王章存 王許東 張子峰 安廣杰 曹 芹

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院1，鄭州 450002)(鄭州新威營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司2，鄭州 450002)

BTI保護(hù)法測(cè)定小麥水解蛋白中谷氨酰胺含量

王章存1王許東2張子峰2安廣杰1曹 芹1

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院1，鄭州 450002)(鄭州新威營(yíng)養(yǎng)技術(shù)有限公司2，鄭州 450002)

根據(jù)蛋白中谷氨酰胺與BTI試劑反應(yīng)后不再被酸解轉(zhuǎn)化為谷氨酸的原理，介紹了測(cè)定蛋白質(zhì)和肽中谷氨酰胺方法，主要包括樣品的BTI處理、酸解、PITC衍生和HPLC色譜分析等。以小麥水解蛋白為例，測(cè)定結(jié)果為：結(jié)合態(tài)谷氨酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(26.178±0.061)%，游離谷氨酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.121±0.008)%，其他17種游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(2.053±0.034)%。丙氨酰-谷氨酰胺二肽標(biāo)準(zhǔn)品和游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果印證了該方法是可靠的，可測(cè)定蛋白質(zhì)和肽分子中的谷氨酰胺含量。

小麥水解蛋白 結(jié)合態(tài)谷氨酰胺 BTI試劑 PITC衍生

谷氨酰胺是組成蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一，也是動(dòng)物體的一種條件性必需氨基酸。它可以促進(jìn)動(dòng)物小腸絨毛膜的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)皮膚的快速愈合，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力等，在動(dòng)物機(jī)體代謝中具有十分重要的功能[1-2]，而且大量研究表明，結(jié)合態(tài)比游離態(tài)谷氨酰胺具有更好的營(yíng)養(yǎng)效果[3-5]，因此，近年來(lái)人們十分重視結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的開(kāi)發(fā)利用。

小麥蛋白具有豐富的谷氨酰胺，以小麥蛋白為原料通過(guò)酶解制備含有結(jié)合態(tài)Gln活性肽的研究受到國(guó)內(nèi)外高度關(guān)注[6-8]，但如何有效評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的含量是困擾人們的主要難題。因?yàn)槟壳皽y(cè)定蛋白質(zhì)及肽中氨基酸含量時(shí)首先用鹽酸水解樣品，此時(shí)蛋白質(zhì)及肽中的谷氨酰胺(Gln)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的谷氨酸(Glu)，后者也是蛋白質(zhì)中的固有氨基酸。因此，分析報(bào)告中Glu的含量實(shí)際是Gln轉(zhuǎn)化所得Glu與蛋白質(zhì)中固有Glu含量之和。

目前結(jié)合態(tài)Gln的測(cè)定方法主要有基因或序列分析法、酶法[9]和BTI試劑保護(hù)法[10]?；蛐蛄蟹ㄒ虿僮髦芷陂L(zhǎng)、難度大、費(fèi)用高等原因而無(wú)法普及；酶解法因無(wú)法確保結(jié)合態(tài)Gln的完全釋放，也不能有效利用。BTI保護(hù)法是基于蛋白質(zhì)中Gln(也稱(chēng)作結(jié)合態(tài)Gln)與試劑 [二(三氟乙酰氧基)碘]苯, 縮寫(xiě)為BTI)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為對(duì)酸穩(wěn)定的L-2,4-二氨基丁酸(DABA)，因此可以通過(guò)測(cè)定BTI保護(hù)后樣品中DABA含量來(lái)計(jì)算Gln含量[10-13]。但該法需要DABA作為標(biāo)準(zhǔn)品且價(jià)格較高，而且結(jié)合態(tài)Gln與BTI的反應(yīng)產(chǎn)物未必全部是DABA，這是影響該方法廣泛應(yīng)用的制約因素。因此有必要探討新的分析方法。

本研究根據(jù)BTI衍生化反應(yīng)原理，通過(guò)BTI保護(hù)和未經(jīng)保護(hù)蛋白質(zhì)樣品經(jīng)酸水解后的Glu含量差值來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)中的Gln含量，可省去以DABA標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定。同時(shí)通過(guò)測(cè)定小麥水解蛋白中游離Gln含量，進(jìn)一步確認(rèn)樣品中Gln的存在狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

小麥水解蛋白(粗蛋白80.93%)：鄭州新威公司；Gln標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%)：日本協(xié)和KYOWA KIRIN公司；Ala-Gln二肽標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99. 34%)：上海旭新科技公司；雙-(三氟乙酰氧基)-碘苯(BTI，分析純)：阿拉丁試劑(上海)公司；Venusil AA分析方法包(包括17種標(biāo)準(zhǔn)Aa，內(nèi)標(biāo)物正亮氨酸，異硫氰酸苯酯，三乙胺)：天津Agela科技公司。其他試劑為分析純或色譜純。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀(HPLC)：Lab-Tech萊博泰科公司；Venusil AA 分析專(zhuān)用柱(4.6×250 mm，5 μm)：天津博納Agela公司；干式氮吹儀(DN-12A)：無(wú)錫沃信公司。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品的BTI保護(hù)處理

[11-12]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)。取1.0 mL小麥水解蛋白樣品液(1%)，加1.5 mL BTI溶液(乙腈溶解)和0.25 mL吡啶水溶液，于50 ℃水浴保溫5 h以上。然后，再用氮吹儀吹干。另取1份樣品液，加入同樣的乙腈和吡啶水溶液，保溫和干燥方法不變，作為對(duì)照樣品。

1.3.2 樣品的酸水解

在BTI保護(hù)和對(duì)照樣品中分別加入10 mL 含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸，振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中，將安瓿瓶置-20 ℃冰箱中冷凍3～5 min，充氮后用噴燈熔封，然后置(110±1)℃烘箱中水解24 h，取出冷卻，取水解液1mL，置濃縮管中濃縮儀濃縮至干(或用氮?dú)獯蹈扇コ}酸)，加入1.0 mL濃度為0.1 mol/L 稀HCl溶解，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，供衍生使用。

1.3.3 Aa標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的衍生

準(zhǔn)確量取Aa標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品液200 μL ，分別置入1 mL 離心管中，往每個(gè)離心管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20 μL ，然后加入三乙胺乙腈溶液 100 μL ，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置 1 h，然后加入正己烷 400 μL ，振搖后放置10 min，取下層溶液(PTC-AA)，用0.45 μm 微濾器過(guò)濾上色譜柱。

1.3.4 Ala-Gln二肽標(biāo)準(zhǔn)品的處理

取適量Ala-Gln二肽標(biāo)準(zhǔn)品按前述BTI保護(hù)、酸解和衍生等方法處理后上柱分析。

1.3.5 HPLC色譜條件：

色譜柱：Venusil AA分析柱 4.6 mm×250 mm, 5 μm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min，測(cè)定波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相A：為0.1 mol/L醋酸鈉溶液(pH 6.5)∶乙腈=93∶7；流動(dòng)相B為乙腈∶水=80∶20(V/V)；線性梯度洗脫程序?yàn)椋?～4 min，0～3% B；4～16 min，3%～11% B；16～17 min，11%～21% B；17～32 min，21%～34% B；32～34 min，34%～100% B；38.01 min，0% B；38.01～45 min，0% B。

1.3.6 游離氨基酸總量和游離態(tài)Gln含量的測(cè)定

將一定量小麥水解蛋白樣品加入稀酸溶液充分溶脹后離心，取上清液即游離氨基酸(包括Gln)樣品溶液。另取Gln標(biāo)準(zhǔn)品，按相同方法用PITC衍生后上柱分析。

1.3.7 試驗(yàn)結(jié)果的處理

按Aa常規(guī)分析方法，分別計(jì)算BTI保護(hù)和未保護(hù)樣品中的Glu含量、游離氨基酸總含量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.0 軟件統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Glu和Gln的分子質(zhì)量分別為147.1和146.2，所以Gln對(duì)Glu的質(zhì)量換算系數(shù)為0.994。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品氨基酸圖譜

小麥水解蛋白樣品按常規(guī)氨基酸分析方法測(cè)定(即未經(jīng)BTI保護(hù))結(jié)果如圖1所示。其中正亮氨酸是內(nèi)標(biāo)物。Venusil AA 色譜柱和選擇的洗脫條件可以很好地分離各種氨基酸。以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正和計(jì)算該樣品中各種氨基酸含量，3次重復(fù)試驗(yàn)氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 (79.587±0.119) % 。其中3次試驗(yàn)Glu質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析值分別為28.952%、29.016%、28.779%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為(28.916±0.123) %?？梢?jiàn)，該分析結(jié)果重復(fù)性很好。

圖1 樣品Aa圖譜

2.2 BTI保護(hù)樣品氨基酸圖譜

圖2是小麥水解蛋白經(jīng)BTI保護(hù)后酸水解產(chǎn)物的氨基酸圖譜。與未經(jīng)保護(hù)的蛋白質(zhì)樣品(圖1)相比，該圖譜中Glu峰很小，氨基(NH3)峰也很小，表明BTI對(duì)Gln有很好的保護(hù)效果，可以抵抗酸水解而不再生成Glu，在Phe和Lys峰之間新增加一個(gè)高峰，經(jīng)以BTI保護(hù)的Ala-Gln二肽標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜(圖3)指認(rèn)，該峰即是DABA峰。

圖2 BTI保護(hù)樣品Aa圖譜

經(jīng)BTI保護(hù)樣品Glu質(zhì)量分?jǐn)?shù)3次測(cè)定值分別為2.581%、2.643%和2.513%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為平均值(2.579±0.062)%，重復(fù)性較好。

根據(jù)測(cè)定原理，BTI保護(hù)和未保護(hù)樣品中的Glu含量差值為(26.336±0.061)%，即為樣品中結(jié)合態(tài)Gln水解所得。根據(jù)1.3.7，可計(jì)算出小麥水解蛋白中結(jié)合態(tài)Gln質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(26.178±0.061) %。說(shuō)明在該小麥水解蛋白樣品中，結(jié)合態(tài)Gln占Glu和Gln總和的91.03% ，這意味在常規(guī)方法測(cè)定的Glu結(jié)果中，絕大部分是由Gln貢獻(xiàn)的。

圖3 Ala-Gln二肽標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)BTI保護(hù)分析圖譜

2.3 游離Aa(Aa)總量和游離Gln含量

對(duì)小麥水解蛋白中游離氨基酸的分離結(jié)果如圖4所示。各種氨基酸含量與原料蛋白中相應(yīng)氨基酸有差異，并不是等比例釋放氨基酸(這與酶的水解位點(diǎn)有很大關(guān)系)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸峰面積校正計(jì)算，17種游離氨基酸含量只有(2.053±0.034)%，另外，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品Gln峰面積(圖5)校正計(jì)算，樣品中游離Gln含量為(0.121±0.008) %，說(shuō)明該樣品中絕大部分氨基酸(97.3%)以肽的形式存在。

圖4 小麥水解蛋白樣品游離氨基酸分離圖譜

圖5 標(biāo)準(zhǔn)Gln分離圖譜

3 結(jié)論

小肽分子中結(jié)合態(tài)Gln在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝和應(yīng)激反應(yīng)中具有特殊生理功能。因此，蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中結(jié)合態(tài)Gln的含量測(cè)定對(duì)于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的酶解效果十分重要。但目前氨基酸分析方法均采用酸水解法，無(wú)法測(cè)定結(jié)合態(tài)Gln和Asn。本研究以小麥水解蛋白為例，根據(jù)蛋白質(zhì)中的Gln與BTI試劑反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其他化合物后不再受酸水解影響的原理，通過(guò)常規(guī)氨基酸分析中谷氨酸含量與樣品經(jīng)BTI反應(yīng)后谷氨酸含量的差值計(jì)算結(jié)合態(tài)Gln含量，并以Ala-Gln二肽標(biāo)準(zhǔn)品和游離氨基酸測(cè)定對(duì)結(jié)果進(jìn)行了印證，證明該方法是可靠的。與目前所用DABA標(biāo)準(zhǔn)品法相比，本方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)和更廣泛的實(shí)用價(jià)值。

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Determination of Bound-Glutamine in Hydrolyzed Wheat Protein with BTI Reagent

Wang Zhangcun1Wang Xudong2Zhang Zifeng2An Guangjie1Cao Qin1

(School of Food & Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry1, Zhengzhou 450000)Zhengzhou Newwill Nutritional Technology Co., Ltd2.,Zhengzhou 450000)

A simple yet accurate method for the analysis of glutamine content in polypeptides was described, which includes reaction between BTI reagent and peptide bound glutamine, acid hydrolysis, PITC derivation and HPLC analysis. The results of wheat protein hydrolyzed showed that bound glutamine was (26.178±0.061)%, free glutamine was (0.121±0.008)%, the total of other 17 free amino acid was (2.053±0.034)%. The results of standard alanyl-glutamine dipeptide and free amino acids measurement manifested the reliability and accuracy of the method.

hydrolyzed wheat protein, bound glutamine, BTI reagent, PITC derivation

TS207.3

A

1003-0174(2016)06-0150-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31071517)

2014-10-10

王章存，男，1963年出生，教授，糧油蛋白質(zhì)深加工