郭守斌

（江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 連云港 222000）

論著

柱前衍生超高效液相色譜法分析太子參多糖中單糖的組成

郭守斌

（江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 連云港 222000）

目的建立柱前衍生超高效液相色譜（UPLC）法，測(cè)定太子參多糖中單糖的組成。方法采用水提醇沉法提取太子參多糖，2 mol/L硫酸水解后加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮進(jìn)行衍生化，采用UPLC法測(cè)定太子參多糖中單糖的衍生物。采用沃特世C18超高效液相色譜柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7μm）色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1 mol/L磷酸鹽（pH 6.8）緩沖液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。通過聚類分析和主成分分析，對(duì)不同產(chǎn)地太子參單糖進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)果太子參多糖由半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸7種單糖組成，不同產(chǎn)地太子參多糖中單糖組成稍有差別，通過主成分分析和聚類分析評(píng)價(jià)，10個(gè)不同產(chǎn)地太子參單糖聚成3類，并按照單糖含量對(duì)各產(chǎn)地進(jìn)行排名。結(jié)論柱前衍生UPLC法表明，太子參多糖主要由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成，并且貴州施秉縣地區(qū)產(chǎn)太子參單糖含量較高。

太子參多糖；柱前衍生化；超高效液相色譜；聚類分析；主成分分析；單糖

Keywords:P.heterophylla polysaccharide;pre-column derivation;ultra performance liquid chromatography;cluster analysis;principal component analysis;monosaccharide

太子參為石竹科植物孩兒參的干燥塊根。性味甘、微苦，平，歸脾、肺經(jīng)。臨床主要用于益氣健脾、生津潤(rùn)肺，用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴、肺燥干咳等癥候[1]。藥理學(xué)研究表明，太子參多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、降糖降脂及保護(hù)肝臟等作用，是太子參的主要有效成分之一[2-3]。太子參多糖為中性葡聚糖，有關(guān)太子參多糖含量測(cè)定的研究很多，主要采用體積排阻高效液相色譜法[4]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[5]及硫酸－苯酚比色法[6-7]，其單糖組成迄今未見報(bào)道，而多糖的單糖組成分析是進(jìn)行多糖質(zhì)量控制和獲取多糖基本信息的重要環(huán)節(jié)。因此，本實(shí)驗(yàn)以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）為衍生物，在堿性條件下與單糖縮合生成單糖-PMP衍生物，應(yīng)用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法，對(duì)太子參多糖進(jìn)行單糖組成方面的研究，并利用主成分分析和聚類分析對(duì)單糖進(jìn)行評(píng)價(jià)，為太子參開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀、Empower色譜工作站購自美國(guó)沃特世公司，DFY-300型搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（江蘇省江陰市康和藥化機(jī)械制造有限公司），TG16-WS離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），ABS-135S電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），KB-500 DB超聲波清洗器（浙江省昆山市超聲儀器有限公司），LGJ-10冷凍干燥機(jī)（北京市松源華興生物技術(shù)有限公司）。

經(jīng)作者鑒定為石竹科植物孩兒參的干燥塊根。D-無水葡萄糖（D-glucose anhydrous，Glu）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，110833-201205，含量為99.5%），D-甘露糖（D-mannose，Man）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，140651-201403，含量為99.6%），D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，GluUA）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，140648-200602），半乳糖（Galactose，Gal）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，100226-201105，含量為99.9%），L-阿拉伯糖（L-Arabinose，Arab）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，1506-200001），D-半乳糖醛酸（α-D-galacturonic acid monohydrate，GalUA）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，111646-200301），鼠李糖（L-rhamnose monohydrate，Rha）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，111683-201502）。乙腈為色譜純，PMP為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水，其他試劑均為分析純。見表1。

表1 太子參樣品來源

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件沃特世C18超高效液相色譜柱（100.0mm×2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），梯度洗脫（0～5 min，10%A；5～15 min，10%～15%A；15～25 min，15%～20%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫30℃；流速0.25 ml/min；進(jìn)樣量2μl。

1.2.2 太子參多糖的提取取太子參（S1-S10）干燥粉末（過四號(hào)篩）各約6 g，精密稱定，加85%乙醇60 ml回流提取3次，3 h/次，提取液棄去，太子參藥渣加50 ml水，水浴回流提取3次，3 h/次，收集提取液，減壓濃縮至約25 ml，用Sevage法除去太子參多糖提取液中蛋白成分后，加乙醇80 ml，靜置過夜，取提取液3 000 r/min離心10 min，棄上清液，反復(fù)離心至上清液無色，沉淀物依次加無水乙醇-乙醚-丙酮洗滌3次，冷凍干燥，得太子參多糖。

1.2.3 溶液的制備①供試品溶液。精密稱取太子參多糖約20mg置安瓿中，加2mol/L硫酸溶液2.0ml，用氮?dú)馀抛呖諝?，封口，置水域中水? h，冷卻至室溫，用4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，用0.45μm微孔濾膜濾過，備用。②混合對(duì)照品溶液。分別取Glu、Man、GluUA、Gal、Arab、GalUA、Rha對(duì)照品各適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 ml分別含Glu1 642μmol/L、Man 1023μmol/L、GluUA682μmol/L、GalUA1568μmol/L、半乳糖1 260μmol/L、Arab 1 888μmol/L、Rha 985 μmol/L的混合對(duì)照品溶液，備用。

1.2.4 衍生化產(chǎn)物的制備精密量取混合對(duì)照品溶液和太子參多糖水解液各200μl置10 ml離心管中，分別依次加入200μl PMP甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH溶液，混合均勻，置70℃水域中反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，分別加入200μl 0.3 mol/L鹽酸溶液中和，充分混勻，加入1 ml氯仿進(jìn)行萃取，充分震蕩混勻，4 000 r/min離心10 min，棄去下層有機(jī)相，重復(fù)萃取3次，合并上層水相，0.45μm微孔濾膜濾過，備用[8]。

1.2.5 方法學(xué)考察①線性關(guān)系和最小檢測(cè)限。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0和10.0 ml，置10 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，充分搖勻，按1.2.4方法衍生化制備，配制系列濃度對(duì)照品混合溶液。按1.2.1色譜條件試驗(yàn)，記錄色譜圖，以對(duì)照品摩爾濃度（X）為橫坐標(biāo)，以色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將最低濃度混合對(duì)照溶液稀釋至信噪比為3時(shí)所對(duì)應(yīng)溶液的摩爾濃度以確定為最低檢測(cè)限（見表2）。②精密度試驗(yàn)。取混合對(duì)照品溶液，按1.2.4方法進(jìn)行衍生，依照1.2.1色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果Glu、Man、Glu UA、Gal、Arab、GalUA、Rha峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.6%、0.4%、0.8%、0.7%、0.6%、0.4%和0.9%，表明儀器精密度良好。③重復(fù)性試驗(yàn)。取太子參（S1）多糖6份，按1.2.3方法制備樣品溶液，再按1.2.4方法進(jìn)行衍生化處理，依照1.2.1色譜條件，依次測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果Glu、Man、GluUA、Gal、Arab、GalUA、Rha峰面積的RSD分別為0.5%、0.7%、0.3%、0.3%、0.2%、0.7%和0.6%，表明方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性試驗(yàn)。取太子參（S1）多糖，按1.2.3方法水解成單糖，再按1.2.4方法進(jìn)行衍生化處理，分別于0、2、4、6、8和12 h測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果Glu、Man、GluUA、Gal、Arab、Gal UA、Rha峰面積的RSD分別為1.2%、1.3%、1.3%、1.6%、0.8%、1.1%和1.6%，表明太子參中單糖衍生物在12 h內(nèi)穩(wěn)定。⑤加樣回收率試驗(yàn)。取已知含量太子參（S1）多糖（約10 mg）6份，精密稱定，置具塞試管中，分別精密加入相當(dāng)樣品含有量的Glu、Man、GluUA、Gal、Arab、GalUA、Rha對(duì)照品，按1.2.3方法水解成單糖，再按1.2.4方法進(jìn)行衍生化處理，依1.2.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果Glu、Man、GluUA、Gal、Arab、GalUA、Rha平均回收率分別為98.6%（RSD 1.0%）、98.9%（RSD 0.9%）、98.8%（RSD 1.2%）、99.1%（RSD 1.2%）、98.4%（RSD 1.0%）、97.8%（RSD 0.9%）和98.8%（RSD 0.6%）。

表27 種單糖衍生物的線性關(guān)系

1.2.6 樣品測(cè)定取不同產(chǎn)地太子參（S1-S10）多糖，按1.2.3方法水解成單糖，再按1.2.4方法進(jìn)行衍生化處理，依1.2.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。采用外表一點(diǎn)法求得各單糖含量，并計(jì)算太子參多糖中Glu、Man、GluUA、Gal、Arab、GalUA、Rha的摩爾比。見圖1和表3。

圖1 對(duì)照品與樣品衍生產(chǎn)物色譜圖

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過聚類分析和主成分分析對(duì)10個(gè)產(chǎn)地太子參多糖中單糖進(jìn)行評(píng)價(jià)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 太子參樣品單糖組成及含量

2 結(jié)果

2.1 主成分分析

將表2數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，以各產(chǎn)地單糖作為變量，利用主成分分析，將7個(gè)單糖進(jìn)行降維，提取出2個(gè)主成分，分析個(gè)主成分主要貢獻(xiàn)單糖種類，并依據(jù)主成分得分對(duì)各產(chǎn)地太子進(jìn)行排名。分析得出的主成分特征值與貢獻(xiàn)率。見圖2和表4。

特征值在某種程度上可以被看成是表示主成分影響力度大小的指標(biāo)，通過表3（方差分解主成分提取分析）和圖2可以看出，主成分3之前連線較為陡峭，即前3個(gè)主成分對(duì)解釋變量的貢獻(xiàn)最大，又有前2個(gè)成分累計(jì)貢獻(xiàn)值達(dá)95.906%，所以提取2個(gè)主成分。從表4可知Man、Gal、Arab、GalUA在第一主成分上有較高載荷（相關(guān)系數(shù)＞0.9），說明第一主成分基本反映這些指標(biāo)的信息；而Glu在第二主成分上有較高載荷。提取2個(gè)主成分基本囊括7個(gè)單糖成分，基本能反映全部指標(biāo)的信息，所以決定用2個(gè)新變量來代替原來的7個(gè)變量開展評(píng)價(jià)。

圖2 主成分分析碎石圖

表4 主成分分析的特征值與方差貢獻(xiàn)率

用每個(gè)產(chǎn)地分別對(duì)應(yīng)于2個(gè)主成分的初始因子載荷值除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值（λ1=4.338，λ2= 2.376）開平方根即可得到每個(gè)指標(biāo)分別對(duì)應(yīng)的2個(gè)主成分的特征向量（特征向量代表各原指標(biāo)對(duì)于主成分的重要程度），將得到的特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，然后就可以推導(dǎo)出2個(gè)主成分表達(dá)式，并可算出主成分綜合模型，利用2個(gè)主成分的表達(dá)式和主成分綜合模式可計(jì)算出太子參個(gè)各產(chǎn)地分值，并按分值大小進(jìn)行排名。見表5。

表5 初始因子載荷矩陣

第一、二主成分對(duì)7個(gè)變量的解釋有＞95%的貢獻(xiàn)值，而Man、Gal、Arab、GalUA、Glu在第二個(gè)主成分上有較高載荷，所以用以上5個(gè)單糖指標(biāo)可以對(duì)太子參多糖進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以看出以產(chǎn)地為福建拓榮縣的太子參較好。見表6。

表6 不同產(chǎn)地太子參單糖得分及排名

2.2 聚類分析

將表2數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，以各產(chǎn)地單糖作為變量，采用組間連接法，選用歐氏距離對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地太子參單糖進(jìn)行聚類分析，可看出其中來自Y福建拓榮縣太子參聚為一類，其他另外2個(gè)產(chǎn)地分別聚為一類，說明同一地區(qū)不同地點(diǎn)太子參，單糖組成及含量有著一定相似度。見圖3。

圖3 太子參單糖聚類分析圖

3 討論

太子參是一種常用又珍貴藥材，有補(bǔ)氣健脾、養(yǎng)陰益血等功效，可作為人參替代品，老少皆宜服用。多糖是其有效成分之一，有調(diào)節(jié)和促進(jìn)機(jī)體免疫力等作用。而UPLC法具有分離效率高、節(jié)能、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，在中藥質(zhì)量分析中運(yùn)用逐漸廣泛。通常多糖水解樣品的制備過程需經(jīng)過復(fù)雜干燥過程，干燥衍生化后氯仿萃取后的水層溶液，揮棄PMP殘留衍生化試劑，以達(dá)到純化單糖衍生物的目的。但在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，PMP溶劑峰出峰時(shí)間明顯早于各單糖衍生物保留時(shí)間，所以制備過程中可以省去干燥過程，用NaOH中和水解液后，直接PMP衍生化處理，幾乎無糖損失，縮短樣品制備時(shí)間，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作。

本研究建立衍生化-UPLC檢測(cè)太子參多糖中單糖組成的方法，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的比對(duì)，對(duì)7個(gè)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，可提供太子參多糖的單糖組成基本信息。本方法簡(jiǎn)單靈敏，操作方便快速，為發(fā)展太子參多糖的在線定性定量UPLC檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)利用太子參產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

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（童穎丹 編輯）

Analysis of monosaccharide composition ofPseudostellaria heterophyllapolysaccharides by pre-column derivatization ultra performance liquid chromatography

Shou-bin Guo
(Department of Pharmacy,the First People's Hospital of Lianyungang, Lianyungang,Jiangsu 222000,China)

Objective To establish a pre-column derivation ultra performance liquid chromatography(UPLC)for determining monosaccharide composition inPseudostellaria heterophyllapolysaccharides.Methods The polysaccharides were extracted by hot distilled water,precipitated by alcohol,and hydrolyzed with 2 mol/L sulfuric acid and derived by 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP).The analysis of monosaccharide composition ofP.heterophyllapolysaccharides was carried out by reversed-phase UPLC on a Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC C18 column(100.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)with a mobile phase composed of 0.1 mol/L phosphate (pH 6.8)and Acetonitrile in a gradient elution manner.The detection wavelength was set at 250 nm.Cluster analysis(CA)and principal component analysis(PCA)were used to evaluateP.heterophyllamonosaccharide in different producing areas.Results TheP.heterophyllapolysaccharides were composed of galactose,D-mannose,rhamnose,arabinose,D-glucose,D-glucuronic acid and D-galacturonic acid.Totally 10 batches ofP. heterophyllapolysaccharides could be classified into three clusters,and the producing areas were sorted based on the content of monosaccharides.Conclusions The UPLC with pre-column derivation shows thatP.heterophyllapolysaccharides mainly consist of galacturonic acid,galactose and arabinose.P.heterophyllaof Shibing County has higher content of monosaccharides.

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.008

1005-8982（2016）23-0037-05

2016-07-14