房保海 賈俊濤 趙麗青 龐國興 門愛軍 岳志芹 梁成珠 徐 彪

(山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心1，青島 266002)(青島出入境檢驗檢疫局2，青島 266000)(山東出入境檢驗檢疫局3，青島 266000)

基于焦磷酸測序的花生過敏原基因Ara h6檢測技術(shù)研究

房保海1賈俊濤1趙麗青1龐國興2門愛軍3岳志芹1梁成珠1徐 彪1

(山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心1，青島 266002)(青島出入境檢驗檢疫局2，青島 266000)(山東出入境檢驗檢疫局3，青島 266000)

應用焦磷酸測序技術(shù)建立了檢測食品中花生過敏原基因Ara h6的快速檢測方法，該檢測方法對花生過敏原成分具有很好的特異性和重現(xiàn)性，測序結(jié)果在GenBank中進行同源性比對分析，表明目標序列能夠作為鑒定花生過敏原成分很好的特征序列，為食品中的花生過敏原成分快速檢測提供良好的技術(shù)支撐，保證了食品進出口和食用安全。

焦磷酸測序 花生 過敏原 Ara h6

過敏性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一，是當前世界性的重大衛(wèi)生學問題，世界各國過敏反應性疾病的總發(fā)病率高達10%～30%，此類型疾病包括食物過敏、過敏性哮喘和過敏性鼻炎等，是臨床上的常見病、多發(fā)病[1-2]。世界糧農(nóng)組織1995年報告，90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼海產(chǎn)品、花生、大豆、堅果類和小麥引起[3]。

食物中能使機體產(chǎn)生過敏反應抗原分子稱為食物過敏原，它們大多為蛋白質(zhì)[4-5]。據(jù)報道，花生過敏占食物過敏的10%～47%[6]，是重要的食物過敏原，可引起過敏性腸炎、過敏性皮炎等過敏性疾病，嚴重的甚至會發(fā)生過敏休克和過敏性死亡。國內(nèi)外對食用花生所引起的過敏性死亡案例均有報道[7]。鑒于目前尚無根治這類疾病的方法，美國及歐盟等國家要求在食品標簽上加注花生等主要過敏原成分標簽以防止過敏患者誤食[8-9]。同時，美國及歐盟等國家開始對部分進口食品進行花生過敏原抽檢，而我國食品出口企業(yè)常因食品過敏原標注不正確而遭遇退貨。因此，有必要開發(fā)一種實用、靈敏、特異的花生過敏原成分快速檢測方法。

花生是“90年代中國食物結(jié)構(gòu)改革與發(fā)展綱要”中提出的重點開發(fā)利用植物蛋白之一。隨著國民飲食結(jié)構(gòu)的變化，花生消費將不斷增加，花生過敏發(fā)病率可能會呈上升的趨勢。目前國際免疫聯(lián)合會命名小組委員會認可的花生過敏原有11種[10-14]，Ara h6 是花生中的過敏原之一，屬于 2S 白蛋白家族，與花生主要過敏原Ara h2 的氨基酸序列有59%的同源性[15]。Ara h6 約占花生蛋白總含量的 4.5%[16]，其分子質(zhì)量約為15 ku，等電點為5～6[17]。近年來，Ara h6蛋白在花生過敏反應中的重要作用已得到越來越多的關注[18]。

檢測食物中花生過敏原成分主要有2種方法，即檢測花生過敏原蛋白成分和檢測過敏原基因殘留。其中過敏原DNA殘留檢測技術(shù)主要依靠各種基于PCR為基礎的技術(shù)[19]。焦磷酸測序技術(shù)是基于序列合成原理的DNA序列測定技術(shù)，可以快速、準確地進行短DNA序列分析，操作簡便、高通量、速度快，且重復性和精確性好，無需進行電泳，也無需熒光染色和同位素標記，結(jié)果簡單易讀，已被廣泛應用于生物學多個相關領域。本研究建立了基于過敏原基因Ara h6的花生過敏原成分焦磷酸測序檢測技術(shù)，可快速確認出食品中是否含花生過敏原成分，能夠更好更快地鑒定過敏原食品標簽，保證食用安全。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試驗材料

花生樣品：實驗室檢驗的花生樣品和市購花生。花生醬為實驗室樣品；方便面、餅干、夾心餅干：自購。綠豆、豇豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、大豆：自購。

1.1.2 引物

PCR擴增引物(上游引物Ara h6-F 5’- AAGCTGCGAGAGGCAGGTAGA-3’；下游引物Ara h6-R 5’- TTTGCCTGTCCTGCAACCTAT-3’ ，5’端標記生物素)：invetrogen公司，擴增長度239 bp。

焦磷酸測序引物(arah 6-S 5’- GCTCATCGCAGCACC-3’)：invetrogen公司。

1.1.3 PCR試劑

2×GoTaq Master Mix PCR體系：天根生化科技有限公司；500 bp DNA Ladder Marker：大連寶生物公司。

1.1.4 焦磷酸測序所需試劑

焦磷酸測序試劑盒[包括焦磷酸測序用酶、底物及各種dNTP、鏈酶親和素磁珠(Sepharose beads)、綁定緩沖液(Binding Buffer)、復性緩沖液(Annealing Buffer)、變性緩沖液(Denaturation Buffer)、洗液(Washing Buffer)]：BD公司。

1.2 儀器設備

普通PCR儀(Mastercycler gradient)、離心機(5417R)、微量可調(diào)移液器(10、100、200、1 000 uL)：德國 Eppendorf 公司；電泳儀 (DYY-6C)：北京六一儀器廠；PyroMark ID檢測系統(tǒng)：瑞典Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 模板的制備

樣品處理：取花生等試驗材料100 g，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備用。

DNA模板的提取采用CTAB 法：取100 mg 樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL CTAB提取緩沖液和20 μL蛋白酶K溶液，充分混勻。65 ℃振蕩過夜后，13 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液700 μL至新的離心管中；加入700 μL三氯甲烷后用力振蕩，13 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)液移到新的2 mL離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置60 min，13 000 g離心5 min，棄去上清液。加入350 μL NaCl 溶液將沉淀進行懸浮，再加入350 μL 三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液到新的2 mL離心管中后加入 0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min，13 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入500 μL 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μL TE 溶液中，立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增

PCR反應體系：2×GoTaq Master Mix 25 μL，生物素標記上游引物和下游引物各10 pmoL，DNA模板2 μL，加無菌去離子水至50 μL。擴增反應參數(shù)：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，50個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫。取反應產(chǎn)物5 μL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余擴增產(chǎn)物用于焦磷酸測序。

1.3.3 焦磷酸測序

1.3.3.1 將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入Sepharose beads 3 μL和Binding Buffer 47 μL，常溫混勻10 min。

1.3.3.2 打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30 s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠，分別在70%乙醇中清洗5～10 s、Denaturation Buffer中變性5 s、Washing Buffer中清洗5～10 s。關閉真空泵，將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物0.3 μmol/L和Annealing Buffer共45 μL。

1.3.3.3 將96孔測序板置80 ℃溫箱2 min，冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應。設定程序，堿基的加入為ATCG 6～10個重復，根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及4種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。

2 結(jié)果和分析

2.1 PCR擴增引物特異性檢測結(jié)果

利用設計引物擴增各測試材料的特異基因片段，電泳結(jié)果顯示只有花生樣品能夠擴增出239 bp特異性基因片段，片段長度與引物設計的預期片段長度大小一致；綠豆、赤豆、豇豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、大豆均無擴增條帶出現(xiàn)(圖1)，說明引物能夠?qū)ㄉ^敏原基因Ara h6具有特異性。

注：M-DL 500 DNA Marker；1～10為花生樣品；11～17分別為綠豆、豇豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、大豆。

圖1 擴增引物特異性檢測

2.2 焦磷酸測序結(jié)果分析

對10個花生樣品的Ara h6基因PCR擴增結(jié)果均進行了焦磷酸測序，測序結(jié)果皆為TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，具有非常好的重現(xiàn)性(圖2)。

圖2 部分花生樣品Ara h6基因目的片斷焦磷酸測序結(jié)果

2.3 Arah 6基因焦磷酸測序目標序列同源性分析

對測序結(jié)果在GenBank中進行同源性比對，結(jié)果表明：目標序列與花生Ara h6基因聚為一簇，能夠作為鑒定花生過敏基因Ara h6基因很好的序列(表1)。

表1 Ara h6目標序列在genbank同源性比對獲得的同源性基因

表1(續(xù))

2.4 食品中花生過敏原基因DNA成分的檢測

用焦磷酸測序法檢測8種食品中是否花生主要過敏原基因Ara h6 DNA成分，判斷該食品中是否含有花生過敏原。結(jié)果表明，8種樣品檢測結(jié)果與食物過敏原標注內(nèi)容相符(表2)。

表2 焦磷酸測序法鑒別花生過敏原成分結(jié)果

3 討論和結(jié)論

國內(nèi)食品過敏原成分檢測尚處在起步階段，還沒有立法強制規(guī)定食品必須加注過敏原標簽。相比之下，歐、美、日等國家和地區(qū)為了防止消費者誤食食品中花生過敏原導致嚴重的過敏反應，近年來都制定了規(guī)范食品過敏原標簽的法律法案。如2006年1月1日美國FDA就開始實施新的《食品過敏原標識和消費者保護法規(guī)》[19]；2007年5月中國香港也開始實施食品過敏原標示；我國也于2011年4月20日公布了在2012年4月實施的GB 7718—2011《食品安全國家標準 預包裝食品標簽通則》, 增加了食品中可能含有過敏物質(zhì)時的推薦標示要求，對標注過敏物質(zhì)做出了規(guī)定：如果用麩質(zhì)的谷物、甲殼類動物、魚類、蛋類、花生類、大豆類、乳制品、堅果類等做配料, 或者是加工過程中可能帶入上述食物, “宜在配料表中使用容易辨識的名稱, 或在鄰近位置加以提示”[21]，這是我國第1個對食物過敏提出要求的食品安全管理規(guī)定。

我國食品出口企業(yè)經(jīng)常因為食品過敏原標簽標識不全或未真實標識而遭遇國外通報，2005年，中國因為食品標簽不符合要求或者提供的信息不全面而被美國FDA通報的產(chǎn)品數(shù)量約占中國輸美動植物類產(chǎn)品被通報總數(shù)的1/4，食品標簽問題已成為出口食品不合格的原因之一[20]。因此，建立一種可靠、快速、靈敏、特異的過敏原成分檢測方法快速鑒別是否含有進口國要求的過敏原十分必要。

花生是常見的食物過敏原之一，含有多種主要蛋白過敏原如Ara h1、Ara h2、Ara h6等?；ㄉ饕鞍走^敏原雖然耐熱，但加工過程的高溫處理等可能改變其空間結(jié)構(gòu)，從而有可能影響基于抗原抗體特異反應；相比之下花生基因組DNA在加熱、壓力等處理下仍會在較長的時間內(nèi)保持一定的完整性[22]，因此，檢測食物中殘留的花生主要過敏Arah系列基因DNA片斷可作為一種有效的花生過敏原檢測方法[23]，德國R-Biopharm開發(fā)了花生主要過敏原Ara h2 PCR檢測試劑盒[24]。

本研究建立了基于焦磷酸測序法的花生過敏原Ara h6的DNA片段快速檢測鑒定技術(shù)，結(jié)果表明，焦磷酸反應體系能夠有效的對Ara h6基因進行目標片段測序，測序結(jié)果與設定完全一致，對花生成分具有特異性，檢測復現(xiàn)性良好，為食品中的花生過敏原成分快速檢測提供很好的技術(shù)支撐，保證了食品的進出口和食用安全。

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Rapid Detection of Peanut Allergens Gene Ara h6 by Pyrosequencing Technology

Fang Baohai1Jia Juntao1Zhao Liqing1Pang Guoxing2Men Aijun3Yue Zhiqin1Liang Chengzhu1Xu Biao1

(Shandong Entry-Exit Inspectiono and Quarantine Bureau and Technical Center for Inspection & Quarantine1,Qingdao 266002)(Qingdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau2, Qingdao 266000)(Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau3, Qingdao 266000)

A rapid method was established to detect peanut allergen gene Ara h6 by pyrosequencing technology. This method has a very good specificity and reproducibility. Homology comparison analysis of pyrosequencing results (namely target sequences) in GenBank showed that this sequence can be used as a signature sequences to detect peanut allergens. This technology would provide technical supports of detecting peanut allergen in food, and also could ganrantee the safety of imported and exported food.

prosequencing, peanut, allergen, Ara h6

S565.1

A

1003-0174(2016)02-0127-05

國家質(zhì)檢總局項目(2011K221、2006IK105、2009IK176)

2014-07-10

房保海，男，1976年出生，高級工程師，食品安全檢測和風險評估