繆成貴 秦梅頌 陳建中 李成鳳 張 兵 李小楓 李 俊

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院1，鳳陽(yáng) 233100)(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2，合肥 230032)(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院3，合肥 230032)(安徽科技學(xué)院家禽疫病監(jiān)測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室4, 鳳陽(yáng) 233100)

大豆異黃酮影響類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠FLS凋亡

繆成貴1，3，4秦梅頌1陳建中1李成鳳1張 兵2李小楓3李 俊3

(安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院1，鳳陽(yáng) 233100)(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2，合肥 230032)(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院3，合肥 230032)(安徽科技學(xué)院家禽疫病監(jiān)測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室4, 鳳陽(yáng) 233100)

采用完全弗氏佐劑制備類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)模型對(duì)照大鼠，模型對(duì)照大鼠采用大豆異黃酮(Soybean isoflavone, SBI)灌胃治療后，分離大鼠滑膜組織，原代培養(yǎng)大鼠(Fibroblast like synoviocytes, FLS)，real time qPCR分別檢測(cè)SBI各劑量灌胃治療對(duì)模型對(duì)照組大鼠FLS細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和RA相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SBI 50 mg/kg體重、100 mg/kg體重和150 mg/kg體重3個(gè)劑量灌胃治療后，細(xì)胞凋亡因子caspase 3、促凋亡基因Bax表達(dá)顯著升高，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)顯著降低，MMP3和fibronectin表達(dá)同樣顯著降低。SBI可能通過(guò)促進(jìn)FLS凋亡影響模型對(duì)照組大鼠滑膜增值和關(guān)節(jié)炎癥。

大豆異黃酮 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 caspase 3 Bax Bcl-2

大豆異黃酮(Soybean isoflavone, SBI)是大豆黃酮類成分的一種，是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物。SBI具有雌激素類似的結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)入人體內(nèi)能發(fā)揮雌激素樣作用，影響多種生理病理過(guò)程[1-2]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，全世界發(fā)病率0.5%～1.0%，我國(guó)發(fā)病率約為0.5%[3-4]。成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast like synoviocytes, FLS)的激活增殖是RA發(fā)病的關(guān)鍵因素[5]，細(xì)胞凋亡因子caspase 3、細(xì)胞凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2和RA相關(guān)基因fibronectin、MMP3的異常表達(dá)能通過(guò)影響FLS的增殖凋亡影響RA的病理變化[6]。佐劑性關(guān)節(jié)炎與RA具有相似的病理特點(diǎn)，是常用的研究RA發(fā)病和治療的動(dòng)物模型[7]。本試驗(yàn)以caspase 3、Bax、Bcl-2，以及RA基因MMP3、fibronectin為研究靶點(diǎn)，研究SBI對(duì)FLS凋亡的影響，對(duì)RA相關(guān)基因MMP3、fibronectin表達(dá)的影響，為RA的防治提供新思路新方法，為SBI功效研究提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)熱電Forma 3111；超純水系統(tǒng)：美國(guó)密理博Milli-Q Reference；倒置熒光顯微鏡：奧林巴斯IX73+DP80；實(shí)時(shí)定量PCR儀：美國(guó)ABI公司；超凈工作臺(tái)：上海智城ZHJH-C1214C。

1.1.2 試劑

SBI：黑龍江永貞堂保健品有限公司，SBI 89.52%；布洛芬，中美天津史克制藥有限公司；QuantiFast? SYBR? Green PCR試劑盒：Qiagen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas；caspase 3、Bax、Bcl-2、MMP3、fibronectin定量PCR引物：上海生工。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 模型對(duì)照組大鼠制備

SD雄性大鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重180～200 g，透氣籠常規(guī)飼養(yǎng)，合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、SBI 50 mg/kg試驗(yàn)組、SBI 100 mg/kg試驗(yàn)組、SBI 150 mg/kg試驗(yàn)組，布洛芬8 mg/kg陽(yáng)性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后制備模型對(duì)照大鼠，正常對(duì)照組大鼠右后足趾注射0.1 mL PBS作為對(duì)照，其他5組大鼠采用完全弗氏佐劑于每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL致炎方法制備模型對(duì)照組大鼠。試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠采用常規(guī)灌胃方法灌胃藥物，每日灌胃時(shí)間為上午10點(diǎn)至11點(diǎn)，分組方案及灌胃量見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組方案

1.2.2 大鼠滑膜FLS原代培養(yǎng)

模型對(duì)照組大鼠制備后第4天，各治療組大鼠灌胃給藥治療，第28天股動(dòng)脈處死各組大鼠，超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌分離各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，D-Hanks液漂洗3次后，小剪刀剪碎滑膜組織。采用玻璃吸管將滑膜碎塊轉(zhuǎn)移至一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，均勻排列后每瓶細(xì)胞加含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2 mL，蓋好蓋子后倒置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 h，然后翻正繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)出組織塊。待FLS長(zhǎng)出組織塊后去除組織塊，更換培養(yǎng)基3 mL繼續(xù)培養(yǎng)3 d至細(xì)胞覆蓋瓶底90%，棄凈培養(yǎng)基，加胰蛋白酶1 mL 1 min，玻璃吸管吹打消化后傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)采用3～5代細(xì)胞。

1.2.3 模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分

采用大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分法研究SBI對(duì)模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)炎的治療作用，給藥劑量為8 mg/kg布洛芬作為陽(yáng)性藥物，用于對(duì)比分析SBI的治療作用。大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：1只模型對(duì)照組大鼠耳朵出現(xiàn)紅腫和結(jié)節(jié)記1分，1只模型對(duì)照組大鼠鼻子出現(xiàn)紅腫和結(jié)節(jié)記1分，1只模型對(duì)照組大鼠尾巴出現(xiàn)紅腫和結(jié)節(jié)記1分，1只模型對(duì)照組大鼠足爪出現(xiàn)紅腫和結(jié)節(jié)記1分，每只模型對(duì)照組大鼠最高評(píng)分為8分。

1.2.4 Real time qPCR檢測(cè)大豆異黃酮對(duì)caspase 3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響

Caspase 3、Bax、Bcl-2定量PCR引物由上海生工合成。采用Trizol試劑常規(guī)方法提取各組FLS總RNA，參照Fermentas試劑盒提供的方法逆轉(zhuǎn)錄得到各組大鼠FLS總RNA對(duì)應(yīng)的cDNA。參照Qiagen公司試劑盒提供的方法，采用real time qPCR檢測(cè)Bax、caspase 3、Bcl-2基因在空白對(duì)照組大鼠、模型對(duì)照組大鼠、各治療組大鼠FLS中表達(dá)。Real time qPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s。擴(kuò)展反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。定量PCR引物序列見表2。

1.2.5 Real time qPCR檢測(cè)大豆異黃酮對(duì)MMP3、fibronectin基因表達(dá)的影響

MMP3、fibronectin定量PCR引物由上海生工合成。采用Trizol試劑、常規(guī)方法提取各組大鼠FLS總RNA，參照Fermentas試劑盒提供的方法，逆轉(zhuǎn)錄得到各組大鼠對(duì)應(yīng)的cDNA。采用real time qPCR檢測(cè)RA相關(guān)基因MMP3、fibronectin在空白對(duì)照組大鼠、模型對(duì)照組大鼠、各試驗(yàn)組大鼠FLS中表達(dá)。Real time qPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃，15 s；60 ℃，30 s，72 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。定量PCR引物序列見表2。

表2 real time qPCR引物序列

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SBI對(duì)模型對(duì)照組大鼠治療作用

采用大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分法研究SBI對(duì)模型對(duì)照組大鼠的治療作用，采用布洛芬作為陽(yáng)性藥物。結(jié)果如圖1所示，模型對(duì)照組大鼠制備成功后第4天給藥，分別在第12天、第16天、第20天、第24天、第28天和第32天進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分。第16天開始，劑量為50、100、150 mg/kg的SBI均能顯著降低大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分分值，即SBI具有顯著的治療模型對(duì)照組大鼠的作用。與陽(yáng)性藥物布洛芬相比，SBI各組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分分值沒有差別，即SBI具有與常規(guī)抗炎藥布洛芬相似的抗炎作用。

注：與空白對(duì)照組相比﹡P<0.05，與模型對(duì)照組相比#P<0.05，n=10。

圖1 SBI對(duì)模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分分值的影響

2.2 Real time qPCR檢測(cè)SBI對(duì)caspase 3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響

采用real time qPCR檢測(cè)caspase 3、Bax、Bcl-2在空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、各試驗(yàn)組大鼠FLS中表達(dá)，圖3結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，caspase 3、Bax在模型對(duì)照組大鼠FLS中表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高；與模型對(duì)照組大鼠相比，caspase 3、Bax在各試驗(yàn)組FLS中表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低；同時(shí)SBI試驗(yàn)組與陽(yáng)性藥物組相比沒有顯著性差異，提示SBI具有較好的促進(jìn)模型對(duì)照大鼠FLS凋亡的作用。

注：a：Real time qPCR檢測(cè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、各試驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物組大鼠FLS中caspase 3基因表達(dá)；b：Real time qPCR檢測(cè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、各試驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物組大鼠FLS中Bax基因表達(dá)；c：Real time qPCR檢測(cè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、各試驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物組大鼠FLS中Bcl-2基因表達(dá)。與空白對(duì)照組相比﹡P<0.05，與模型對(duì)照組相比﹟P< 0.05，n=3 (圖3同)。

圖2 Real time qPCR檢測(cè)SBI對(duì)caspase 3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響

2.3 Real time qPCR檢測(cè)SBI對(duì)MMP3、fibronectin基因表達(dá)的影響

采用real time qPCR檢測(cè)MMP3、fibronectin在空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、各試驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物組大鼠FLS中表達(dá)，圖3結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，MMP3、fibronectin在模型對(duì)照組大鼠FLS中表達(dá)顯著升高；與模型對(duì)照組大鼠相比，各SBI試驗(yàn)組大鼠FLS中MMP3、fibronectin表達(dá)顯著降低；與陽(yáng)性藥物組相比，SBI各試驗(yàn)組大鼠FLS中MMP3、fibronectin表達(dá)沒有明顯差異。結(jié)果表明大豆異黃酮具有抑制模型對(duì)照組大鼠FLS中MMP3、fibronectin表達(dá)的作用。

注：a: Real time qPCR檢測(cè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、SBI各試驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物組大鼠FLS中MMP3表達(dá)；b: Real time qPCR檢測(cè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、SBI各試驗(yàn)組、陽(yáng)性藥物組大鼠FLS中fibronectin表達(dá)。

圖3 Real time qPCR檢測(cè)SBI對(duì)MMP3、fibronectin基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論

與空白對(duì)照相比，模型對(duì)照組大鼠FLS中caspase 3、Bax表達(dá)顯著降低，抗凋亡基因Bcl-2顯著升高。與模型對(duì)照組大鼠相比，SBI治療后，caspase 3、Bax表達(dá)顯著升高，抗凋亡基因Bcl-2顯著降低。與陽(yáng)性藥物組大鼠相比，SBI治療組大鼠FLS中caspase 3、Bax和Bcl-2表達(dá)沒有顯著差異，提示SBI對(duì)模型對(duì)照組大鼠FLS凋亡是有影響的，并且與常規(guī)抗炎藥物布洛芬有類似的作用。

與模型對(duì)照組大鼠相比，SBI治療后MMP3、fibronectin表達(dá)顯著降低，與陽(yáng)性藥物組相比，SBI的作用與布洛芬沒有明顯差別，提示SBI具有較好的抑制MMP3、fibronectin表達(dá)的作用，并且這種作用與常規(guī)抗炎藥布洛芬相似。此類研究為RA的防治提供新的思路，也為大豆功效研究提供新的試驗(yàn)參考。

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Effects of Soybean Isoflavone on the Fibroblast Like Synoviocytes Apoptosis in Rheumatoid Arthritis Model Rats

Miao Chenggui1,3,4Qin Meisong1Chen Jianzhong1Li Chengfeng1Zhang Bing2Li Xiaofeng3Li Jun3

(Food and Drug College, Anhui Science and Technology University1, Fengyang 233100)(The First Affiliated Hospital, Anhui Medical University2, Hefei 230032)(College of Pharmacy, Anhui Medical University3, Hefei 230032)(Poultry Disease Monitoring Anhui Key Laboratory, Anhui Science and Technology University4, Fengyang 233100)

Rheumatoid arthritis (RA) model rats were prepared with complete Freund's adjuvant, and were treated with soybean isoflavone (SBI) via intragastric administration, then the synovial tissue of RA model rats was separated and cultured for fibroblast like synoviocytes (FLS). The effect of varied-dose SBI on the expression of apoptosis related gene and RA related gene were detected by real time qPCR. The results showed that three dose treatment (50 mg/kg weight, 100 mg/kg weight and 150 mg/kg weight) significantly increased the expression of cell apoptosis factor caspase 3, pro-apoptotic gene Bax, decreased the anti-apoptosis gene Bcl-2 expression and the expression of MMP3 and fibronectin was decreased at the same time. SBI may affect the synovium proliferation and joint inflammation of control rats by promoting the FLS apoptosis.

soybean isoflavone, rheumatoid arthritis, caspase 3, Bax, Bcl-2

S565

A

1003-0174(2016)02-0001-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302783)，安徽省高校振興計(jì)劃人才項(xiàng)目(098)，安徽省教育廳科研項(xiàng)目(KJ2013 B082)，安徽科技學(xué)院科研項(xiàng)目(ZRC2013378)，滁州市科技局科研項(xiàng)目(201306)，安徽省教育廳科研項(xiàng)目(KJ2012Z069).

繆成貴，男，1981年出生，博士，副教授，抗炎免疫藥理學(xué)