高 林 李亞麗 劉 博 高文惠

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院1，石家莊 050000) (河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心2，石家莊 050000) (張家口卷煙廠有限責(zé)任公司3，張家口 075000)

混合三模板分子印跡固相萃取柱應(yīng)用于糧谷中三唑類農(nóng)藥的檢測(cè)

高 林1,2李亞麗1,2劉 博1,3高文惠1,2

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院1，石家莊 050000) (河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心2，石家莊 050000) (張家口卷煙廠有限責(zé)任公司3，張家口 075000)

建立了采用混合三模板分子印跡固相萃取-高效液相色譜法分離檢測(cè)糧谷樣品中3種三唑類殺菌劑殘留的方法。以聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑、烯唑醇為混合模板分子，采用本體聚合法合成了具有高選擇性的混合三模板分子印跡聚合物，以該聚合物為填料制備混合三模板分子印跡固相萃取柱，并結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)糧谷中聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑、烯唑醇?xì)埩?。結(jié)果表明，以20 mL水為淋洗劑，15 mL甲醇為洗脫劑，并在最佳色譜條件下，聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑、烯唑醇的平均回收率分別為74.0%～82.4%、79.0%～86.2%、77.5%～85.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤4.4%，該混合三模板分子印跡聚合物對(duì)3種殺菌劑具有特異性吸附能力，該分析方法可用于樣品中三唑類殺菌劑殘留的分離檢測(cè)。

糧谷 三唑類農(nóng)藥 混合模板 分子印跡固相萃取柱 高效液相色譜法

聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇是保護(hù)、廣譜、內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，被用于防治植物病害，對(duì)病源微生物有殺死作用或抑制生長(zhǎng)作用，但同時(shí)又不妨礙植物的正常生長(zhǎng)，同時(shí)能夠起到治療作用[1]。近些年三唑類殺菌劑被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的種植過程中，但是大量或不合理地使用殺菌劑必然會(huì)造成食品、飼料、環(huán)境等農(nóng)藥殘留超標(biāo)，從而對(duì)人體、動(dòng)物和環(huán)境造成危害。因此，開展從復(fù)雜基質(zhì)中高選擇性分離凈化三唑類殺菌劑的前處理技術(shù)研究和開發(fā)樣品中三唑類殺菌劑的檢測(cè)方法具有重要意義。目前，三唑類殺菌劑的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[2-3]、氣相色譜法[4-5]等，樣品前處理主要采用傳統(tǒng)的固相萃取小柱，但該小柱選擇性低、凈化效果不佳，無法避免復(fù)雜基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾。

分子印跡技術(shù)(Molecularly imprinted technology, MIT)多用于合成具有識(shí)別特性的印跡聚合物，目標(biāo)分子與功能單體通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合，反應(yīng)完全后洗脫目標(biāo)分子，從而形成有固定空穴大小和形狀的高度交聯(lián)的聚合物，該聚合物具有專一識(shí)別性強(qiáng)、可再生等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于固相萃取、傳感器技術(shù)等領(lǐng)域[6-8]。近些年分子印跡聚合物(Molecularly imprinted Polymer，MIP)作為一種特異性強(qiáng)的填料被應(yīng)用于固相萃取技術(shù)受到廣泛關(guān)注[9-13]，因其具有特異選擇性強(qiáng)、可重復(fù)利用、簡(jiǎn)化樣品前處理、凈化效果好等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)境等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

但是在分子印跡固相萃取技術(shù)的研究與應(yīng)用上，目前大多局限于研究單一模板分子印跡技術(shù)，不能實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)同時(shí)分離、富集。本試驗(yàn)在前期研究工作的基礎(chǔ)上，以聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇為混合模板物質(zhì)合成混合模板分子印跡聚合物，以該聚合物作為固相萃取劑，制備同時(shí)能富集3種殺菌劑的混合三模板分子印跡固相萃取柱，并對(duì)實(shí)際樣品凈化處理，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

1.1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用有限責(zé)任公司；SHZ-82A型恒溫水浴振蕩器：江蘇省太倉(cāng)醫(yī)療器械廠；ASE-12固相萃取儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.1.2 試劑

聯(lián)苯三唑醇(純度為99%)：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；腈菌唑(純度為97.7%)、烯唑醇(純度為98%)：北京金寶在線科技有限公司；乙腈(分析純)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；α-甲基丙烯酸酯(MAA，分析純)：天津市化學(xué)試劑一廠；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析純)：撫順安信化學(xué)有限公司；偶氮二異丁腈(AIBN，化學(xué)純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

200 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇各取0.010 0 g，用乙腈溶解，置于50 mL容量瓶中定容。

大米、玉米、黃豆均購(gòu)自市場(chǎng)。

1.2 不同比例的單體與模板物質(zhì)的紫外光譜測(cè)定

取1 mmol/L模板物質(zhì)的乙腈溶液100 μL于10 mL比色管中，分別加入2 mmol/L MAA的乙腈溶液，使模板物質(zhì)與MAA濃度比分別為1∶0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，乙腈定容，超聲10 min后，在2 ℃環(huán)境下靜置14 h，以不含模板物質(zhì)的MAA的乙腈溶液為參比溶液，在波長(zhǎng)190～300 nm之間進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3 預(yù)組裝體系差示紫外光譜測(cè)定

取1 mmol/L模板物質(zhì)的乙腈溶液100 μL于10 mL比色管中，分別加入2 mmol/L MAA的乙腈溶液，使模板物質(zhì)與MAA濃度比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶7、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13，乙腈定容，超聲10 min后，置于2 ℃環(huán)境中靜置14 h，以模板物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比，于波長(zhǎng)190～300 nm進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.4 混合三模板物質(zhì)分子印跡聚合物的制備

將0.05 mmol烯唑醇、0.075 mmol聯(lián)苯三唑醇及0.075 mmol腈菌唑和1.2 mmol α-甲基丙烯酸酯(MAA)放入50 mL的安瓿瓶中，加15 mL乙腈，超聲1 h，再加交聯(lián)劑EDMA 8 mmol和引發(fā)劑AIBN 0.02 g。然后超聲30 min，混勻后通入N2脫氧15 min，再抽真空1 min后密封，在55 ℃的恒溫水浴中靜置24 h，得塊狀固體分子印跡聚合物(MIP)。經(jīng)研磨、粉碎，過200目篩，再用水洗滌沉降3次，除去過細(xì)粉末。將最終得到的MIP顆粒用甲醇-乙酸溶液(體積比95∶5)洗脫至無模板物質(zhì)，最后用甲醇浸泡1 h除去殘留的乙酸，洗脫后的聚合物放入真空干燥器中(45 ℃)干燥6 h，得到混合模板分子印跡聚合物(MIPs)。

1.5 混合三模板分子印跡固相萃取柱的制備

稱取步驟1.4所得的混合模板分子印跡聚合物適量，置于水中勻漿，裝入內(nèi)徑為1.5 cm的固相萃取空柱內(nèi)，用固相萃取裝置將勻漿液抽出后，先用甲醇潤(rùn)濕柱子，再用水淋洗柱子，最后在上端再加上少許脫脂棉，輕輕按壓使柱子填充緊實(shí)備用；即得混合三模板分子印跡固相萃取柱。

1.6 色譜條件

色譜柱：Promosil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相：甲醇-水(85∶15，V/V)，流速1 mL/min，柱溫為25 ℃。

1.7 樣品前處理

樣品的提?。簻?zhǔn)確稱取5 g樣品，粉碎，用20 mL乙腈提取(提取2次，每次10 mL)，超聲15 min，于4 000 r/min離心10 min，合并2次上清液，氮吹后定容至10 mL。

樣品的凈化：分子印跡固相萃取柱使用前先用10 mL甲醇過柱，然后用水清洗至無甲醇。加入1 mL樣品提取液，再用水淋洗柱子，最后用10 mL甲醇洗脫模板，洗脫液供高效液相色譜儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同比例的功能單體與模板物質(zhì)對(duì)預(yù)組裝體系紫外光譜的影響

圖1是不同比例的功能單體與烯唑醇對(duì)預(yù)組裝體系紫外光譜的影響。由圖1a可知，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，這是氫鍵對(duì)烯唑醇的三唑環(huán)共軛雙鍵的π電子吸收能量躍遷到π*共軛反鍵軌道引起的。說明烯唑醇中N原子與MAA分子中-COOH形成了氫鍵。

吸光值變化趨于平緩時(shí)，說明體系在平緩區(qū)域所對(duì)應(yīng)的混合物濃度比在此范圍內(nèi)趨于穩(wěn)定，此時(shí)進(jìn)入平緩區(qū)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的混合物比例是最佳配比。從圖1 b可知烯唑醇與MAA在濃度比為1∶6(圖中對(duì)應(yīng)點(diǎn)為4’)之后吸光值和波長(zhǎng)變化趨于平緩?？梢酝茢酀舛缺葹橄┻虼肌肕AA=1∶6為聚合時(shí)最佳的配比。

按照選擇烯唑醇與MAA最佳比例的分析方法，可得聯(lián)苯三唑醇及腈菌唑與MAA最佳濃度比均為1∶4。因此，制備此分子印跡聚合物應(yīng)選擇烯唑醇:聯(lián)苯三唑醇:腈菌唑:MAA的摩爾比為1∶1.5∶1.5∶6。

注：a圖右上角的標(biāo)注為濃度比，D為烯唑醇；1′～6′分別是D與MAA濃度比1∶0～1∶10。

圖1 不同比例功能單體和模板物質(zhì)對(duì)預(yù)組裝體系紫外光譜的影響

2.2 固相萃取柱裝柱高度的選擇

試驗(yàn)比較了混合模板分子印跡固相萃取柱裝柱高度分別為1、2和3 cm時(shí)，萃取柱對(duì)樣品的凈化和吸附能力的影響。當(dāng)裝柱過高，即裝柱高度為3 cm或大于3 cm時(shí)，由于柱壓增加，需要很高的壓力進(jìn)行淋洗和洗脫，這樣既耗費(fèi)過多溶劑，又不利于操作。填柱高度為1 cm時(shí)，模板物質(zhì)不能全部被吸附在萃取柱上，即柱吸附容量偏低。當(dāng)裝柱高度為2 cm時(shí)，與3 cm柱高相比，吸附、凈化效果相當(dāng)，且這時(shí)柱壓低，操作方便快速，因此選擇裝柱高度為2 cm。

2.3 固相萃取柱柱壓的選擇

試驗(yàn)考察了柱壓分別為10、20、30、45和55 kPa時(shí)對(duì)樣品凈化效果的影響。結(jié)果顯示，在10、20、30和45 kPa柱壓下，樣品的凈化效果相同，而55 kPa柱壓下，過液速度大于目標(biāo)物在聚合物中的解析速度，當(dāng)洗脫劑全部通過萃取柱后，目標(biāo)物質(zhì)在聚合物中仍有殘留，導(dǎo)致洗脫效果差。因此為了節(jié)省前處理時(shí)間提高效率，選擇45 kPa柱壓下進(jìn)行樣品前處理。

2.4 淋洗劑及其用量的選擇

試驗(yàn)在其他條件相同且非飽和上樣的情況下進(jìn)行淋洗，考察了氯仿、乙腈和水3種淋洗劑的淋洗效果，按照1.7色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，乙腈和氯仿2種有機(jī)溶液均能將模板物質(zhì)淋洗下來，所以可以作為洗脫劑的備選溶劑，不適合作為淋洗劑。而水作為淋洗劑不僅可將雜質(zhì)洗去，而且不會(huì)將模板物質(zhì)淋洗下來。故本試驗(yàn)選擇水作為淋洗劑。

試驗(yàn)考察了不同用量的淋洗劑對(duì)樣品中雜質(zhì)的淋洗效果。將1 mL樣品提取液加入分子印跡固相萃取柱裝置，分別用5、10、15、20和25 mL的去離子水進(jìn)行淋洗，收集各淋洗液，用高效液相色譜儀檢測(cè)。結(jié)果為淋洗液用量是20 mL時(shí)，即可將樣品中雜質(zhì)淋洗干凈。

2.5 洗脫劑及其用量的選擇

試驗(yàn)在其他條件相同且非飽和上樣的情況下進(jìn)行洗脫，考察了甲醇、乙腈和氯仿3種洗脫劑，按照1.7色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示，甲醇的洗脫能力強(qiáng)于乙腈和氯仿的洗脫能力。結(jié)合淋洗劑選擇的結(jié)果，并兼顧溶劑毒性和價(jià)格因素，本試驗(yàn)選擇甲醇為洗脫劑。

試驗(yàn)考察了不同用量的洗脫劑對(duì)樣品中目標(biāo)物質(zhì)萃取效果的影響。將1 mL一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入分子印跡固相萃取柱裝置，進(jìn)行飽和上樣，分別用5、10、15、20和25 mL的甲醇進(jìn)行洗脫，收集各洗脫液用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫劑用量大于15 mL時(shí)，已經(jīng)不能檢測(cè)到目標(biāo)物，說明15 mL洗脫劑可以完全將目標(biāo)物質(zhì)洗脫下來，并且不會(huì)造成洗脫劑的浪費(fèi)，故最佳洗脫劑用量為15 mL。

2.6 3種殺菌劑色譜條件的確定

2.6.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

不同物質(zhì)在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的響應(yīng)值是不一樣的，通過紫外可見分光光度計(jì)對(duì)聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇進(jìn)行紫外光譜掃描，以確定液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)，如圖2所示。

注：1 腈菌唑，2 聯(lián)苯三唑醇，3 烯唑醇。

圖2 腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇紫外光譜圖

由圖2可知，腈菌唑的最大吸收波長(zhǎng)為196 nm；聯(lián)苯三唑醇有2個(gè)吸收峰，分別為199 nm和255 nm；烯唑醇的最大吸收波長(zhǎng)為194 nm。綜合考慮被測(cè)物的最大吸收值以及溶劑本身吸收情況，確定210 nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.6.2 流動(dòng)相配比的選擇

本試驗(yàn)以甲醇-水為流動(dòng)相，不同的體積比直接影響到3種殺菌劑的分離效果。試驗(yàn)考察了甲醇-水體積比分別為100∶0、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25時(shí)3種物質(zhì)的分離情況。由圖3所示，當(dāng)流動(dòng)相比例為85∶15時(shí)，3種被測(cè)物不僅能很好分離，且分析時(shí)間較短。故選用甲醇與水的體積比為85∶15作為最佳流動(dòng)相配比。

注：1 腈菌唑，2 聯(lián)苯三唑醇，3 烯唑醇。

圖3 3種殺菌劑的色譜分離圖(甲醇-水體積比為85∶15)

2.7 線性關(guān)系與方法檢測(cè)限

將聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇分別配制成質(zhì)量濃度為100、50、20、10、5、2、1、0.6、0.3、0.1、0.05 μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性關(guān)系和檢測(cè)限如表1所示。3種物質(zhì)在0.3～100 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系(R≥0.999 2)，檢測(cè)限在0.1～0.2 μg/mL之間。

表1 腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限

2.8 混合三模板分子印跡固相萃取柱對(duì)樣品的凈化和檢測(cè)效果

用已制備好的混合三模板分子印跡固相萃取柱對(duì)糧谷樣品進(jìn)行前處理。圖4～圖9是典型樣品提取液、樣品提取液過柱后洗脫液和樣品加標(biāo)提取液過柱后洗脫液的色譜圖。分子印跡固相萃取柱只對(duì)模板物質(zhì)有吸附作用，而對(duì)樣品中其他基質(zhì)干擾物沒有吸附能力，表現(xiàn)出它對(duì)樣品有很好的凈化效果，而且表現(xiàn)出它在復(fù)雜基質(zhì)條件下分離富集目標(biāo)物的優(yōu)越性能。

圖4 大米樣品提取液色譜圖

圖5 大米樣品提取液過柱后洗脫液色譜圖

注：1腈菌唑，2聯(lián)苯三唑醇，3烯唑醇。

圖6 大米樣品加標(biāo)提取液過柱后洗脫液色譜圖

圖7 黃豆樣品提取液色譜圖

圖8 黃豆樣品過柱后洗脫液色譜圖

注：1腈菌唑，2聯(lián)苯三唑醇，3烯唑醇。

圖9 黃豆樣品加標(biāo)提取液過柱后洗脫液色譜圖

2.9 回收率和精密度試驗(yàn)

采用本方法對(duì)糧谷樣品在1、20 μg/mL 2個(gè)添加水平下，進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)，分析結(jié)果如表2所示，3種殺菌劑平均回收率在74.0%～86.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.3%～4.4%之間(n=5)，說明本方法的回收率和精密度良好。

表2 糧谷樣品的加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)(n=5)

3 結(jié)論

以聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑、烯唑醇3種殺菌劑為模板分子，采用本體聚合法合成混合模板分子印跡聚合物，制備出混合三模板分子印跡固相萃取柱，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行前處理，利用高效液相色譜法檢測(cè)糧谷樣品中3種殺菌劑殘留。結(jié)果表明，自制的混合模板分子印跡固相萃取柱對(duì)樣品有良好的凈化效果，對(duì)目標(biāo)分子表現(xiàn)出特異性吸附能力，在0.3～100 μg/mL濃度范圍線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)≥0.999 2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.3%～4.4%之間(n=5)，平均回收率在74.0%～86.2%之間，聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑、烯唑醇3種殺菌劑的檢出限分別為0.1、0.2、0.2 μg/mL。該分析方法可用于樣品中三唑類殺菌劑殘留的分離檢測(cè)。

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Application of Mixing Three-Template Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction Column toDetermin Triazole Pesticides in Grains

Gao Lin1,2Li Yali1,2Liu Bo1,3Gao Wenhui1,2

(College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology1, Shijiazhuang 050000)(Research Center for Fermentation Engineering of Hebei2, Shijiazhuang 050000)(Zhangjiakou Cigarette Factories Company, LTD3, Zhangjiakou 075000)

A mixing three-template molecularly imprinted solid phase extraction column (MISPEC)-high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for simultaneous determination of three triazole fungicide residues in grain samples. The mixing three-template molecularly imprinted polymer (MIP) with high selectivity was synthesized through bulk polymerization using bitertanol, myclobutanil and diniconazole as mixing three-template molecules. On this basis, the mixing three-template molecularly imprinted solid phase extraction column was prepared and used coupled with HPLC to detect bitertanol, myclobutanil and diniconazole in grains. The experimental results showed that with water of 20 mL as washing agent, methanol of 15 mL as eluent, and under the best chromatographic conditions, the average recoveries of bitertanol, myclobutanil and diniconazole were respectively 74.0%～82.4%, 79.0%～86.2% and 77.5%～85.1% with the relative standard deviations (RSD) less than 4.4%. In conclusion, the polymer had a good specificity absorption capacity for the three fungicides, and the analytical method could be used for the separation and detection of triazole fungicides in samples.

grain, triazole fungicide, mixing template, solid phase extraction column, high performance liquid chromatography

O652.6

A

1003-0174(2016)10-0131-06

河北省科技支撐計(jì)劃(14227504D), 河北省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技計(jì)劃(ZD2015015)

2015-02-13

高林，男，1990年出生，碩士，食品質(zhì)量與安全檢測(cè)

高文惠，女，1963年出生，教授，食品安全與分離技術(shù)