楊棟 焦其彬 張邢煒

環(huán)氧化酶在炎癥因子引起大鼠冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流中的作用機(jī)制研究

楊棟 焦其彬 張邢煒

目的 探討環(huán)氧化酶（COX）在炎癥因子引起的大鼠冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流現(xiàn)象中的作用及機(jī)制。方法 采用結(jié)扎-放松冠狀動(dòng)脈左前降支法建立大鼠無(wú)復(fù)流模型，硫磺素S法測(cè)定離體大鼠左心室心肌無(wú)復(fù)流面積，根據(jù)左心室無(wú)復(fù)流面積將實(shí)驗(yàn)大鼠分為無(wú)復(fù)流組（＞20%）和對(duì)照組（≤20%），采用ELISA法測(cè)定兩組大鼠血清C反應(yīng)蛋白（CRP）和IL-6水平，real-time PCR法測(cè)定左心室COX1、2的RNA轉(zhuǎn)錄水平。另用吲哚美辛、0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水）對(duì)無(wú)復(fù)流大鼠進(jìn)行預(yù)處理，采用頸動(dòng)脈插管法測(cè)定吲哚美辛組、生理鹽水組及對(duì)照組大鼠心臟收縮舒張功能及無(wú)復(fù)流面積。結(jié)果 無(wú)復(fù)流大鼠血清CRP和IL-6水平較對(duì)照組升高，左心室COX1、2的RNA轉(zhuǎn)錄水平也高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），對(duì)照組大鼠心臟功能優(yōu)于模型組，吲哚美辛組大鼠心室舒張末壓低于模型組，而左室等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率和等容舒張期左心室壓力下降的最大速率均較無(wú)復(fù)流模型組升高，吲哚美辛組無(wú)復(fù)流面積較模型組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 CRP、IL-6可能通過(guò)COX途徑介導(dǎo)大鼠冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，吲哚美辛能通過(guò)拮抗COX途徑相關(guān)的炎癥反應(yīng)，改善大鼠冠狀動(dòng)脈的無(wú)復(fù)流。

環(huán)氧化酶 急性心肌梗死 無(wú)復(fù)流 炎癥因子

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（PCI）是治療急性心肌梗死（AMI）的最重要手段之一。大規(guī)模臨床研究業(yè)已證實(shí)，早期行PCI術(shù)能夠挽救因心外膜血管物理阻塞而缺血的心肌，從而改善患者的近遠(yuǎn)期預(yù)后。然而PCI術(shù)后達(dá)到冠狀動(dòng)脈血流分級(jí)（TIMI）Ⅲ級(jí)的患者，犯罪血管雖已開(kāi)通，但缺血心肌組織并沒(méi)有完全、有效的血流灌注，發(fā)生冠狀動(dòng)脈“無(wú)復(fù)流（no-reflow）”。無(wú)復(fù)流在PCI術(shù)后的發(fā)生率為25%～30%左右，可顯著提高充血性心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死的風(fēng)險(xiǎn)，增加住院病死率和心肌梗死發(fā)生率[1]，是短期病死率增加的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[2]。因此，如何預(yù)測(cè)無(wú)復(fù)流、減少無(wú)復(fù)流的產(chǎn)生和盡快解決心肌缺血，成為急診PCI亟待解決的難題。Rivera-Linares等[3]發(fā)現(xiàn)，CK-MB=160UI/L、KillipⅡ、TIMI血流0級(jí)、心電圖上2個(gè)以上Q波、再灌注治療方法和冠脈內(nèi)是否存在血栓均是無(wú)復(fù)流發(fā)生的重要預(yù)測(cè)因子。臨床觀察研究提示炎癥反應(yīng)可能在冠脈無(wú)復(fù)流中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)建立大鼠缺血再灌注模型，模擬臨床無(wú)復(fù)流，使用環(huán)氧化酶（COX）途徑阻斷劑治療，觀察大鼠血清中炎癥因子C反應(yīng)蛋白（CRP）與IL-6水平、COX的RNA轉(zhuǎn)錄水平及心臟功能的變化，以探討COX途徑在炎癥因子引起的大鼠冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD遠(yuǎn)交群雄性大鼠，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司，出生10～15周，體重270～330g，并隨機(jī)編號(hào)。

1.2 試劑和抗體 10%水合氯醛，硫磺素S（40g/L），CRP及IL-6的ELISA試劑盒 (上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，TRIzol試劑（上海Invitrogen公司），PCR引物由上海Invitrogen公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司），SYBR Green real-time PCR Master Mix（美國(guó)ABI公司）。

1.3 主要儀器和用品 HX-300型動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），BIORAD680酶標(biāo)儀（昆士蘭生物有限公司），2-16K型離心機(jī)（Sigma公司），單通道心電圖機(jī)（北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司），ZF-1型紫外線分析儀（上海金鵬分析儀器有限公司），ABI 7300型PCR儀（美國(guó)ABI公司），5-0帶針縫合線（上海醫(yī)用縫合針廠有限公司）。

1.4 急性缺血再灌注模型建立 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg），麻醉成功后備皮，行氣管切開(kāi)術(shù)并連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（呼吸頻率80次/min，呼吸比1∶1，潮氣量20ml）。在左側(cè)胸部心尖搏動(dòng)最強(qiáng)的部位打開(kāi)胸腔，撕開(kāi)心包，于左心耳下2mm前降支根部穿入5-0的縫合線，在結(jié)扎線和冠狀動(dòng)脈之間墊一膠皮管，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。若心肌顏色變白，收縮運(yùn)動(dòng)不良、左心耳翹起，表明冠狀動(dòng)脈結(jié)扎成功。結(jié)扎60min后松解縫合線使結(jié)扎區(qū)域再灌注，15min后若結(jié)扎區(qū)心肌顏色變紅、左心耳顏色由暗紅變成鮮紅，表明結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈再通，急性缺血再灌注模型制作成功。

1.5 無(wú)復(fù)流模型建立及分組 大鼠心肌再灌注60min后，自下肢股靜脈采血1ml，做好標(biāo)記，并按1ml/kg注入硫磺素S，隨即注入2%氯化鉀溶液使心臟停跳，迅速取出心臟，用冰生理鹽水沖洗心臟，切除心耳、大動(dòng)脈、右室，保留左心室，在波長(zhǎng)365nm下測(cè)定心肌梗死區(qū)（即無(wú)復(fù)流區(qū)）熒光信號(hào)，通過(guò)Image Pro.6.0處理，定義心肌無(wú)復(fù)流區(qū)面積＞20%的大鼠為無(wú)復(fù)流組（9只），≤20%的大鼠為對(duì)照組（11只），將左心室標(biāo)本洗凈，-80℃凍存。

1.6 血清CRP和IL-6水平測(cè)定 采用ELISA法。所采靜脈血室溫自然凝固10min后，3 000r/min離心20min，取上層血清置于密封管中，-80℃冷凍保存待檢。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定大鼠血清CRP和IL-6水平。

1.7 COX1和COX2 RNA轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定 采用realtime PCR法。取出-80℃保存的左心室標(biāo)本200mg左右，加入液氮，在研缽中研碎，分置于1.5ml的離心管中，用Trizol反復(fù)吹打，靜置5min。按照TRIzol Reagent操作手冊(cè)步驟提取細(xì)胞總RNA，加入適量的RNasefree水溶解沉淀，保存于-80℃。Nanodrap2000檢測(cè)RNA濃度及純度。按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶及M-MLV cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將各組RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。采用SYBR Green PCR Master Mix熒光染料嵌合法在ABI 7300定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green PCR Master Mix 10μl；Primer F/R（10μmol·L-1） 1μl；cDNA 2μl，加雙蒸水至20μl。反應(yīng)條件：95℃30s 1個(gè)循環(huán)；95℃5s、60℃31s 40個(gè)循環(huán)；95℃15s、60℃60s、95℃15s 1個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct法計(jì)算COX1和COX2 RNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 心功能測(cè)定 再次依上法制作大鼠冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流模型25只并予隨機(jī)編號(hào)，其中10只術(shù)前30min腹腔注射吲哚美辛（5mg/kg），15只注射等量0.9%氯化鈉注射液。備皮，消毒頸前區(qū)，沿正中線剪開(kāi)皮膚，分離暴露右側(cè)頸動(dòng)脈，止血夾頸夾閉頸動(dòng)脈近心端，遠(yuǎn)端完全絲線結(jié)扎，在止血夾與絲線中點(diǎn)作頸動(dòng)脈斜切口，插入測(cè)壓導(dǎo)管，松開(kāi)止血夾，當(dāng)遇到阻力時(shí)停下，待心臟收縮時(shí)插入左心室，連接多導(dǎo)電生理儀，記錄左心室舒張末期壓力（LVEDP），計(jì)算等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率（dp/dt）和等容舒張期左心室壓力下降的最大速率（-dp/dt）。然后注入2%氯化鉀溶液，同前測(cè)定心肌梗死區(qū)熒光信號(hào)，計(jì)算心肌無(wú)復(fù)流區(qū)面積并進(jìn)行分組。將注射吲哚美辛大鼠中心肌無(wú)復(fù)流區(qū)面積＞20%且面積排位在前的6只作為吲哚美辛組；注射氯化鈉大鼠中心肌無(wú)復(fù)流區(qū)面積＞20%且面積排位在前的6只作為模型組，面積≤20%的6只作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中吲哚美辛組1只大鼠死于惡性心律失常，余大鼠完成實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用成組資料t檢驗(yàn)；多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)復(fù)流組與對(duì)照組大鼠血清CRP和IL-6水平的比較 無(wú)復(fù)流組大鼠血清CRP水平為對(duì)照組的2.4倍 [（322.64±22.58）μg/ml比（134.33±13.32）μg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；無(wú)復(fù)流組大鼠IL-6水平也高于對(duì)照組[（141.10±21.23）pg/ml比（102.05±17.81）pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 無(wú)復(fù)流組與對(duì)照組大鼠心肌COX1和COX2 RNA轉(zhuǎn)錄水平比較 無(wú)復(fù)流組大鼠左心室心肌COX1的RNA轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組明顯上調(diào)（1.7∶1），COX2轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組也明顯上調(diào)（3.68∶1），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 吲哚美辛組﹑無(wú)復(fù)流模型組和對(duì)照組大鼠心臟功能的比較 見(jiàn)表1。

表1 吲哚美辛組、無(wú)復(fù)流模型組和對(duì)照組大鼠心臟功能比較

由表1可見(jiàn)，無(wú)復(fù)流模型組大鼠LVEDP顯著高于對(duì)照組，HR﹑dp/dt和-dp/dt均顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；吲哚美辛組大鼠LVEDP顯著低于對(duì)照組，HR﹑dp/dt和-dp/dt均顯著高于無(wú)復(fù)流模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流現(xiàn)象因其在AMI再灌注治療后高發(fā)，引起臨床上的廣泛關(guān)注。無(wú)復(fù)流現(xiàn)象一旦發(fā)生，如不及時(shí)處理可長(zhǎng)期存在。無(wú)復(fù)流現(xiàn)象對(duì)AMI患者的心肌缺血區(qū)血流改善、心臟收縮舒張功能均會(huì)產(chǎn)生不良影響，影響患者PCI手術(shù)效果及預(yù)后。無(wú)復(fù)流的產(chǎn)生和發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，目前主要有:內(nèi)皮細(xì)胞損傷、白細(xì)胞激活、氧自由基介導(dǎo)的微血管損傷、微血栓、斑塊碎片等[4]。在這些無(wú)復(fù)流機(jī)制理論中，炎癥因子貫穿于心肌細(xì)胞損傷的全過(guò)程，且能夠滲透到其他損傷因素中發(fā)揮作用，是十分活躍的中介因子。Li等[5]發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體前列腺素E1（Lipo-PGE1）能夠縮小心肌梗死再灌注小型豬模型無(wú)復(fù)流區(qū)域，減輕炎癥反應(yīng)和無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，保護(hù)受損心肌。因此，炎癥反應(yīng)在AMI患者PCI術(shù)后無(wú)復(fù)流發(fā)生中占有重要地位。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，急診PCI術(shù)后無(wú)復(fù)流患者，血清CRP等炎癥因子水平明顯升高，提示冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流的產(chǎn)生可能與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[6-7]。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流模型，發(fā)現(xiàn)無(wú)復(fù)流組大鼠血清CRP和IL-6水平較對(duì)照組明顯升高，提示炎癥反應(yīng)可能在冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流中發(fā)揮重要作用。因而，術(shù)前對(duì)AMI患者行炎癥因子測(cè)定，或許可以預(yù)測(cè)無(wú)復(fù)流的產(chǎn)生。本研究中，冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流大鼠左心室COX1和COX2的RNA轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組升高，提示CRP等炎癥因子可能通過(guò)上調(diào)COX1和COX2基因表達(dá)，誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，從而引起PCI術(shù)后無(wú)復(fù)流現(xiàn)象發(fā)生。吲哚美辛為臨床常用非甾體抗炎藥，通過(guò)阻斷COX2發(fā)揮消炎止痛的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)無(wú)復(fù)流大鼠行腹腔注射吲哚美辛后，其心肌無(wú)復(fù)流面積及左室舒張收縮功能較無(wú)復(fù)流模型組大鼠有顯著改善，提示吲哚美辛可能通過(guò)阻斷COX2途徑改善大鼠心肌無(wú)復(fù)流情況。

炎癥是臨床最為常見(jiàn)、最為重要的基本病理過(guò)程，諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展都與之密切相關(guān)。參與炎癥反應(yīng)的因子數(shù)量繁多，通路機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，是臨床觀察和基礎(chǔ)研究經(jīng)久不衰的熱點(diǎn)話題。非甾體抗炎藥可以通過(guò)抑制COX2的活性﹑減少前列腺素合成來(lái)減輕炎性反應(yīng)；還可以通過(guò)抑制磷酸二酯酶（PDE）活性來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，從而穩(wěn)定溶酶體膜，減少溶酶體的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)。近年來(lái)，炎癥因子與冠狀動(dòng)脈PCI術(shù)后無(wú)復(fù)流的關(guān)系日益密切；多項(xiàng)研究證實(shí)，抑制炎癥因子活性能夠減輕無(wú)復(fù)流，從而保護(hù)心臟[4,8]。本研究中，對(duì)無(wú)復(fù)流大鼠應(yīng)用COX2阻斷劑后，LVEDP﹑dp/ dt和-dp/dt較模型組大鼠均有顯著改善，提示吲哚美辛能夠改善無(wú)復(fù)流大鼠心臟舒張收縮功能，證明對(duì)炎癥通路的阻斷能夠改善大鼠冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流情況，增加心肌梗死后大鼠梗死區(qū)心肌血供，從而保護(hù)梗死區(qū)心肌細(xì)胞，改善預(yù)后。

綜上所述，CRP、IL-6血清濃度有可能是AMI患者PCI術(shù)后是否發(fā)生無(wú)復(fù)流的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，也可能成為判斷AMI患者預(yù)后的重要指標(biāo)。如何降低AMI患者PCI術(shù)前血清CRP濃度，下調(diào)COX途徑激活水平，減輕冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而降低無(wú)復(fù)流發(fā)生概率，提高PCI成功率，改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后，可能是今后心血管病研究的重要方向。以非甾體類抗炎藥為代表的抗炎藥物，可能通過(guò)阻斷或抑制炎癥相關(guān)途徑，減輕血管內(nèi)皮炎癥，降低冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流的發(fā)生，從而改善AMI患者PCI術(shù)后心臟血流和臨床預(yù)后。

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Effect of cyclooxygenase on no-reflow phenomenon in acute myocardial infarction of rats

YANG Dong,JIAO Qibin,ZHANG Xingwei.Department of Cardiovascular Diseases，the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310011，China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of cyclooxygenase(COX)on no-reflow phenomenon in acute myocardial infarction(AMI). Methods Acute myocardial infarction was induced by ligation and reperfusion of the left anterior descending coronary artery(LAD)in Sprague Dawley(SD)rats.Thioflavin S was injected for the measurement of the no-reflow area in the left ventricle of rats;then the rats were divided into the no-reflow group and the normal-reflow group.The serum levels of C-reactive protein(CRP)and interleukin(IL)-6 were determined by ELISA after the operation.Real-time PCR was used to detect the transcription levels of the COX1,2 in left ventricle.Indometacin was used to block cyclo-oxygenase-2 pathway.The heart rate (HR),left ventricular end diastolic pressure(LVEDP),positive and negative peak first derivative(±dp/dt max)were measured through carotid artery intubation by the end of balanced perfusion. Results Serum CRP and IL-6 levels in no-reflow group were significantly higher than those in normal-reflow group(both P＜0.05).The expressions of COX1,2 in left ventricle were elevated in no-reflow group compared to normal-reflow group (both P＜0.05).The heart functions of no-reflow group were decreased compared to normal-reflow group.LVEDP in no-reflow group was higher than that in normal-reflow group.Moreover,HR and± dp/dt were significantly decreased in no-reflow group.With indometacin injection LVEDP and±dp/dt of no-reflow group were significantly improved (all P＜0.05). Conclusion Inflammatory factors CRP and IL-6 may be involved in the no-reflow phenomenon of AMI,which may be associated with the effect of cyclooxygenase.Indometacin can block the COX pathway and decrease the no-reflow in AMIofrats.

Cyclo-oxygenase Acute myocardium infarction No-reflow phenomenon Inflammatory factor

2015-10-15）

（本文編輯：沈叔洪）

浙江省科技廳科技計(jì)劃（2008C30039）；杭州市科技局醫(yī)學(xué)重點(diǎn)專科專病項(xiàng)目（20090833Q08）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2111051）

310011 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科

張邢煒，E-mail：hsdzxw@126.com