羅霞，陳明偉

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830000；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710061）

論著

CTR1和ATP7B在人肺腺癌細(xì)胞A549的表達(dá)及其與順鉑耐藥的關(guān)系

羅霞1，陳明偉2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830000；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 西安 710061）

目的探討人肺腺癌細(xì)胞株A549和肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP對順鉑的耐藥機制。方法利用噻唑藍(lán)法檢測順鉑對A549/DDP及其親代細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用和生長曲線的影響，探討A549/DDP細(xì)胞株凋亡敏感性的變化規(guī)律。采用Western blot檢測該細(xì)胞株銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1（CTR1）、銅離子轉(zhuǎn)運磷酸化ATP酶（ATP7B）及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）剪切蛋白表達(dá)，分析A549細(xì)胞對順鉑耐藥與CTR1、ATP7B及PARP剪切蛋白表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果A549/DDP較其親代細(xì)胞株對順鉑引起的細(xì)胞毒性和凋亡敏感性下降；較其親代細(xì)胞株A549/DDP中ATP7B表達(dá)增加，CTR1表達(dá)降低。結(jié)論人肺腺癌細(xì)胞株A549對順鉑耐藥的產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡敏感性降低有關(guān)，且細(xì)胞內(nèi)ATP7B表達(dá)增加，CTR1表達(dá)降低，或可作為細(xì)胞對順鉑的增敏靶點。

順鉑耐藥；肺癌A549細(xì)胞株；銅轉(zhuǎn)運蛋白；銅離子轉(zhuǎn)運磷酸化ATP酶；銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1

肺癌是最常見的一種惡性腫瘤，每年新發(fā)肺及支氣管癌達(dá)109.52萬，而死亡人數(shù)達(dá)95.10萬，位居各種癌癥第1位。接近70%肺癌患者在確診時已經(jīng)是晚期或全身轉(zhuǎn)移。順鉑已被廣泛用于治療各種惡性腫瘤化療20多年。因其耐藥的發(fā)生，導(dǎo)致肺癌中僅＜20%的患者對化療有效。有關(guān)順鉑耐藥的機制，在前期研究中證實可能與鉑類藥物的轉(zhuǎn)運、解毒、DNA損傷，以及凋亡蛋白的發(fā)現(xiàn)等有關(guān)[1-2]，但具體機制尚不清楚。本研究選用人肺腺癌細(xì)胞株A549及其順鉑耐藥細(xì)胞株，觀察順鉑處理后，耐藥細(xì)胞和親代細(xì)胞對順鉑的細(xì)胞毒性、凋亡敏感性，以及銅離子轉(zhuǎn)運磷酸化ATP酶（copper transporting phosphorylated ATPase，ATP7B）、銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1（copper transporters 1，CTR1）表達(dá)是否存在差異，進一步探討細(xì)胞耐藥機制，為臨床解決化療耐藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞株

無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute-1640，RPMI 1640）、胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，兔抗人多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗體、兔抗人ATP7B、CTR1抗體、鼠抗兔免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）二抗均購自美國CST公司，人A549肺癌細(xì)胞株、A549/順氯氨鉑[cis-Dichlorodiamineplatinum（Ⅱ），DDP]均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及噻唑藍(lán)檢測細(xì)胞增殖活力

各細(xì)胞株置于含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，在37℃二氧化碳CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔。細(xì)胞株給予不同濃度的順鉑處理（終濃度依次為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00和32.00μg/ml），分別培養(yǎng)24和48 h后，加入試劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μl，震蕩10 min，使噻唑藍(lán)[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]還原產(chǎn)物完全溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處檢測光密度（optical delnsity，OD）值，OD值代表活細(xì)胞數(shù)量。按以下公式計算細(xì)胞活力：細(xì)胞生存率（%）=（D實驗組-D空白對照）/（D對照組-D空白對照）×100%。半數(shù)抑制濃度IC50通過SPSS 16.0統(tǒng)計軟件計算，耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=耐藥細(xì)胞株IC50/親代細(xì)胞株IC50。

1.3 Western blot檢測

收集對數(shù)生長期的各細(xì)胞株，分別用含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液裂解，提取蛋白并定量。聚氰基丙烯酸正丁酯法測定蛋白濃度后，以30μg總蛋白量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，轉(zhuǎn)膜后以5%～10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，在1∶1 000濃度的PARP抗體，兔抗人ATP7B、CTR1抗體中溫育16 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗滌6次，1∶3 000濃度的鼠抗兔IgG二抗溫育1 h，洗膜，增強化學(xué)發(fā)光，顯影。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩種細(xì)胞生長曲線差異用配對樣本t檢驗，兩組細(xì)胞不同藥物濃度對生存率變化趨勢分析采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對耐藥細(xì)胞A549/DDP及其親代細(xì)胞A549的細(xì)胞毒性作用

A549/DDP及其親代細(xì)胞A549在分別在0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00和32.00μg/ml濃度順鉑作用48 h后，利用MTT法檢測A549/DDP與親代細(xì)胞A549的OD值，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，結(jié)果：①不同濃度順鉑作用下，兩組細(xì)胞生存率有差別（F=24.829，P=0.000），②不同濃度對不同細(xì)胞的生存率影響有差異（F=24.829，P=0.000）。見附表。

利用MTT法檢測順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP與親代細(xì)胞A549在順鉑處理48 h后細(xì)胞生存曲線，計算A549細(xì)胞株的IC50為（1.35±1.97），A549/ DDP細(xì)胞株的IC50為（13.77±3.54），RI為10.2。見圖1。

2.2 A549/DDP及其親代細(xì)胞A549的生長曲線

為觀察誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥后，是否影響細(xì)胞的增殖速度，繪制耐藥細(xì)胞A549/DDP及其親代細(xì)胞A549的生長曲線。為比較兩組細(xì)胞增殖速度是否相同，以細(xì)胞密度為1×104個/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（共5個），100μl/孔，每天取1塊細(xì)胞培養(yǎng)板用MTT法測得OD值，5 d后，使用SPSS統(tǒng)計軟件對每天測得OD值采用配對樣本t檢驗，兩組細(xì)胞OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.968，自由度=4，雙側(cè)檢驗P=0.339），說明順鉑誘導(dǎo)耐藥后，細(xì)胞增殖未受影響，因此該細(xì)胞株適合用于順鉑耐藥性研究。見圖2。

附表A549/DDP與親代細(xì)胞A549在不同濃度順鉑作用下OD值比較（±s）

附表A549/DDP與親代細(xì)胞A549在不同濃度順鉑作用下OD值比較（±s）

細(xì)胞類型32.00μg/ml16.00μg/ml8.00μg/ml4.00μg/ml2.00μg/ml1.00μg/ml0.50μg/ml0.25μg/ml A5490.029±0.2620.055±0.2860.089±0.2730.188±0.350.459±0.2520.546±0.2360.683±0.1630.763±0.107 A549/DDP0.413±0.2730.473±0.2930.971±0.2620.620±0.3030.813±0.2400.894±0.2470.899±0.1530.929±0.117

圖1 順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP與親代細(xì)胞A549經(jīng)順鉑處理48 h后細(xì)胞生存曲線

圖2 順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP與親代細(xì)胞A549 5 d內(nèi)的生長曲線

2.3順鉑對耐藥細(xì)胞A549/DDP及其親代細(xì)胞A549凋亡敏感性的影響

將兩組細(xì)胞分別用不同濃度順鉑處理24 h后，提取蛋白，利用Western blot檢測PARP的剪切情況。人肺腺癌親代細(xì)胞株A549在2μg/ml順鉑濃度開始出現(xiàn)PARP剪切，而其順鉑耐藥細(xì)胞株A549/ DDP需要增加順鉑干預(yù)濃度，在16μg/ml時開始出現(xiàn)PARP剪切，且剪切片段的表達(dá)逐漸增強。根據(jù)A549/DDP發(fā)生PARP剪切濃度上升（陽性結(jié)果即可說明），說明人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP較其親代細(xì)胞株的凋亡敏感性下降。見圖3。

圖3 順鉑處理耐藥細(xì)胞株A549/DDP及其親代細(xì)胞A549 24 h后引起的PARP剪切

2.4順鉑對耐藥細(xì)胞A549/DDP及其親代細(xì)胞A549細(xì)胞膜上ATP7B表達(dá)的影響

利用Western blot檢測順鉑處理耐藥細(xì)胞株A549/DDP及其親代細(xì)胞A549經(jīng)5μg/ml順鉑處理48h后ATP7B蛋白的表達(dá)水平?？梢姡?jīng)藥物處理后，人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的ATP7B表達(dá)量較其親代細(xì)胞株明顯增加。見圖4。

圖4 順鉑處理耐藥細(xì)胞株A549/DDP及其親代細(xì)胞A549經(jīng)5μg/ml順鉑處理48 h后ATP7B蛋白的表達(dá)水平

2.5順鉑對耐藥細(xì)胞A549/DDP及其親代細(xì)胞A549細(xì)胞膜上CTR1表達(dá)的影響

利用Western blot檢測A549/DDP細(xì)胞株及其親代細(xì)胞A549經(jīng)15μg/ml順鉑處理5min后細(xì)胞膜CTR1蛋白的表達(dá)水平?？梢?，無順鉑干預(yù)時（0μg/ml），人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP中CTR1的表達(dá)量明顯少于其親代細(xì)胞株。而利用15μg/ml順鉑干預(yù)細(xì)胞5 min后，兩細(xì)胞細(xì)胞株的CTR1表達(dá)量較未行順鉑干預(yù)時并無明顯變化。見圖5。

圖5 順鉑處理耐藥細(xì)胞株A549/DDP及其親代細(xì)胞A549經(jīng)15μg/ml順鉑處理5 min后CTR1蛋白的表達(dá)水平

3 討論

全身化療是目前大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者的主要治療手段，而主要的鉑類方案有效率只有30%～47%。腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物耐藥是臨床化療失敗的主要原因?？朔[瘤細(xì)胞耐藥性，提高抗癌藥物療效，是目前臨床上亟需解決的問題。然而腫瘤耐藥產(chǎn)生是一個多途徑、多環(huán)節(jié)、多重機制的過程，需深入研究以闡明其機制。

文獻中報道，人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株對順鉑的抗性是親代細(xì)胞的7.88倍[3]，在不含藥物的培養(yǎng)基中穩(wěn)定培養(yǎng)幾個月耐藥性仍然不變化。本研究結(jié)果表明，人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP較其親代細(xì)胞株耐藥指數(shù)為10.2，本實驗中A549/DDP耐藥指數(shù)稍高于文獻報道數(shù)值，主要考慮與細(xì)胞實驗前用低濃度順鉑（2μg/ml）穩(wěn)定培養(yǎng)2個月左右，增加了細(xì)胞的耐藥性。通過繪制A549、A549/DDP生長曲線，發(fā)現(xiàn)兩細(xì)胞株經(jīng)過順鉑藥物誘導(dǎo)后，增殖速度未受到影響，因此認(rèn)為該細(xì)胞株適合用于順鉑耐藥性研究。

PARP是一種重要的DNA修復(fù)基因，在細(xì)胞凋亡的研究中，可作為凋亡的標(biāo)志。目前，對于PARP的單核苷酸多態(tài)性與腫瘤的易感性研究，主要集中在生殖系腫瘤、肺癌、乳腺癌等方面。其是堿基切除修復(fù)系統(tǒng)通路的核心成員之一，在維持基因組穩(wěn)定性及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮重要作用。研究表明，PARP的高度保守的接觸反應(yīng)區(qū)存在的兩個多態(tài)性位點與吸煙的交叉作用可明顯增加肺癌的易感性[4]。PARP基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌鉑類化療敏感性相關(guān)尚無定論[5]。本實驗中A549細(xì)胞株在順鉑濃度2μg/ml是即出現(xiàn)PARP剪切，而在A549/DDP細(xì)胞株中，順鉑濃度達(dá)16μg/ml后出現(xiàn)PARP剪切，說明人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP對順鉑引起的凋亡敏感性減低。

順鉑的分子極性高，不易通過擴散方式穿過細(xì)胞膜，進入細(xì)胞。銅離子轉(zhuǎn)運蛋白家族包括銅離子轉(zhuǎn)運蛋白家族包括銅離子轉(zhuǎn)運蛋白和銅離子轉(zhuǎn)運磷酸化ATP酶。ATP7A和ATP7B是主要的銅離子泵出蛋白，兩者也參與轉(zhuǎn)運鉑類藥物出胞[6]。KOMATSU等[7]在調(diào)節(jié)鉑類藥物對細(xì)胞耐藥性研究中首次提出，ATP7B過度表達(dá)表現(xiàn)出對高濃度順鉑藥物的耐受性。鼠在體實驗發(fā)現(xiàn)，ATP7B降調(diào)節(jié)使腫瘤細(xì)胞生長減少40%，且會增加順鉑的化療效果[8]。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞異位種植試驗證實，ATP7B表達(dá)與順鉑耐藥有關(guān)，對順鉑耐藥細(xì)胞中ATP7A、ATP7B基因表達(dá)水平高于敏感細(xì)胞，可以作為非小細(xì)胞癌耐藥標(biāo)記物[9]。YIN等[10]發(fā)現(xiàn)，在體外檢測21例確診肺癌的標(biāo)本對鉑類藥的敏感性，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)監(jiān)測ATP7B基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鉑類耐藥的肺癌比鉑類敏感的肺癌ATP7B的表達(dá)要高。以上結(jié)果表明，ATP7B可能參與鉑類抗腫瘤藥物的泵出。本實驗中，人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的ATP7B表達(dá)量較其親代細(xì)胞株增加，且隨著干預(yù)藥物濃度增高呈逐漸上升趨勢。

CTR1是主要的銅離子攝入蛋白，研究證實其參與鉑類抗腫瘤藥物的攝入。LEE等[11]采用RT-PCR檢測40例卵巢癌患者中CTR1和CTR2的表達(dá)水平，研究表明，CTR1的高表達(dá)是對鉑類藥高敏感和高生存率預(yù)后的預(yù)測因子之一，而CTR2的高表達(dá)與CTR1的低表達(dá)的卵巢癌患者對鉑類藥愈耐藥和生存期愈短。CHEN等[12]采用免疫組織化學(xué)法研究發(fā)現(xiàn)，54例初次接受鉑類化療的Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌患者中，CTR1高表達(dá)的化療反應(yīng)效果越好，PFS及OS越好，結(jié)果表明，CTR1不僅是一種獨立的鉑類化療的預(yù)測因子，也是一種很好的預(yù)后因子。XU等[13-14]對282例經(jīng)過≥2周期以順鉑為基礎(chǔ)化療的非小細(xì)胞肺癌患者通過單核苷酸多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，CTR1基因多態(tài)性rs7851395和rs12686377與非小細(xì)胞肺癌對順鉑耐藥相關(guān)，GT單體型的患者對順鉑耐藥性增加，而AG單體型患者生存期較長，同時發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞患者rs10981694為C等位基因時，對順鉑的敏感性和耳毒性均增加。文獻報道，哺乳動物CTR1在細(xì)胞內(nèi)鉑類藥物積聚研究發(fā)現(xiàn)，CTR1促進藥物的入胞作用發(fā)揮于藥物吸收早期；CTR1缺失會減少早期順鉑的入胞，其藥物暴露的前5 min吸收減少81%[15]。本實驗中，不同濃度順鉑誘導(dǎo)下人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的CTR1的表達(dá)量較其親代細(xì)胞株減少。但是15μg/ml順鉑干預(yù)細(xì)胞5 min后，兩細(xì)胞細(xì)胞株的CTR1表達(dá)量并無明顯變化。

總之，人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞中ATP7B表達(dá)較其親代細(xì)胞增加，而CTR1表達(dá)較親代細(xì)胞降低，從而使細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積減少，可以推斷肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥與細(xì)胞內(nèi)ATP7B表達(dá)增加，CTR1表達(dá)降低相關(guān)，同時順鉑進出細(xì)胞可能對銅離子轉(zhuǎn)運通道存在一定的依賴性。銅離子轉(zhuǎn)運蛋白ATP7B、CTR1與肺腺癌細(xì)胞對順鉑耐藥存在明顯相關(guān)性，人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的凋亡敏感性下降，該研究對臨床克服腫瘤細(xì)胞對順鉑耐藥有重要意義。

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（童穎丹 編輯）

Resistance to cisplatin is mediated by synergistic action of CTR1 and ATP7B in A549 cell linein vitro

Xia Luo1,Ming-wei Chen2
(1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830000,China;2.Department of Respirology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiao Tong University, Xi'an,Shannxi 710061,China)

Objective To study the mechanisms of cisplatin resistance of human lung adenocarcinoma cell lines A549 and A549/DDP.Methods Human lung adenocarcinoma A549 cells and a cisplatin-resistant derivative A549/DDP were treated with varying concentrations of cisplatin.The changes in cell growth, cytotoxicity and apoptosis were explored.Western blot was used to determine the expression of copper transporter 1(CTR1),copper transporting phosphorylated ATPase(ATP7B)and poly-ADP-ribose polymerase (PARP).The correlations of cisplatin resistance with CTR1,ATP7B and PARP were analyzed.Results Compared to the A549 cells,the A549/DDP cells were less sensitive to cisplatin-induced cytotoxicity and apoptosis.ATP7B expression increased but CTR1 expression decreased in the A549/DDP cells compared to the A 549 cells.Conclusions Our results demonstrate that reduced expression of the copper influx transporter CTR1 and overexpression of the copper efflux transporter ATP7B are responsible for the resistance of A549/ DDP cells to cisplatin.These results indicate well that the expression of ATP7B and CTR1 may provide markers for chemoresistance and chemosensitivity,respectively,to cisplatin-based chemotherapy.

cisplatin-resistance;lung adenocarcinoma cell line;copper transporters 1;copper transporting phosphorylated ATPase

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.006

1005-8982（2016）23-0027-05

2016-07-06

R91

A