農(nóng) 倩， 唐照磊， 杜 青， 李石初

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，廣西南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西南寧 530007)

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玉米內(nèi)生細(xì)菌的動(dòng)態(tài)分布及拮抗作用

農(nóng) 倩1,2， 唐照磊1， 杜 青1， 李石初1

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，廣西南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西南寧 530007)

[目的]比較不同品種及生育期玉米內(nèi)生細(xì)菌的多樣性差異，對分離到的內(nèi)生細(xì)菌的拮抗作用進(jìn)行鑒定。[方法]以桂單0810、迪卡008、正大619玉米品種苗期和穗期的不同組織為研究對象，采用組織研磨勻漿方法分離培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)生理特征和16S rDNA基因序列同源性比對分析對菌株進(jìn)行了分類，并測定了所分離的菌株對4種玉米病原菌的拮抗作用。[結(jié)果]從桂單0810、迪卡008、正大619這3個(gè)玉米品種苗期和穗期的根、莖、葉中共分離到82株內(nèi)生細(xì)菌，歸于4個(gè)屬，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌群，各菌群在不同生育期及組織的分布動(dòng)態(tài)各有特點(diǎn)，其中有8株菌對4種玉米病原菌表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用。[結(jié)論]玉米內(nèi)生細(xì)菌的多樣性豐富，可作為玉米病害生防菌的來源。

玉米；內(nèi)生細(xì)菌；動(dòng)態(tài)分布；拮抗作用

植物內(nèi)生細(xì)菌是指能在健康植物組織內(nèi)棲居且對植物不造成危害并建立和諧聯(lián)合關(guān)系的細(xì)菌[1]。研究表明，內(nèi)生細(xì)菌為植物微生態(tài)系統(tǒng)天然組成部分，其存在可提高植物對惡劣環(huán)境的適應(yīng)性及促進(jìn)寄主植物生長，還可作為潛在的內(nèi)生拮抗細(xì)菌加以利用，減少化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染，提高農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，保持生態(tài)平衡[2]。植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)不僅因作物種類不同而存在差異[3]，還隨著植物生長期、組織器官不同而有差別[4-5]。筆者以桂單0810、迪卡008、正大619這3個(gè)玉米品種苗期和穗期的不同組織為研究對象，采用組織研磨勻漿方法分離培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)生理特征和16S rDNA基因序列同源性比對分析對菌株進(jìn)行了分類，并測定了所分離的菌株對4種玉米病原菌的拮抗作用，旨在為玉米病害的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料玉米品種為桂單0810、迪卡008和正大619。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；TaqPCR Mix為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Gene JET為Thermo Scientific 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1玉米種植與樣本采集。將玉米品種桂單0810、迪卡008和正大619植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽實(shí)驗(yàn)基地，隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)品種種植3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)5行，行長4.00 m，行距0.65 m，每行17株。于苗期和抽穗期進(jìn)行樣本采集，采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)采4株。

1.2.2內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化。將樣本用自來水沖洗干凈，稱取根、莖、葉各1.0 g，75%乙醇表面消毒1 min，0.1%氯化汞消毒根3 min、莖2 min、葉片1 min，無菌水沖洗3次后，加10 mL無菌水研磨至勻漿，吸取最后一次沖洗液(作為對照)和勻漿各1 mL稀釋1 000倍，分別取1 mL稀釋液置于培養(yǎng)皿，倒入營養(yǎng)瓊脂(NA)固體培養(yǎng)基25 mL并混勻，28 ℃培養(yǎng)24～72 h。根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)分類，計(jì)數(shù)，挑取菌落形態(tài)、色澤及培養(yǎng)基顏色等不同的菌株按常規(guī)方法純化，純化菌株轉(zhuǎn)接入含有80%甘油的離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定包括菌落外形觀察、革蘭氏染色和顯微鏡觀察[6]。

1.2.4細(xì)菌基因組DNA提取。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，操作按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度及其完整性，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增與測序。采用通用引物對細(xì)菌16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中含10 μL 2×TaqPCR Mix,2 μL DNA,4 μmol/L上、下游引物各1 μL,6 μL雙蒸水。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用Gene JET膠回收試劑盒回收PCR，委托上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.6序列生物信息分析。將獲得的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行同源性比對，采用基因序列分析軟件DNAMAN和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建軟件MEGA 7.0，與基因GenBank 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)屬種基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析[7]。

1.2.7拮抗作用鑒定。以玉米紋枯病、玉米大斑病、玉米小斑病和玉米莖腐病4種病原菌為供試病原菌，對分離到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行拮抗作用測試。采用平板對峙法，將已活化的直徑5 mm的病原菌塊接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板培養(yǎng)基中央，病原菌塊四周等距離接入分離到的菌株，28 ℃培養(yǎng)7 d后測量病原菌向拮抗菌方向的生長距離，以僅接種病原菌塊的平板為對照，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對照病原菌菌落半徑-病原菌向拮抗菌方向生長距離)/對照病原菌菌落半徑×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離數(shù)量及鑒定從苗期各組織樣本中分離獲得內(nèi)生細(xì)菌36株，從穗期樣本中分離得到46株；從根中分離得到的菌株數(shù)量最多，為44株，莖中數(shù)量次之，為21株，葉中數(shù)量最少，為17株；從桂單0810獲得的菌株數(shù)量最多，為36株，迪卡008次之，為28株(表1)。對獲得的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列比對分析發(fā)現(xiàn)，82株內(nèi)生細(xì)菌分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)4個(gè)屬(圖1)，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢類群，菌株數(shù)量為52株，占總數(shù)的63.4%(表1)。

表1 不同生育期玉米各組織中分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量

2.2 內(nèi)生細(xì)菌類群的變化隨著生育期變化，植株內(nèi)生細(xì)菌種類也有所變化。其中，桂單0810、迪卡008從苗期到穗期的內(nèi)生細(xì)菌種類有所增加，桂單0810苗期未分離到假單胞菌屬，但穗期階段獲得了假單胞菌屬；迪卡008苗期只含有芽孢桿菌屬和腸桿菌屬，穗期多分離到黃單胞菌屬和假單胞菌屬，正大619的內(nèi)生細(xì)菌種類在不同生育期無變化(表2)?？梢姡煌贩N的內(nèi)生細(xì)菌種類變化情況存在差異。

表2 不同生育期內(nèi)生細(xì)菌種類的變化

圖1 玉米內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的變化分離計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，玉米植株內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量隨著生育期發(fā)展呈上升趨勢，其中桂單0810增幅最大，由苗期的1.983×104cfu/g增長至穗期的12.307×104cfu/g，增加了6.2倍。穗期各品種間的內(nèi)生細(xì)菌總量差異達(dá)到顯著水平，表明不同品種間內(nèi)生細(xì)菌的富集能力存在差異，桂單0810較其他2個(gè)品種更易誘捕到內(nèi)生細(xì)菌定殖繁殖(表3)。

2.4 拮抗作用鑒定結(jié)果表明，82株內(nèi)生細(xì)菌中，有8株對4種病原菌表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用，其中菌株GD16對4種病原菌均表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用(表4)。

表3 不同生育期各組織中內(nèi)生細(xì)菌總量的變化

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列比對分析法對分離到的82株細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，玉米內(nèi)生細(xì)菌的多樣性較豐富，共鑒定出芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、黃單胞菌屬、假單胞菌屬4個(gè)屬，以芽孢桿菌屬為主，這與前人的分離結(jié)果一致[8]。

玉米內(nèi)生細(xì)菌的種類、數(shù)量與品種的遺傳背景及植株組織部位相關(guān)[5]。該研究表明，桂單0810和迪卡008均分離到4個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌，而正大619只分離到3個(gè)屬，其中桂單0810分離到的菌株數(shù)量最多，可能是該品種為當(dāng)?shù)剡x育品種，比較適應(yīng)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境和菌株的入侵。3個(gè)品種均表現(xiàn)為根組織中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量最大，莖和葉中數(shù)量次之，原因可能是由于根系統(tǒng)是內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)入植物的入口，所以根聚集內(nèi)生細(xì)菌比其他器官多[9]。在分離到的82株內(nèi)生細(xì)菌中，有8株對玉米紋枯病菌等4種病原菌有拮抗作用，其中4株(GD08、GD16、ZD13、DK17)為芽孢桿菌屬，1株(DK27)為假單胞菌屬。芽孢桿菌在玉米中分布廣、菌量大，在玉米植株過程中具有穩(wěn)定的內(nèi)生特性，并能夠形成芽孢，抵抗外界不良環(huán)境，有些菌株對植物病害有較好的防治作用[10]。假單胞菌屬是作物中具有穩(wěn)定溶磷效應(yīng)的優(yōu)勢菌種，分離自玉米的溶磷內(nèi)生細(xì)菌，具有ACC脫氨酶活性，可以促進(jìn)植株生長和防治植物病害[11]。并且假單胞菌能產(chǎn)生多種抗生素，改善植物營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長，并降解土壤中有毒物質(zhì)，對植株促生及防病作用明顯[12]。因此，該研究對3個(gè)玉米品種內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定可為進(jìn)一步研究細(xì)菌種屬多樣性與玉米品種特性的關(guān)系，并獲得有益微生物資源奠定基礎(chǔ)。

表4 內(nèi)生細(xì)菌對4種玉米病原菌的拮抗作用

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本刊提示 參考文獻(xiàn)只列主要的、公開發(fā)表的文獻(xiàn)，序號按文中出現(xiàn)先后編排。著錄格式(含標(biāo)點(diǎn))如下：(1)期刊——作者(不超過3人者全部寫出，超過者只寫前3位，后加“等”).文章題名[J].期刊名，年份，卷(期)：起止頁碼.(2)圖書——編著者.書名[M].版次(第一版不寫).出版地：出版者，出版年：起止頁碼.(3)論文集——析出文獻(xiàn)作者.題名[C]//.主編.論文集名.出版地：出版者，出版年：起止頁碼。

Dynamic Distribution and Antagonism of Endophytic Bacteria from Maize

NONG Qian1,2,TANG Zhao-lei1,DU Qing1et al (1.Maize Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007; 2.Microbiology Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007)

[Objective] The aim was to compare the endophytic bacteria diversity and antagonism function isolated from different maize varieties at different growth stages.[Method] With different tissues of Guidan0810,Dika008,Zhengda 619 at seedling stage and heading stage as research objects,endophytic bacteria were isolated and cultured by tissues homogenate.Strains were classified combined with morphological and physiological characteristics and sequence homology comparison of 16S rDNA gene,the antagonism ability of isolated strains to 4 maize pathogens were identified.[Result] Totally 82 strains which belonged to 4 genus were isolated from root,stem and leaf at seedling stage and heading stage of maize variety Guidan 0810,Dekarl 008 and Zhengda 619,and Bacillus was the dominant flora.The bacterial population composition was diverse from the growth stage and tissues.8 strains were showing antagonism ability to 4 pathogens.[Conclusion] The maize endophytic bacteria diversity is abundant,and can be the source of biocontrol bacterium for maize disease.

Maize; Endophytic bacteria; Dynamic distribution; Antagonism

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本業(yè)務(wù)專項(xiàng)(2014YQ25)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFBA118121)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所科技發(fā)展基金項(xiàng)目(玉ZX2014007)。

農(nóng)倩(1985- )，女，廣西河池人，助理研究員，碩士，從事植物內(nèi)生微生物應(yīng)用研究。

2016-09-14

S 182

A

0517-6611(2016)30-0003-04