耿敬章

(陜西理工大學生物科學與工程學院，漢中 723000)

響應面優(yōu)化α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉工藝研究

耿敬章

(陜西理工大學生物科學與工程學院，漢中 723000)

以銀杏為原料，研究α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉工藝。以銀杏抗性淀粉得率為指標，探討α-淀粉酶用量、pH、酶解溫度、酶解時間、高壓處理溫度、高壓處理時間、老化溫度和老化時間對銀杏抗性淀粉得率的影響。結果表明，響應面法優(yōu)化α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的最佳工藝條件：加酶量為8.0 U/g，pH為5.8，酶解溫度為88.7 ℃，酶解時間為19.3 min，高壓處理溫度為120 ℃，高壓處理時間為35 min，老化溫度為3 ℃，老化時間為24 h，在該工藝條件下銀杏抗性淀粉得率可達24.12%。為銀杏抗性淀粉的開發(fā)提供參考。

銀杏抗性淀粉 α-淀粉酶 制備 響應面優(yōu)化

銀杏在我國分布廣，產量居世界第一[1]。銀杏具有很好的食用價值和藥用價值。銀杏中的淀粉大約占其干重的60%～70%[2]。銀杏以銷售干果為主，其深加工產品很少。因此，銀杏抗性淀粉的開發(fā)能使銀杏資源得到充分利用，提高銀杏的經濟效益。

抗性淀粉是健康者小腸中不吸收的淀粉和淀粉水解物的總稱[3]。作為一種新型的功能食品添加劑，抗性淀粉的開發(fā)應用引起了越來越多的關注?？剐缘矸劭梢越档吞悄虿』颊卟秃笱菨舛?，從而有效緩解糖尿病病情[4]；抗性淀粉可將腸道內有毒物質稀釋，能增加大腸糞便體積，還可分解產生短鏈脂肪酸等代謝物，降低結腸pH值，可以減少腸道運送排泄物的時間，從而預防、治療便秘、結腸癌等疾病；抗性淀粉可降低血中膽固醇和三酰甘油含量，從而降低患心臟病危險[5]。銀杏回生抗性淀粉為糊化后又冷卻老化的淀粉，其可在食品加工過程中由可消化淀粉轉化而成，研究表明，平均聚合度(average degree of polymerization，DPn)在50～100的相對分子質量最利于抗性淀粉的生成[4-5]。所以，采用淀粉酶水解糊化淀粉來制備抗性淀粉必須嚴格地控制酶解程度。目前，α-淀粉酶水解制備木薯抗性淀粉[6]和馬鈴薯抗性淀粉[7]都取得較好的效果。而在銀杏抗性淀粉的酶法制備方面，余海洋[8]采用普魯蘭酶法做了相關研究，有關α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的研究還鮮見報道。因此，本研究以銀杏為原料，利用響應面分析法優(yōu)化α-淀粉酶制備銀杏抗性淀粉的工藝條件，以期為銀杏資源的開發(fā)提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

銀杏：當?shù)刂兴幉呐l(fā)市場；

高溫α-淀粉酶(20 000 U/g)、胃蛋白酶(15 000 U/g)、葡萄糖淀粉酶(100 000 U/g)：美國Sigma公司；葡萄糖標準溶液、DNS試劑：廣州鴻富化工有限公司。

1.2 試驗儀器與設備

FY-135中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52AAA旋轉蒸發(fā)儀：上海嘉鵬科技有限公司；TDL-40B低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 銀杏淀粉的制備工藝流程[9]

銀杏→干燥→破殼、去衣→粉碎→脫脂→NaOH溶液浸泡→勻漿→靜置→濾上清液→NaOH溶液浸泡、攪拌過夜→離心→水洗淀粉數(shù)次→干燥→脫脂→干燥→銀杏淀粉

1.3.2 銀杏抗性淀粉的制備工藝流程

銀杏淀粉→稱重→溶解制成淀粉乳→Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液調pH→加入α-淀粉酶酶解→高壓處理→自然冷卻→放入冰箱老化→離心→干燥→粉碎→過篩→銀杏抗性淀粉

1.3.3 銀杏抗性淀粉含量的測定[10]

標準曲線的繪制：分別取葡萄糖標準溶液(1 mg/mL)0.2、0.5、0.9、1.5、2.0、2.5 mL于6只容量瓶中，加入蒸餾水，加DNS試劑2 mL，加熱5 min，冷卻，蒸餾水定容，于540 nm處測定系列標準溶液的吸光度。經統(tǒng)計回歸處理，得到線性方程為y=0.814 4x-0.007 5,R2=0.999 8，x指標準品的濃度,y指吸光度。

銀杏抗性淀粉含量的測定：稱取0.1 g樣品，加HCl-KCl緩沖溶液調pH為3，加胃蛋白酶，恒溫震蕩50 min，離心。加乙酸鈉緩沖溶液調pH為4，加葡萄糖淀粉酶，恒溫震蕩50 min，離心重復3次。用KOH溶液溶解沉淀，加HCl溶液中和，加乙酸鈉緩沖溶液調pH為4。再加葡萄糖淀粉酶恒溫震蕩50 min，離心，收集上清液，重復3次。蒸餾水定容上清液至100 mL。取1 mL上清液，加DNS試劑，保溫顯色20 min。以試劑空白為0，在540 nm處測定樣品的吸光度。

1.3.4 α-淀粉酶水解、預糊化銀杏淀粉的工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗，選取加酶量、pH、酶解溫度、酶解時間4個因素的最優(yōu)試驗范圍，以銀杏抗性淀粉得率為優(yōu)化指標，采用響應面分析法對α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的工藝條件進行優(yōu)化。

1.3.5 α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的后續(xù)工藝優(yōu)化

[11]，在上述α-淀粉酶水解、預糊化銀杏淀粉的最佳工藝基礎上，選取高壓處理溫度、高壓處理時間、老化溫度、老化時間4個因素的最優(yōu)試驗范圍，以銀杏抗性淀粉得率作為優(yōu)化指標，采用正交試驗α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的后續(xù)工藝條件進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 α-淀粉酶水解、預糊化銀杏淀粉的工藝優(yōu)化

2.1.1 加酶量對銀杏抗性淀粉制備效果的影響

設定制備銀杏抗性淀粉時，pH為6.0，酶解溫度為90 ℃，酶解時間為15 min，分別在加酶量為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 U/g 6個梯度下，按1.3.2制備銀杏抗性淀粉并測其得率。由圖1可以看出，當加酶量為8.0 U/g，銀杏抗性淀粉得率達到最大值且之后逐漸減小。因為α-淀粉酶添加量的增加，使得淀粉的水解度增大，則直鏈淀粉分子被過度切分，從而影響其后續(xù)晶體的形成，進而導致銀杏抗性淀粉得率降低。因此，α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的最佳加酶量為8.0 U/g。

圖1 加酶量、pH對銀杏抗性淀粉制備效果影響

2.1.2 pH對銀杏抗性淀粉制備效果的影響

設定制備銀杏抗性淀粉時，加酶量為8.0 U/g，酶解溫度為90 ℃，酶解時間為15 min，分別在pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 6個梯度下，按1.3.2制備銀杏抗性淀粉并測其得率。由圖1可以看出，當pH為6.0，銀杏抗性淀粉得率達到最大之后卻逐漸減小，主要是因為較高的pH抑制了α-淀粉酶的活性。因此，選擇pH為6.0左右，銀杏抗性淀粉的制備效果較好。

2.1.3 酶解溫度對銀杏抗性淀粉制備效果的影響

設定制備銀杏抗性淀粉時，加酶量為8.0 U/g，pH為6.0，酶解時間為15 min，分別在酶解溫度為75、80、85、90、95、100 ℃ 6個梯度下，按1.3.2制備銀杏抗性淀粉并測其得率。由圖2可以看出，當酶解溫度為90 ℃時，銀杏抗性淀粉制備效果較好。這可能是因為溫度會影響α-淀粉酶的活性構象和其活性基團的解離狀態(tài)，以及影響α-淀粉酶與底物分子的結合程度，從而改變酶促反應速率[12]。較低和較高的溫度都會在一定程度上對抑制α-淀粉酶的活性。

2.1.4 酶解時間對銀杏抗性淀粉制備效果的影響

設定制備銀杏抗性淀粉時，加酶量為8.0 U/g，pH為6，酶解溫度為90 ℃，分別在酶解時間為5、10、15、20、25、30 min 6個梯度下，按1.3.2制備銀杏抗性淀粉并測其得率。由圖2可以看出，當酶解時間為20 min時，銀杏抗性淀粉達到最大值，且從此逐漸減小。這是因為隨著酶解時間的延長，銀杏淀粉被徹底降解為低聚糖以及小分子糊精，大量小分子的存在影響銀杏淀粉的結晶老化，從而不利于銀杏抗性淀粉的產生。因此，當酶解時間為20 min時，銀杏抗性淀粉制備效果較好。

圖2 酶解溫度、酶解時間對銀杏抗性淀粉制備效果影響

2.1.5 α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的條件優(yōu)化

結合單因素試驗結果，分別選取加酶量為6.0、8.0、10.0 U/g，pH為5.0、6.0、7.0，酶解溫度為85、90、95 ℃，酶解時間為15、20、25 min，利用響應面分析法優(yōu)化α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的最佳工藝參數(shù)。因素水平見表1，結果見表2。

表1 響應面因素水平

表2 α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉試驗設計及結果

續(xù)表

對α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的條件進行分析，加酶量，pH、酶解溫度、酶解時間都是顯著因素。關于α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的得率二次回歸擬合方程：

抗性淀粉得率/%=22.35+0.54×A-1.97×B-0.013×C-0.82×D-1.13×A×B-1.35×A×C-2.92×A×D-2.49×B×C+2.49×B×D-1.04×C×D-1.86×A2-3.15×B2-3.40×C2-1.69×D2

由表3可以看出，模型的P值為<0.000 1，而失擬項的P值為0.295 3，說明了α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的模型與實際情況擬合程度比較好，可以預測α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的條件。

表3 回歸方程各項的方差分析

注：“P>F”<0.05，代表研究因素為顯著因素。

由方差分析結果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用、CD的交互作用都顯著，相應曲面圖見圖3至圖8。

圖3 加酶量與pH交互作用對制備效果影響的響應面

圖4 加酶量與酶解溫度交互作用對制備效果影響的響應面

圖5 加酶量與酶解時間交互作用對制備效果影響的響應面

圖6 pH與酶解溫度交互作用對制備效果影響的響應面

圖7 pH與酶解時間交互作用對制備效果影響的響應面

圖8 酶解溫度與酶解時間交互作用對制備效果影響的響應面

根據(jù)α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的試驗結果和回歸方程各項的方差分析，由響應面分析法優(yōu)化出α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的最佳工藝條件，即α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的最佳工藝條件為加酶量為8.0 U/g，pH為5.8，酶解溫度為88.7 ℃，酶解時間為19.3 min。

2.2 α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的后續(xù)工藝優(yōu)化

分別選取高壓處理溫度為110、120、130 ℃，高壓處理時間為15、25、35 min，老化溫度為3、6、9 ℃，老化時間為12、24、36 h，利用正交試驗優(yōu)化α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的后續(xù)工藝條件。因素水平見表4，結果見表5。

表4 因素水平表

表5 正交試驗結果與分析

由表5可以看出，α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的后續(xù)工藝中各因素的主次順序為B>A>D>C，即：高壓處理時間>高壓處理溫度>老化時間>老化溫度。α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的后續(xù)工藝條件最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即：高壓處理溫度為120 ℃，高壓處理時間為35 min，老化溫度為3 ℃，老化時間為24 h，此條件下銀杏抗性淀粉得率達到24.12%。

3 結論

本試驗對銀杏回生抗性淀粉制備過程中淀粉酶酶解工藝和老化處理工藝進行了研究，響應面優(yōu)化α-淀粉酶水解制備銀杏抗性淀粉的最佳工藝條件為：加酶量為8.0 U/g，pH為5.8，酶解溫度為88.7 ℃，酶解時間為19.3 min，高壓處理溫度為120 ℃，高壓處理時間為35 min，老化溫度為3 ℃，老化時間為24 h，此時銀杏抗性淀粉得率達到24.12%，研究結果可為銀杏淀粉的進一步開發(fā)利用提供參考。

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Preparation of Ginkgo Resistant Starch with α-amylase by Response Surface Methodology

Geng Jingzhang

(College of Biological science and engineering, Shaanxi SCI-TECH University, Hanzhong 723000)

The preparation technology ofginkgoresistant starch by α-amylase hydrolysis was studied. Takingginkgoresistant starch yield as indicator, the effect of α-amylase amount, pH, enzymolysis temperature, enzymolysis time, high pressure processing temperature, high pressure processing time, storage temperature and storage time onginkgoresistant starch was studied. It showed that the optimum preparation conditions ofginkgoresistant starch by α-amylase hydrolysis using the response surface methodology were as follows: the enzyme amount for 8.0 U/g, pH for 5.8, enzymolysis temperature for 88.7 ℃, enzymolysis time for 19.3 min, high pressure processing temperature for 120 ℃, high pressure processing time for 35 min, storage temperature 3 ℃ and storage time 24 h .Under those conditions, theginkgoresistant starch yield reached 24.12%. This study provided a theoretical basis for the development and utilization ofginkgo.

ginkgoresistant starch, α-amylase, preparation, response surface optimization

TS235.4

A

1003-0174(2016)10-0025-06

陜西省教育廳專項科研計劃(12JK0816)，陜西省社會發(fā)展攻關項目(2016SF-354)

2015-02-03

耿敬章，男，1980年出生，副教授，食品質量控制與資源開發(fā)利用