鄭智 曹曉恩 張紅萍

高危型HPVE6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)高級(jí)別宮頸病變的診斷價(jià)值

鄭智 曹曉恩 張紅萍

目的 探討高危型人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)高級(jí)別宮頸病變的臨床診斷價(jià)值。方法 選取2014年8月至2015年3月在婦科門(mén)診及住院的疑似宮頸病變患者311例，均行宮頸脫落細(xì)胞的薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查、HPVDNA分型檢測(cè)和高危型HPVE6/E7 mRNA檢測(cè)，對(duì)其中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)結(jié)果陽(yáng)性者行陰道鏡下宮頸活組織檢查和組織病理學(xué)檢查。以病理報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 慢性宮頸炎組中HPVDNA分型檢測(cè)檢出率（29.4%）高于高危型HPVE6/E7 mRNA（17.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸病變的特異度（73.4%）高于HPV DNA分型檢測(cè)（59.8%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)診斷高級(jí)別宮頸病變ROC曲線下面積（0.816）大于HPV DNA分型檢測(cè)（0.710），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 與HPVDNA分型檢測(cè)相比，高危型HPVE6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸病變具有更好的特異度，其診斷效能更佳。

人乳頭瘤病毒 E6/E7 mRNA DNA 宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 宮頸腫瘤

宮頸癌是威脅女性健康的重大疾病，雖然宮頸癌的總發(fā)病率在下降，但是全世界每年仍有529 800例宮頸癌新發(fā)患者和275 100例宮頸癌死亡患者[1]。宮頸癌前病變及宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)性感染密切相關(guān)[2-3]。HPV病毒早期編碼區(qū)中的E6、E7基因是病毒癌基因，其編碼的E6、E7癌蛋白可分別與腫瘤抑制基因p53蛋白、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（protein of retionblastoma，pRb）等抑癌蛋白結(jié)合并使之失活，從而干擾細(xì)胞周期，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[4]。高危型HPV E6/E7 mRNA反應(yīng)了病毒癌基因的活性，通過(guò)檢測(cè)高危型HPV E6/ E7 mRNA水平可以推斷出HPV感染水平和致癌能力。本研究通過(guò)與HPV DNA分型檢測(cè)相比較，探討高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)能否更好地對(duì)宮頸病變進(jìn)行篩查以及預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展，從而為該檢測(cè)應(yīng)用于臨床篩查、進(jìn)展預(yù)測(cè)及患者隨訪管理等方面提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2014年8月至2015年3月在本院婦科門(mén)診及住院的宮頸可疑病變患者（白帶增多，性生活后出血，白帶夾雜血絲，體檢發(fā)現(xiàn)宮頸肥大、宮頸糜爛、宮頸贅生物等）311例作為研究對(duì)象?；颊吣挲g19～77歲，中位年齡39歲。311例患者均在知情并自愿的前提下行宮頸脫落細(xì)胞的薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（thinprep cytologic test，TCT）、HPV DNA分型檢測(cè)和高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，對(duì)其中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)結(jié)果陽(yáng)性者行陰道鏡下宮頸活組織檢查，并送病理科行組織病理學(xué)檢查，以病理報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn)。所有患者既往均無(wú)宮頸癌史、宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）史、宮頸錐切術(shù)史及盆腔放射治療史。排除急性生殖道炎癥者、妊娠者，取材3d內(nèi)無(wú)陰道沖洗及用藥史，檢查前24h內(nèi)避免性生活。

1.2 方法

1.2.1 TCT檢測(cè) 由專(zhuān)業(yè)婦產(chǎn)科醫(yī)師使用液基細(xì)胞學(xué)專(zhuān)用取材刷沿著頸管朝同一時(shí)鐘方向旋轉(zhuǎn)3～5周，采集宮頸外口及宮頸管的脫落上皮細(xì)胞，并將收集的細(xì)胞涮洗入盛有PreservCyt保存液的小瓶?jī)?nèi)送檢。將保存液中的標(biāo)本用Thinprep 2000系統(tǒng)程序化處理，自動(dòng)制成2cm的薄層涂片，95%乙醇固定，然后進(jìn)行巴氏染色、封片。由病理科細(xì)胞學(xué)專(zhuān)職人員閱片，按照2001年TBS分類(lèi)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分級(jí)[5]。以細(xì)胞學(xué)結(jié)果≥ASC-US為陽(yáng)性。

1.2.2 HPV DNA分型檢測(cè) 采用專(zhuān)用HPV采樣刷插入宮頸口，沿同一個(gè)時(shí)鐘方向旋轉(zhuǎn)5圈，然后將HPV采樣刷置于含有專(zhuān)用細(xì)胞保存液的取樣管中，作好標(biāo)記送檢。結(jié)果包括高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型），低危型HPV（6、11、42、43、44型）和3種中國(guó)人常見(jiàn)的亞型HPV（53、66、CP8304型）。

1.2.3 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 采用TCT檢測(cè)的剩余標(biāo)本，試劑盒購(gòu)自河南中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司，主要步驟包括裂解細(xì)胞、雜交捕獲mRNA、信號(hào)放大、底物發(fā)光反應(yīng)，用QuantiVirusTM冷光儀檢測(cè)獲得光子數(shù)，最后用Diacarta公司的計(jì)算軟件將光子數(shù)轉(zhuǎn)化成拷貝數(shù)，拷貝數(shù)=0copy/ml為結(jié)果陰性，拷貝數(shù)＞0copy/ml為結(jié)果陽(yáng)性，針對(duì)14種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型）E6/E7 mRNA水平進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.4 陰道鏡檢查及組織病理學(xué)檢查 由固定的婦科醫(yī)師進(jìn)行操作和檢查?；颊哂谠陆?jīng)干凈3～7d進(jìn)行陰道鏡檢查。取材后用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，入水，常規(guī)HE染色，封片。由病理科醫(yī)師閱片。組織病理診斷分為正?；蚵詫m頸炎、CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)或原位癌、宮頸浸潤(rùn)癌。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件；兩種檢測(cè)方法在各級(jí)別宮頸病變中的陽(yáng)性率比較以及兩者診斷高級(jí)別宮頸病變的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較采用χ2檢驗(yàn)或Fish確切概率法。ROC曲線比較兩種檢測(cè)方法預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸病變的效能，兩者曲線下面積比較采用Z檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法在各級(jí)別宮頸病變中的陽(yáng)性率比較 HPV DNA分型檢測(cè)的陽(yáng)性率（59.8%）略高于高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)（52.4%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HPV DNA分型檢測(cè)在慢性宮頸炎中的陽(yáng)性率（29.4%）高于高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率（17.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但兩種檢測(cè)方法在CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ及宮頸癌中的陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種檢測(cè)方法在各級(jí)別宮頸病變中的陽(yáng)性率比較[例（%）]

2.2 兩種檢測(cè)方法診斷高級(jí)別宮頸病變的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較 將311例患者以病理學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)分為兩組：低級(jí)別宮頸病變組（包括慢性宮頸炎、CINⅠ級(jí)）和高級(jí)別宮頸病變組（包括CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)及宮頸癌），兩組患者高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)和HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與HPV DNA分型檢測(cè)診斷高級(jí)別宮頸病變的靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)診斷高級(jí)別宮頸病變的特異度高于HPV DNA分型檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.3 兩種檢測(cè)方法診斷高級(jí)別宮頸病變的ROC曲線比較 以病理結(jié)果≥CINⅡ級(jí)（即高級(jí)別宮頸病變）為陽(yáng)性，對(duì)兩種檢測(cè)方法繪制ROC曲線，見(jiàn)圖1。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的曲線下面積是0.816，標(biāo)準(zhǔn)誤是0.025，可信區(qū)間是0.767～0.865；HPV DNA分型檢測(cè)的曲線下面積是0.710，標(biāo)準(zhǔn)誤是0.029，可信區(qū)間是0.653～0.767。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的曲線下面積大于HPV DNA分型檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z= 2.768，P＜0.05）。

表2 兩組不同宮頸病變級(jí)別患者高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)和HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果[例（%）]

表3 兩種檢測(cè)方法診斷高級(jí)別宮頸病變的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較（%）

圖1 兩種檢測(cè)方法診斷高級(jí)別宮頸病變的ROC曲線

3 討論

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的生殖道惡性腫瘤。高危型HPV感染后，其環(huán)形DNA游離于宿主細(xì)胞核內(nèi)，病毒核酸常整合到宿主正常細(xì)胞的基因組中[6]，導(dǎo)致E2基因片段的丟失或滅活，引起病毒E6、E7癌基因的mRNA轉(zhuǎn)錄，編碼的2種癌蛋白E6、E7持續(xù)、過(guò)度合成和表達(dá)。HPV E6、E7蛋白可分別結(jié)合宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抑癌蛋白p53蛋白和pRb并使之失活，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失常，細(xì)胞惡性增殖發(fā)生癌變。研究證實(shí)人類(lèi)原始角化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和無(wú)限增殖是HPV E6、E7蛋白聯(lián)合作用的結(jié)果[7]。通過(guò)高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)能對(duì)病毒的活動(dòng)程度及病變程度進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而更為直觀的評(píng)估宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，因此，高危型HPV E6/ E7 mRNA是檢測(cè)HPV感染致癌風(fēng)險(xiǎn)的合理靶位點(diǎn)。

HPV感染非常普遍，研究顯示，99.7%的宮頸癌均具有HPV感染。女性一生中感染HPV的概率是80%，90%以上的患者感染HPV是無(wú)癥狀和暫時(shí)性的，可通過(guò)自身免疫系統(tǒng)的清除作用在1～2年內(nèi)自愈，僅有極少數(shù)患者無(wú)法消滅體內(nèi)的病毒，在HPV持續(xù)性感染下，經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的時(shí)間發(fā)展為CINⅡ～Ⅲ級(jí)并最終至宮頸浸潤(rùn)癌。Plummer等[8]通過(guò)隨訪研究4 504例因HPV感染引起的CINⅠ級(jí)患者，發(fā)現(xiàn)99%的患者可在2年內(nèi)自行清除HPV。本研究顯示慢性宮頸炎組中HPV DNA分型檢出率高于高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，可見(jiàn)在慢性宮頸炎組中，高危型HPV DNA的檢出率明顯高于高危型HPV E6/E7 mRNA，說(shuō)明其更易篩查出過(guò)多的無(wú)意義HPV暫時(shí)性感染，從而將許多無(wú)轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)或極低致癌風(fēng)險(xiǎn)的人群納入到較高惡性轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)的病變級(jí)別中去，不僅造成過(guò)度診治，更給患者帶來(lái)身體和心理上的傷害。而在慢性宮頸炎病變患者中更低的HPV E6/E7 mRNA檢出率更好地反映了部分HPV感染者高危型HPV處于游離狀態(tài)，或HPV DNA已整合到宿主基因中但病毒癌基因無(wú)轉(zhuǎn)錄活性或處于病變轉(zhuǎn)化靜止期，表明目前感染的HPV對(duì)機(jī)體無(wú)致癌風(fēng)險(xiǎn)或極低致癌風(fēng)險(xiǎn)，從而避免了不必要的檢查與治療。

高級(jí)別宮頸病變是指CINⅡ級(jí)及以上級(jí)別宮頸病變，包括CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)及宮頸浸潤(rùn)癌，是宮頸疾病篩查的目標(biāo)人群[9]。目前臨床上對(duì)于CINⅠ級(jí)的患者，如果陰道鏡檢查滿(mǎn)意，多偏向于保守治療，可物理治療，或觀察6～12個(gè)月后復(fù)查T(mén)CT和HPV；而對(duì)于CINⅡ、Ⅲ級(jí)的患者則認(rèn)為多系高危型HPV持續(xù)感染所致，經(jīng)過(guò)數(shù)年繼續(xù)進(jìn)展至宮頸浸潤(rùn)癌可能性較大，一般采取手術(shù)治療，而且5%～20%的高級(jí)別宮頸病變女性治療后會(huì)在3年內(nèi)復(fù)發(fā)[10]。評(píng)價(jià)一種檢測(cè)方法效能好壞，關(guān)鍵是能否更好地識(shí)別出具有高級(jí)別宮頸病變的高危人群。已經(jīng)證實(shí)HPV DNA檢測(cè)較細(xì)胞學(xué)涂片檢測(cè)高級(jí)別宮頸病變具有更顯著的敏感度，但其特異度較低導(dǎo)致一些假陽(yáng)性結(jié)果和不必要的有創(chuàng)性操作，如陰道鏡檢查和宮頸活檢。國(guó)外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)診斷高級(jí)別宮頸病變較HPV DNA檢測(cè)方法具有更高的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值[11]，提示HPV E6/E7 mRNA比HPV DNA準(zhǔn)確度更好。本研究結(jié)果也顯示：高危型HPV E6/ E7 mRNA檢測(cè)對(duì)于高級(jí)別宮頸病變?cè)\斷的特異度高于HPV DNA分型檢測(cè)（P＜0.05）?？梢?jiàn)與HPV DNA分型檢測(cè)相比，高危HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在臨床上有更高的診斷價(jià)值，尤其對(duì)于高級(jí)別宮頸病變，其檢測(cè)水平更準(zhǔn)確。通過(guò)兩者診斷高級(jí)別宮頸病變ROC曲線比較，高危型HPV E6/E7 mRNA曲線下面積大于HPV DNA曲線下面積（P＜0.05），也說(shuō)明對(duì)于病變程度高的宮頸疾病，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)具有更好的診斷效能。高危型HPV E6/E7 mRNA可直接檢測(cè)E6、E7基因的表達(dá)量，較僅僅檢測(cè)病毒感染有無(wú)的HPV DNA檢測(cè)更為精準(zhǔn)、直接，能更好地識(shí)別高危人群，預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。因此，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可以用作鑒別短暫的宮頸不典型增生和具有潛在的惡性轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)的病變的更具體的方法，較HPV DNA檢測(cè)減少了相應(yīng)的心理負(fù)擔(dān)。

綜上所述，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在臨床診斷過(guò)程中可以結(jié)合HPV E6、E7癌基因的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行診斷。與HPV DNA分型檢測(cè)相比，高危型HPV E6/ E7 mRNA檢測(cè)對(duì)高級(jí)別宮頸病變預(yù)測(cè)有更好的特異度，其診斷效能更佳。可見(jiàn)高危HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在臨床上具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值和前景，今后有望成為診斷宮頸病變的更好指標(biāo)。

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Clinical value of high-risk HPV E6/E7 mRNA in detection of high-grade cervical lesions

ZHENG Zhi,CAO Xiaoen,ZHANG Hongping.Department of Obstetrics and Gynecology,Wenzhou People's Hospital,Wenzhou 325000,China

Objective To assess the clinical value of high-risk human papilloma virus (HPV)E6/E7 mRNA in detection of high-grade cervical lesions (cervical intraepithelial neoplasm II,III and cervical cancer). Methods A total of 311 patients with suspected cervical lesions were visiting our hospital between August 2014 and March 2015 were included.Thinprep cytology test (TCT)of exfoliated cervical cells,HPVDNA classification detection and high-risk HPVE6/E7 mRNA detection were performed for all patients;patients with positive results of one or multiple tests underwent colposcopic cervical biopsy and histopathological examination.With pathological result as the gold standard,the clinical value of two tests was analyzed and compared. Results The positive rate of chronic cervicitis with HPVDNA classification was higher than that with high-risk HPVE6/E7 mRNA detection (29.4%vs.17.5%,P＜0.05).The specificity of high-risk HPV E6/E7 mRNA test in detecting high-grade cervical lesions was higher than that of HPVDNA classification test(73.4%vs 59.8%,P＜0.05).The area under the ROC curve of high-risk HPVE6/E7 mRNA detection in diagnosing high-grade cervical lesions was larger than that of HPV DNA classification test(0.816 vs.0.710, P＜0.05). Conclusion Compared to HPV DNA classification test,high-risk HPV E6/E7 mRNA detection has better clinical value in prediction of high-grade cervical lesions.

Human papillomavirus E6/E7 mRNA DNA Cervical intraepithelial neoplasia Cervical carcinoma

2016-02-26）

（本文編輯：陳麗）

溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20150200）

325000 溫州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（鄭智、張紅萍）；中國(guó)人民解放軍第118醫(yī)院普外科（曹曉恩）

張紅萍，E-mail：zjzhp@126.com