2。

表2 性別與HCV基因型的關(guān)系例（%）

在＞40歲患者中，以1b（39.8%）、3b（18.6%）、6a（15.9%）為主；而＜40歲患者則以3b（37.9%）、1b（32.1%）、6a（18.4%）為主，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.981，P=0.000），3b亞型＜40歲患者高于40歲以上患者，1b、6a亞型在此年齡分段比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.415和0.021，P=0.239和0.899）。見表3。

表3 年齡與HCV基因型的關(guān)系例（%）

216例患者感染方式以輸血（血制品）為主（40.1%），其他（如手術(shù)、拔牙、紋身、刺眉、性傳播）及未知原因也占較大比例（33.8%）。見表4。

2.4 不同臨床類型丙型肝炎基因分型結(jié)果

216例HCV分型患者中，急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、丙型肝炎肝后肝硬化和肝癌4種臨床類型均以1b型為主，其次是3b、6a型，1b、3b、6a亞型在慢性丙型肝炎、丙型肝炎后肝硬化和丙型肝炎后肝癌的分布比較經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.043、2.614和2.030，P=0.979、0.272和0.397），急性丙型肝炎組例數(shù)太少，未納入統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。見表5。

2.5 HCV患者治療前主要肝功能指標(biāo)比較

216例HCV分型患者經(jīng)方差分析，1、3、6及其他型患者組之間ALT、AST、ALP及GGT等指標(biāo)與HCV-RNA總體均數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 14.632、11.587、15.2951、0.621和7.948，P=0.000），且ALT、AST、ALP、GGT及l(fā)gHCV-RNA等5組資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.892、0.504、0.795、0.741和0.846），采用LSD-t檢驗(yàn)作兩兩比較，1型患者ALT、AST、ALP、GGT及l(fā)g HCV-RNA等指標(biāo)均高于3型（t=11.834、9.662、13.595、9.208和6.947，P= 0.000）、6型（t=10.415、8.351、9.640、8.379和7.132，P= 0.000）及其他型別（t=6.927、5.159、8.474、4.875和4.153，P=0.000）患者，但3、6及其他型別之間肝功能及HCV-RNA濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表6。

表4 感染方式與HCV基因型的關(guān)系例（%）

表5 不同臨床類型丙型肝炎基因分型結(jié)果例（%）

表6 不同基因型的丙型肝炎患者部分臨床指標(biāo)比較（±s）

表6 不同基因型的丙型肝炎患者部分臨床指標(biāo)比較（±s）

基因型ALT/（u/L）AST/（u/L）ALP/（u/L）GGT/（u/L）lg HCV-RNA 1（n=89）69.42±15.0560.16±14.08103.70±24.1356.92±18.256.76±0.77 3（n=76）45.80±14.7941.55±13.6361.32±27.4934.95±14.026.03±0.74 6（n=37）42.54±13.8737.26±16.8167.53±23.1731.23±16.305.75±0.79其他（n=14）41.79±15.3640.57±16.8859.46±21.4135.54±15.015.94±0.73

3 討論

HCV屬于黃病毒科單股正鏈RNA肝炎病毒，基因組序列容易發(fā)生變異，其中基因型和基因亞型最具流行病學(xué)和臨床價(jià)值。國際上通常采用阿拉伯?dāng)?shù)字（1～6）表示基因型，英文小寫字母（如1a、1b等）表示基因亞型[4]。

HCV基因型在不同地域分布存在明顯的差異。文獻(xiàn)顯示，亞洲及我國大部分地區(qū)流行的HCV型別為1b，其次為2a，但近幾年由于流動(dòng)人口和獻(xiàn)血者、涉毒人員等因素，原有基因型分布狀況正迅速發(fā)生改變[5]。研究其分布及其變化、致病規(guī)律，對(duì)丙型肝炎的防治有重要價(jià)值。

筆者采用焦磷酸測序法對(duì)221例丙肝患者進(jìn)行分型，成功分型者有216例，共檢出1、2、3、6共4種常見基因型和1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a共7種基因亞型，另外，檢出了少見的4a型1例及6n型3例，未發(fā)現(xiàn)5型患者；西南地區(qū)的川、滇、黔3地患者總體上以1b型（36.1%，78/216）為主，與全國大部分地域的基因型分布相似[6-8]。但其3b型（27.8%，60/216）和6a型（17.1%，37/216）2型的比例卻遠(yuǎn)高于中國北方及南方一些省市[7-8]，與重慶地區(qū)相似[9]。3地之間優(yōu)勢基因有一定差異：四川和云南均以3b、1b為優(yōu)勢基因，6a和3a次之，貴州以1b、6a為主，3b次之。3b和6a的感染被認(rèn)為與外部人員流動(dòng)和涉毒有關(guān)的亞型[10]，在邊境省份云南及其鄰近的四川等地、男性及＜40歲以下的年輕患者中占有很高的比例；而1b的感染則被認(rèn)為多與輸血（血制品）有關(guān)，在人員流動(dòng)相對(duì)較小的貴州、女性及＞40歲以上的患者中占有比例最高，同時(shí)，四川亞型的種類還呈現(xiàn)較滇、黔兩地更為多樣化的特點(diǎn)。

不同HCV基因型在臨床上的致病性也存在明顯差異。從引起急慢性丙型肝炎、丙型肝炎后肝硬化、肝癌等病變的基因來看，1型（1a、1b）和基因3型（3a、3b）分別占到了83.3%、73.8%、78.4%和87.5%，提示基因1型和基因3型較其他基因型更易導(dǎo)致丙型肝炎的慢性化和患者肝臟纖維化及癌變，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[11]（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果還表明，1b亞型患者體內(nèi)HCV-RNA含量、主要肝功能臟損害指標(biāo)（ALT、AST、ALP、GGT）高于其他亞型（P＜0.05），說明攜帶高濃度的1b亞型HCV，對(duì)肝臟的損害程度大于其他亞型。所以，研究HCV基因型特點(diǎn)可以在了解丙型肝炎的流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床特征、防治等諸多方面發(fā)揮作用。

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（申海菊 編輯）

Distribution and clinical features of HCV genotypes in three areas in southwest China

Xian-yong Wen,Min Tang,Zheng-hua Deng,Bao-lin Li
(Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To study the distribution of hepatitis C virus(HCV)genotypes in the hepatitis C patients of Han nationality in Sichuan,Yunnan and Guizhou so as to provide evidence for prevention and treatment of hepatitis C.Methods HCV in 221 patients were detected by pyrophosphate sequencing method for genotyping,then the differences in pathogenicity of HCV with different genotypes were compared.Results In the 216 HCV-RNA positive patients from Sichuan,Yunnan and Guizhou,there were 4 kinds of genotypes (1,2,3 and 6)and 7 kinds of subgenotypes(1a,1b,2a,2b,3a,3b and 6a).The subgenotypes 1a,1b,2a, 2b,3a,3b and 6a accounted for 5.1%(11/216),36.1%(78/216),3.7%(8/216),0.9%(2/216),7.4%(16/216), 27.8%(60/216)and 17.1%(37/216).In addition,there were 4 cases of rare subtypes(4a/6n),accounting for 1.9%(4/216).The top 3 gene subtypes were 3b,1b and 6a in Sichuan;3b,1b and 2a/3a in Yunnan;and and 1b,6a and 3b in Guizhou respectively.3b(33.1%)and 1b(48.3%)were the main subtypes in the male and female patients respectively;1b(39.8%),3b(18.6%)and 6a(15.9%)were the main subtypes in the patients over 40 years while 3b(37.9%),1b(32.1%)and 6a(18.4%)were the main subtypes in the patients younger than 40 years.The main mode of infection was blood transfusion(40.1%),and other unknown reasonsalso accounted for a large proportion(33.8%).1b was the main subtype in acute hepatitis C,chronic hepatitis C,liver cirrhosis after hepatitis C and liver cancer after hepatitis C,followed by 3b and 6a.In the patients with hepatitis C,the liver function impairment indicators and HCV load of the 1b subtype were significantly higher than those of other gene subtypes(P＜0.05).Conclusions HCV subtype 1b is the most predominant subtype in hepatitis C patients of Han nationality in Sichuan,Yunnan and Guizhou of southwest China.3b and 6a subtypes also occupy a very high proportion;and the distribution of gene subtypes is diversified.1b subgenotype of high HCV load is more likely to cause serious damage of liver function and chronic hepatitis, liver fibrosis and hepatic carcinoma.

hepatitis C virus;genotype;clinical feature;pyrophosphate sequencing

R512.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.009

1005-8982（2016）23-0042-05

2016-07-12