劉榮，劉長明，崔樂樂，周正，韋曉丹

（河北省唐山工人醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000）

論著

玻璃酸鈉和Omega-3必需脂肪酸混合滴眼液對去勢雄兔干眼癥模型的療效觀察

劉榮，劉長明，崔樂樂，周正，韋曉丹

（河北省唐山工人醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000）

目的探討玻璃酸鈉和Omega-3必需脂肪酸（Omega-3 EFAs）混合滴眼液對去勢雄兔干眼癥治療的有效性。方法將15只新西蘭成年雄兔隨機分為正常對照組（A）、非治療組（B）、玻璃酸鈉治療組（C）、Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs聯(lián)合治療組（E），每組3只。對B、C、D、E組行去勢術(shù)復(fù)制動物模型，造模成功后C、D、E組雄兔雙眼分別以玻璃酸鈉滴眼液、Omega-3 EFAs滴眼液、玻璃酸鈉及Omega-3 EFAs混合滴眼液治療，每日10次，連續(xù)1個月。全部實驗兔行Schirmer 1試驗，測定淚膜破裂時間，行角膜熒光素染色評分，Western blot檢測兔淚腺組織中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達。結(jié)果各組指標(biāo)經(jīng)LSD-t檢驗顯示，藥物干預(yù)后玻璃酸和Omega-3 EFAs混合滴眼液組淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性高于其他實驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；淚腺組織內(nèi)TNF-α的表達低于其他實驗組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論局部應(yīng)用玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液治療去勢雄兔干眼癥可明顯改善雄兔眼表體征，降低淚腺組織TNF-α的表達。

干眼癥；玻璃酸鈉；Omega-3必需脂肪酸；腫瘤壞死因子-α

干眼癥（dry eye，DE）是一種常見的具有潛在危害的眼表疾病，包括多種眼表癥狀如眼表干燥、發(fā)紅、燒灼感、視力波動，以及眼表病理學(xué)改變?nèi)缃悄ど掀さ娜睋p和淚腺細胞的鱗狀化生。研究顯示[1-2]，造成DE的重要機制是淚膜功能障礙導(dǎo)致的炎癥[3]。Omega-3必需脂肪酸（Omega-3 essential fatty acids，Omega-3 EFAs）是具有多種生物學(xué)功能的必需脂肪酸，研究證實其具有調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，阻斷炎癥因子的基因編碼的作用[4-5]，包括白介素-1α、白介素-6、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等[6]。玻璃酸鈉滴眼液是臨床治療干眼癥的常用藥物，但是單獨使用并不能完全解決干眼癥癥狀。本實驗用去勢雄兔復(fù)制干眼癥模型，探討玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液治療干眼癥的療效及對眼表炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥物

健康1月齡新西蘭雄兔15只，體重（0.5±0.2）kg，由天津醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。玻璃酸鈉滴眼液（德國URSAPHARTM Arzne），Omega-3 EFAs（美國Sigma Aldrich公司），淚液分泌測定濾紙、熒光素鈉染色劑（天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司），山羊抗兔TNF-α抗體、β-actin、人抗山羊IgG（Santa Cruz），PIPA蛋白裂解液、Trizol試劑（碧云天生物技術(shù)研究所），抗體稀釋液、蛋白封閉液（北京博奧森公司），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（北京普利來基因技術(shù)有限公司），PVDF膜（北京索萊寶科技有限公司），蛋白質(zhì)Marker（Fermentas公司），甲醇、濃鹽酸等其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)。

1.2 動物模型復(fù)制

將實驗兔固定于兔架上，氯胺酮（0.05ml）50mg/kg肌內(nèi)注射全身麻醉，陰囊局部加用鹽酸利多卡因局部麻醉，將一側(cè)睪丸由腹腔擠入陰囊，用刀片作一陰囊切口，用力擠出睪丸，結(jié)扎精索靜脈及輸精管后，切除睪丸及附睪，另一側(cè)睪丸及附睪同法切除，術(shù)后預(yù)防感染。檢查均由同一人完成，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度相同，于實驗前和實驗后2、3、4周，2、3個月行SchirmerⅠ試驗、BUT檢測及角膜熒光素染色。1.3實驗分組及給藥方法

0.2%Omega-3 EFAs溶液配制：0.2%Omega-3 EFAs溶于三蒸水中；玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合液配制：0.2%Omega-3 EFAs溶于玻璃酸鈉滴眼液中。將15只新西蘭成年雄兔隨機分為正常對照組（A）、非治療組（B）、玻璃酸鈉治療組（C）、0.2% Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E），每組3只。對B、C、D、E組行去勢術(shù)復(fù)制動物模型，術(shù)后3個月動物模型成功復(fù)制后，C、D、E組雄兔雙眼分別以玻璃酸鈉滴眼液、0.2%Omega-3 EFAs滴眼液、玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合滴眼液治療（混合后滴眼），每日自9～18點每小時滴雙眼1次，每次30μl，每日10次，連續(xù)1個月。

1.4 檢查方法

①SchirmerⅠ試驗：用5 mm×35 mm淚液檢測濾紙條，一端彎折5 mm，置于下瞼外側(cè)1/3淚腺囊內(nèi)，余部分懸垂于皮膚表面。5 min后測量濾紙濕潤長度。②淚膜破裂時間（BUT）：熒光素鈉濾紙生理鹽水浸潤后涂抹于模型兔下瞼淚腺囊內(nèi)，眼瞼閉合數(shù)次使熒光素均勻分布于角膜表面，于鈷藍光下觀察，從最后一次瞬目開始計時，記錄淚膜上出現(xiàn)第一個破裂點的時間。③角膜熒光素染色評分（FL）：熒光素染色后鈷藍光下觀察，采用0～12分制方法記錄染色結(jié)果，將角膜分為4個象限，0分：無染色（-）；1分：1～30個點狀著色；2分：＞30個點狀著色但染色未融合；3分：角膜點狀著色融合、絲狀物及潰瘍等。

1.5 Western blot檢測TNF-α的表達

1.5.1 組織總蛋白提取每組雄兔以空氣栓塞法處死后立即取適量淚腺組織（1～2 ml），反復(fù)用單去污劑裂解液（PMSF）400μl裂解制成組織勻漿（于冰上），將組織勻漿移至1.5 ml離心管中離心（12 000 r/min×5 min，4℃），取上清液置于-20℃冰箱冷凍保存。

1.5.2 Western blot步驟配制分離膠及濃縮膠，灌膠上樣，調(diào)整各組蛋白的含量約50μg，加入200μl EP管中，每管7μl的蛋白上樣緩沖液，調(diào)整體積為45μl，電泳（先恒壓80 V，待溴酚藍跑至分離膠后改為橫流35 mA，距離底部0.5 cm時，停止電泳），轉(zhuǎn)膜：PVDF膜浸泡于甲醇中60 min激活，轉(zhuǎn)膜條件橫流200 mA，60 min。取出PVDF膜放入TBST中漂洗（3×10 min），將膜浸入封閉液中，置于搖床上室溫封閉60 min。一抗孵育4℃過夜約12 h，室溫下繼續(xù)孵育2 h。TBST清洗3×7 min。二抗孵育：將膜放入稀釋好的二抗（1∶1 000）中置于搖床上室溫孵育3 h。TBST清洗3×7 min。按比例（1∶1）配好顯色液，將膜平鋪于玻璃板上，吸取適量顯色液滴加于膜上，反應(yīng)約1 min后，放入凝膠成像分析儀器中，曝光照相保存。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模成功

去勢模型兔術(shù)后3周，淚液分泌開始減少,淚膜穩(wěn)定性下降，3個月后，模型雄兔體重較對照組無明顯變化，角膜干燥，角膜表面染色，淚液分泌及淚膜穩(wěn)定性降低，并呈時間依賴性，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。去勢后3個月雄兔作為去勢干眼癥模型用于實驗。

2.2 實驗檢測

2.2.1 SchirmerⅠ治療后，玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）與玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）以及非治療組（B）比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 14.225、10.060和14.361，P=0.000）；玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）與正常對照組（A）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.624，P=0.567）。見附表。

附表各組治療前后眼表實驗檢測結(jié)果及淚腺組織內(nèi)TNF-α表達比較（n=3±s）

附表各組治療前后眼表實驗檢測結(jié)果及淚腺組織內(nèi)TNF-α表達比較（n=3±s）

注：1）與非治療組（B）比較，P＜0.05；2）與玻璃酸鈉治療組（C）比較，P＜0.05；3）與Omega-3 EFAs治療組（D）比較，P＜0.05；4）與同組治療前比較，P＜0.05；5）與玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合治療組（E）比較，P＜0.05；6）與正常對照組（A）比較，P＜0.05

SchirmerⅠBUTFLTNF-α治療前治療前治療前治療后A組18.067±0.51317.467±1.1501）2）3）15.000±1.00015.000±1.7321）2）3）4）001）2）3）5）0.195±0.0101）2）B組3.700±0.7813.334±1.3052）3）5）6）5.000±1.0002.000±1.0002）3）4）5）6）7.333±1.5289.000±1.0002）3）5）6）0.461±0.0382）3）5）6）C組4.800±0.65615.367±0.6661）3）4）5）6）4.333±0.57711.667±2.5171）4）6）6.334±1.5281.667±0.5771）3）4）6）0.338±0.0191）3）5）6）D組4.633±0.55113.300±1.1141）2）4）5）6）4.333±0.88210.000±1.0001）4）5）6）6.667±0.5773.667±0.5771）2）4）5）6）0.212±0.0151）2）E組4.300±0.80018.067±1.2061）2）3）4）4.667±0.57713.334±1.5281）3）4）6.000±1.0001.333±0.5771）3）4）0.180±0.01131）2）F值252.0887.2794.841.94__3.64 P值0.0000.0000.0000.000__0.0442治療后治療后治療后

2.2.2 BUT經(jīng)LSD-t檢驗，玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）經(jīng)藥物治療后淚膜穩(wěn)定性均有提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.579、16.232和22.182，P=0.000）；玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）與非治療組（B）比較淚膜穩(wěn)定性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.182、5.173和10.750，P=0.004、0.013和0.000），玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）與正常對照組（A）、玻璃酸鈉治療組（C）比較淚膜穩(wěn)定性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.249和0.981，P=0.280和0.382）。見附表。

2.2.3 FL經(jīng)LSD-t檢驗，玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）藥物治療后角膜染色較治療前減少（t=4.949、2.828和7.002，P=0.008、0.047和0.002）。見附表。

2.2.4 TNF-α表達相應(yīng)藥物治療后，玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）與非治療組（B）TNF-α表達經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.014、10.557和12.277，P=0.007、0.000和0.000），0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）及玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）治療后TNF-α表達與正常對照組（A）相當(dāng)（t=1.633和0.229，P=0.178和0.830），玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）與玻璃酸鈉治療組（C）TNF-α表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.379，P= 0.000）。見附表和附圖。

附圖檢測淚腺組織中TNF-α的表達

3 討論

炎癥是干眼癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素，炎癥因子的產(chǎn)生不僅可刺激淋巴細胞增生對淚腺造成免疫攻擊，自身也會干擾淚腺的正常分泌。淚腺的腺泡細胞可以表現(xiàn)為一種抗原表達細胞，刺激淋巴細胞的增生，因此淚腺可能是最先具有免疫應(yīng)答的組織，并產(chǎn)生異常調(diào)節(jié)[7]。研究顯示在干眼癥患者淚腺組織中TNF-α的表達增高，而給予外生性TNF-α，會抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，減弱淚腺的分泌，因此減少炎癥因子的表達是干眼癥治療的重點[8]。

Omega-3 EFAs是一種天然的調(diào)節(jié)劑，除了可以調(diào)節(jié)抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及抑制促氧化酶的產(chǎn)生外，還可以通過向類花生四烯酸的轉(zhuǎn)化代謝過程中調(diào)節(jié)炎癥性和免疫應(yīng)答[7，9]。Omega-3 EFAs的代謝產(chǎn)物包括α亞麻酸及它的去飽和產(chǎn)物二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十六碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）[6]。EPA是抗炎因子的前體，可抑制IL-α、β和TNF-α的生成。DHA是具有神經(jīng)保護作用的D1的前體，可以保護淚腺組織和眼表細胞免于由TNF-α介導(dǎo)的凋亡[10]。實驗證實[6，9]單獨使用Omega-3 EFAs可在細胞和分子水平減少炎癥因子如CD11b+、IL-1α和TNF-α的表達。本實驗結(jié)果證實單獨使用Omega-3 EFAs組及玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合組均減少淚腺組織內(nèi)TNF-α的蛋白表達，兩組間TNF-α的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明Omega-3 EFAs可能有抑制眼表炎癥的作用。

玻璃酸鈉滴眼液廣泛應(yīng)用于干眼癥的臨床治療中，玻璃酸鈉具有非牛頓液體的特性和極好的生物相容性，其溶液具有高度的黏彈性，分子鏈越長，黏彈性越好，黏度隨切變的增大而明顯減小，即使藥液的黏度很高，眼瞼仍然可眨眼自如沒有黏糊感。同時玻璃酸鈉除潤滑眼表面，改善眼表刺激癥狀外還可改善干眼癥患者角膜表面規(guī)律從而改善其視功能并減輕畏光現(xiàn)象[11-12]，但單獨使用玻璃酸鈉滴眼液并不能完全解決干眼癥患者的所有癥狀。本實驗證實，單獨使用玻璃酸鈉治療可有效地改善淚膜質(zhì)量，減少角膜染色并可局部控制炎癥，玻璃酸鈉治療組及玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合組在BUT和FL檢測中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液后有效改善干眼癥雄兔臨床癥狀并減少炎癥因子的表達，角膜熒光素染色評分、淚腺組織內(nèi)TNF-α均明顯低于其他實驗組，通過Western blot檢測證實玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合制劑可明顯降低炎癥因子TNF-α的表達。

綜上所述，玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液可改善干眼癥雄兔的角膜失代償，減少炎癥因子的產(chǎn)生。綜合玻璃酸鈉對角膜的保護作用和Omega-3 EFAs的抗炎作用，玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液以協(xié)同的方式改善干眼癥的癥狀和體征。實驗證實，使用玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液的臨床治療效果更好。

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（申海菊編輯）

Effects of mixed eye drops of omega-3 essential fatty acids and sodium hyaluronate on ocular surface of dry eye model of castrated male rabbits

Rong Liu,Chang-ming Liu,Le-le Cui,Zheng Zhou,Xiao-dan Wei
(Department of Ophtalmology,Tangshan Gongren Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

Objective To investigate the efficacy of the topical application of omega-3 essential fatty acids (EFAs)and sodium hyaluronate mixture in a rabbit model of experimental dry eye(EDE).Methods Fifteen healthy New Zealand rabbits were randomly divided into 5 groups with 3 rabbits in each group,i.e.normal group(A),non-treatment group(B),sodium hyaluronate therapy group(C),omega-3 EFAs therapy group(D), and mixed sodium hyaluronate and omega-3 EFAs therapy group(E).The rabbits in the groups B,C,D and E had bilateral testis and epididym resected.After successful building of xerophthalmia model,the groups C, D and E were treated with sodium hyaluronate,omega 3 EFAs and combined sodium hyaluronate and omega 3 EFAs in two eyes,10 times a day for a month.All the experimental rabbits received SchirmerⅠtest,the breakup time of tear film and corneal fluorescein staining scores were determined.Tumor necrosis factor α (TNF-α)in lacrimal tissue was detected by Western blot.Results LSD-ttest showed the rabbits in the group E showed a significant improvement in lacrimal secretion and tear film stability compared with other groups, the differences were statistically significant(P＜0.05).A significant decrease in the TNF-α level was observed in the group E,the differences were statistically significant from other groups(P＜0.05).Conclusions Topical application of mixed eye drops containing sodium hyaluronate and omega 3 EFAs could improve the ocularsurface signs and decrease the expression of TNF-α in lacrimal gland of xerophthalmia model of castrated male rabbits.

dry eye;sodium hyaluronate;omega-3 essential fatty acids;TNF-α

R777.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.004

1005-8982（2016）23-0016-05

2016-03-17