于曉俊，曹紹玉，李 翔，張 穎，宋 婷，董玉梅，畢保良，張應(yīng)華，許俊強(qiáng)

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省滇臺(tái)農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，云南昆明 650201)

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LAT52啟動(dòng)子在甘藍(lán)花藥中的表達(dá)模式

于曉俊，曹紹玉，李 翔，張 穎，宋 婷，董玉梅，畢保良，張應(yīng)華，許俊強(qiáng)*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省滇臺(tái)農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，云南昆明 650201)

[目的]驗(yàn)證花藥特異性啟動(dòng)子LAT52能否在甘藍(lán)花藥中發(fā)揮功能。[方法]從番茄中擴(kuò)增得到LAT52核心序列608 bp，進(jìn)行序列分析，連接LAT52啟動(dòng)子到雙元表達(dá)載體pBI121，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，用農(nóng)桿菌浸染法侵染甘藍(lán)幼苗下胚軸，獲得2株陽(yáng)性植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株的花蕾、花藥及花粉進(jìn)行GUS染色。[結(jié)果]LAT52核心序列608 bp具多個(gè)與花粉特異性表達(dá)相關(guān)的元件，浸染的LAT52啟動(dòng)子僅在花藥及花粉中表達(dá)出藍(lán)色，其他部位未染上藍(lán)色。[結(jié)論]LAT52啟動(dòng)子僅在甘藍(lán)花藥及花粉中特異性表達(dá)。

LAT52啟動(dòng)子；甘藍(lán)；花藥；GUS；表達(dá)模式

花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)是開(kāi)花植物的重要生理過(guò)程，花粉發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)被分為早期和晚期2個(gè)階段。目前已從多種植物中分離得到花粉特異性啟動(dòng)子，如番茄[1]、玉米[2]、土豆[3-4]、水稻[5]等。從番茄成熟花粉粒cDNA文庫(kù)中篩選鑒定出4個(gè)基因：LAT51、LAT52、LAT58及LAT59，均屬于晚基因，其mRNA在有絲分裂后出現(xiàn)，開(kāi)花期含量達(dá)到最高。LAT52在花粉成熟和花粉管伸長(zhǎng)早期直接表達(dá)組織原位雜交結(jié)果表明，其內(nèi)源mRNA除在花粉粒中表達(dá)外，也在花藥組織中表達(dá)[6-7]。LAT52啟動(dòng)子具高度小孢子特異性，LAT52-barnase轉(zhuǎn)基因?qū)е轮参镌趩渭?xì)胞小孢子階段發(fā)生細(xì)胞程序性死亡[8]；Oldenhof等[9]利用Northern分析表明，LAT52啟動(dòng)子僅在單細(xì)胞小孢子中檢測(cè)到。雖然番茄LAT52基因啟動(dòng)子被發(fā)現(xiàn)較早[1，6]，但在最新的花粉研究中仍被廣泛應(yīng)用。Grant-Downton等[10]構(gòu)建了LAT52啟動(dòng)下的人工小RNA(artificial MICRORNA)在擬南芥中有效發(fā)揮，其在小孢子發(fā)育晚期表達(dá)且隨后在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞積累；Guan等[11]構(gòu)建了LAT52啟動(dòng)下的gMPK6-YFP表達(dá)盒，并轉(zhuǎn)化mpk3-/-mpk6-/-胚芽致死雙突變體，利用熒光標(biāo)記技術(shù)觀察含mpk3mpk6雙突變體的擬南芥花粉管生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明，擬南芥花粉管正常生長(zhǎng)，但mpk3mpk6雙突變體使引導(dǎo)花粉正常運(yùn)輸?shù)男盘?hào)機(jī)制功能受損；Gupta等[12]將LAT52-PTEN1的RNAI載體轉(zhuǎn)入擬南芥，顯微觀察顯示大量成熟花粉粒存在缺陷，表明PTEN1基因是花粉發(fā)育所必需的；Guan等[13]構(gòu)建了LAT52：：4myc-WRKY34，表明其在花粉二細(xì)胞階段發(fā)生磷酸化，而在三細(xì)胞階段發(fā)生去磷酸化，WRKY34的磷酸化對(duì)雄配子體發(fā)育的生物功能起到重要作用；Yu等[14]利用花粉特異性啟動(dòng)子LAT52，構(gòu)建了云杉HAP5RNAi和FKBP12 RNAI，結(jié)果表明，HAP5改變了花粉管的生長(zhǎng)方向，并證明HAP5和FKBP12存在相互作用以調(diào)控花粉管發(fā)育及定位；Leydon等[15]將LAT52：DsRED、LAT52：GUS等一系列轉(zhuǎn)基因植株的花粉管進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，助細(xì)胞退化，花粉管伸長(zhǎng)未啟動(dòng)，并指出未授粉的基本發(fā)育途徑介導(dǎo)的助細(xì)胞退化。表明LAT52啟動(dòng)子在花粉發(fā)育及其他相關(guān)生化過(guò)程中有重要的應(yīng)用。

結(jié)球甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL．)在世界各地普遍種植，是歐美各國(guó)主要蔬菜，也是我國(guó)主要蔬菜之一。甘藍(lán)因具自交不親和性，目前對(duì)甘藍(lán)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)方面的研究較多，而LAT52啟動(dòng)子在甘藍(lán)花粉發(fā)育過(guò)程中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者將LAT52啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)化甘藍(lán)，驗(yàn)證該啟動(dòng)子能否在甘藍(lán)花藥中特異性啟動(dòng)下基因表達(dá)，以期為甘藍(lán)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料甘藍(lán)品種寒勝購(gòu)自重慶三千種業(yè)有限公司；雙元表達(dá)載體pBI121(含35S啟動(dòng)子、GUS報(bào)告基因)、農(nóng)桿菌GV3101于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)滇臺(tái)中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；PEASY Blunt simple克隆載體、Trans T1感受態(tài)細(xì)胞、TransStartFastPfuFlyDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)。根據(jù)NCBI中番茄(SOLANUM LYCOPERSICUM)花藥特異性啟動(dòng)子LAT52序列(GenBank：X15855.1)設(shè)計(jì)引物L(fēng)AT52-F：GCGCAAGCTTGGTGTCGACATACTCGACTCAGAAGG，LAT52-R：GAATTGAACGCGGCAAGTATCACAG，LAT52-inner：GCGCGGATCCTAAATTGGAATTTTTTTTTTTG，上下游引物分別加入Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)。

1.2.2LAT52啟動(dòng)子的克隆及亞克隆。以番茄gDNA為模板，以LAT52-F/LAT52-R為引物。反應(yīng)體系:ddH2O 14.0 μL，5×PCR 緩沖液(Mg2+)5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，引物各1.0 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，稀釋模板DNA 1.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。連接克隆載體PEASY Blunt simple，PCR檢測(cè)，并測(cè)序。以測(cè)序正確的片段為模板，LAT52-F/LAT52-inner為引物亞克隆得到LAT52片段，測(cè)序并命名為pB-LAT52。

1.2.3番茄LAT52啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)載體構(gòu)建。將測(cè)序正確的pB-LAT52質(zhì)粒和pBI121表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切后回收目的片段，連接構(gòu)建帶有卡那霉素(NPT II)抗性的表達(dá)載體pBI-LAT52(圖1)，以轉(zhuǎn)化pBI121陽(yáng)性質(zhì)粒的菌株為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照。

圖1 pBI121(A)和pBI-LAT52(B)T-DNA區(qū)域示意

1.2.4甘藍(lán)下胚軸浸染及抗性植株再生。將下胚軸切成

1 cm左右的小段，預(yù)培養(yǎng)2 d，浸入重懸浮菌液中浸染5 min，期間不斷搖動(dòng)，于無(wú)菌濾紙上吸干菌液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基培養(yǎng)，25 ℃暗培養(yǎng)2 d，再移入含有卡那霉素選擇培養(yǎng)基上篩選，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照時(shí)間16 h/d。將未轉(zhuǎn)化成功的下胚軸轉(zhuǎn)入新選擇培養(yǎng)基，當(dāng)長(zhǎng)至1 cm以上時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。

1.2.5GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)。GUS組織化學(xué)染色參考Jefferson等[16]的方法。將轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照的花蕾、花藥及花粉分別置于X-GLUC染色液中，真空抽氣30 min，37 ℃放置過(guò)夜，用70%乙醇進(jìn)行脫色洗去葉綠素，至陰性對(duì)照呈白色，電子顯微鏡下觀察拍照，藍(lán)色部分即為GUS基因的表達(dá)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄LAT52啟動(dòng)子的克隆番茄gDNA以LAT52-F/LAT52-R擴(kuò)增得到LAT52，片段大小為736 bp(圖2)，以LAT52-F/LAT52-inner復(fù)制得到片段大小為608 bp(圖2B)，表明該片段與LAT52(GENBANK：X15855.1)極度相似，差別只在于增加了7個(gè)堿基ATAAAAA，且屬于高度重復(fù)片段[17]。說(shuō)明正確克隆了LAT52啟動(dòng)子核心區(qū)域。

2.2 番茄LAT52啟動(dòng)子序列分析測(cè)定PLANTCARE和PLACE片段序列，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，該序列含有代表性的CAAT-box和TATA-box，CCACAAAAA為L(zhǎng)AT52所含片段[18]，含大量調(diào)控花藥生長(zhǎng)相關(guān)的作用片段，如GTGA-box、POLLEN1LeLAT52(AGAAA-box)、TCATTT-box，以及特定調(diào)控花粉的片段、2個(gè)GTGA元件和2個(gè)AGAAA等[19-20]。此外還含有提高調(diào)控花粉特定表達(dá)能力的TGTGG-box。

圖2 番茄LAT52啟動(dòng)子的克隆(A)及亞克隆(B)

注：花粉特異性表達(dá)相關(guān)順式作用元件用方框表示；底紋區(qū)域CCACAAAAA為L(zhǎng)AT52啟動(dòng)子中高度保守的序列；AGAA、GTGA、TGTGG和TCATTT為花藥特異表達(dá)元件。

注：A中M.Trans2k Plus DNA marker；1～3.pBI-LAT52 PCR檢測(cè)；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照。B中M.Trans2k Plus DNA marker；1～8.轉(zhuǎn)基因植株LAT52片段PCR檢測(cè)；P.陽(yáng)性對(duì)照，N.陰性對(duì)照。

2.3 LAT52表達(dá)載體構(gòu)建將構(gòu)建好的雙元表達(dá)載體pBI-LAT52和對(duì)照質(zhì)粒，通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果得到大小約為600 bp的條帶，與目的基因大小一致，說(shuō)明pBI-LAT52載體成功轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中。

2.4 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株的分子驗(yàn)證通過(guò)組織培養(yǎng)抗性篩選，共獲得8株抗性植株，將長(zhǎng)出真葉的幼苗及對(duì)照材料分別提取gDNA，使用LAT52-F/LAT52-inner引物對(duì)8株轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，2號(hào)和3號(hào)植株擴(kuò)增出大小正確的條帶，說(shuō)明這2株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(圖4)。

2.5 番茄LAT52啟動(dòng)子在甘藍(lán)中的表達(dá)模式對(duì)檢測(cè)正確的pBI-LAT52植株、陽(yáng)性植株進(jìn)行GUS染色。結(jié)果顯示，pBI-LAT52完整移入植株中，僅LAT52花粉特異性啟動(dòng)子引導(dǎo)下游GUS報(bào)告基因表達(dá)(圖5A、B)。進(jìn)一步對(duì)花粉進(jìn)行GUS染色，結(jié)果顯示，花粉中部分變藍(lán)，而陰性對(duì)照均未染色(圖5C)，pBI121質(zhì)粒所在花蕾中，各部分成功變藍(lán)。表明LAT52啟動(dòng)子在花粉中行使其功能。

注：A.花蕾；B.花藥；C.花粉。

3 結(jié)論與討論

植物開(kāi)花過(guò)程中的花藥和花粉發(fā)育是必經(jīng)階段，在此過(guò)程中有大量基因在不同時(shí)空表達(dá)，其中包含大量花藥與花粉特異性及相關(guān)表達(dá)基因的研究，花粉組織特異性啟動(dòng)子在花粉發(fā)育過(guò)程中起重要作用?；ǚ郯l(fā)育相關(guān)的特異性啟動(dòng)子有TA29、LAT52、Osg6B、Zm13、S1等。對(duì)番茄LAT52啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn)，-3 000～-492 bp區(qū)域與啟動(dòng)子活性無(wú)關(guān)，-492～-145 bp和 -124～-86 bp區(qū)域有增強(qiáng)表達(dá)的作用，而-71～100 bp區(qū)段足以啟動(dòng)基因在花粉中特異表達(dá)[1，6，21]。該研究擴(kuò)增得到具有增強(qiáng)表達(dá)和啟動(dòng)作用的區(qū)域，包括花粉特異基因時(shí)空表達(dá)的GTGA-box、POLLEN1LeLAT52(AGAAA-box)及TCATTT-box；同時(shí)含有與花粉特異性表達(dá)相關(guān)的順式作用元件GTGA-box和AGAAA-box[19-20]；此外還含有具有增強(qiáng)花粉特異性表達(dá)的作用的TGTGG-box。

LAT52啟動(dòng)子最初在番茄中得到克隆并進(jìn)行了功能驗(yàn)證，隨后又在其他物種中得到了確認(rèn)。Francis等[22]將LAT52：XFP載體通過(guò)農(nóng)桿菌蘸花轉(zhuǎn)化擬南芥，在T1代轉(zhuǎn)基因植株花粉四分體時(shí)期檢測(cè)到不同顏色的熒光；Tang等[23]構(gòu)建了LAT52驅(qū)動(dòng)的LAT52-GFPN轉(zhuǎn)化擬南芥花粉質(zhì)體，在轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代成熟花粉中檢測(cè)到GFP熒光。該研究對(duì)分別轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)的花蕾、花藥及花粉進(jìn)行GUS染色，結(jié)果轉(zhuǎn)pBI-LAT52的植株僅在花藥部分染出藍(lán)色，花蕾的其他組織中未染色，說(shuō)明pBI-LAT52質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入植株中，且番茄LAT52花粉特異性啟動(dòng)子在甘藍(lán)花藥及花粉中啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，而在其他部位組織中無(wú)法啟動(dòng)。在轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照植株的花蕾中，花藥、花瓣、萼片、柱頭及花梗均染上藍(lán)色，而陰性對(duì)照均未染上藍(lán)色。該研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致，說(shuō)明LAT52啟動(dòng)子能夠在甘藍(lán)花藥中特異性啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，該研究可為甘藍(lán)花粉萌發(fā)及花粉管伸長(zhǎng)機(jī)理的研究提供參考。

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Expression Profile ofLAT52 Promoter in Anther ofBrassicaoleraceaL.

YU Xiao-jun, CAO Shao-yu, LI Xiang, XU Jun-qiang*et al (Dian-Tai Engineering Research Center for Characteristic Agriculture Industrialization of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201)

[Objective] To verify whether specific promoterLAT52 could play a function in anther of cabbage. [Method]LAT52 core sequence 608 bp was obtained from tomato by amplification technology, the sequence was analyzed, theLAT52 promoter was connected to the binary expression vector pBI121,AgrobacteriumGV3101 was transformed,Agrobacteriuminfection method was used to infecthypocotylof cabbage seedling, and 2 positive plants were obtained, transgenic cabbage plants flower bud, anther and pollen was stained by GUS. [Result] TheLAT52 core sequence 608 bp had multiple pollen specific expression elements. The infectedLAT52 promoter only expressed blue in the anther and pollen, and the other parts were not stained blue. [Conclusion] TheLAT52 promoter can be expressed in anther and pollen of cabbage. Key wordsLAT52 promotor;BrassicaoleraceaL.; Anther; GUS; Expression pattern

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560560)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015FD019)。

于曉俊(1992- )，男，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向：園藝蔬菜遺傳與育種。*通訊作者，講師，博士，從事蔬菜與分子生物學(xué)研究。

2016-09-02

S 635

A

0517-6611(2016)30-0104-04