李澤珍 狄建兵 陳 敏

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，太谷 030801)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院2，北京 100083)

薺藍(lán)膠多糖的分離純化和理化性質(zhì)研究

李澤珍1狄建兵1陳 敏2

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，太谷 030801)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院2，北京 100083)

研究薺藍(lán)膠脫除蛋白的方法，薺藍(lán)膠多糖的分離純化，以及部分理化性質(zhì)的測定。采用水提醇沉法從薺藍(lán)籽中提取薺藍(lán)膠，比較了Sevag法、堿性蛋白酶+Sevag法、胰蛋白酶+Sevag法3種脫除蛋白方法，此后經(jīng)DE-52離子交換柱進行純化得到精制多糖。采用凝膠電泳、紫外掃描等進行純度鑒定，紅外掃描、液相色譜分析其結(jié)構(gòu)和單糖組成，并進行部分理化性質(zhì)的測定。結(jié)果表明，堿性蛋白酶+sevag法是脫除薺藍(lán)膠中蛋白的有效方法，分離純化的薺藍(lán)膠多糖CSP(camelina sativa polysaccharide)為單一級分，含有糖醛酸結(jié)構(gòu)，吡喃糖環(huán)和β-糖苷鍵，其單糖組成包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖4種，摩爾比為11.95∶13.95∶0.79∶0.27。薺藍(lán)膠多糖CSP是一種水溶性，有較高黏度的酸性多糖類物質(zhì)。

薺藍(lán)膠多糖 分離純化 理化性質(zhì)

薺藍(lán)可抵抗冬季-16 ℃左右的低溫，對土壤條件要求低，如干旱、瘠薄、半沙質(zhì)的地區(qū)都可種植，適應(yīng)性強。與亞麻薺相比，薺藍(lán)農(nóng)藝性狀好，抗病蟲、抗倒伏、高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)，具有許多優(yōu)點[1]。

近年來，薺藍(lán)作為一種新的高產(chǎn)油料作物越來越受到人們的重視[ 1-3]，如其栽培特性、食用價值等。相關(guān)研究表明，薺藍(lán)籽含油率為36%～42%，可作為食用植物油源；薺藍(lán)油中富含α-亞麻酸、亞油酸，其含量分別為33%～36%，18%～25%，并且VE含量高達(dá)36～44 mg/100 g，因而，薺藍(lán)油也被認(rèn)為是具有特殊功能營養(yǎng)保健油源[4]。薺藍(lán)籽榨取油脂后的薺藍(lán)籽餅(粕)仍具有很高的應(yīng)用價值，它含有高達(dá)42%～45%的蛋白質(zhì)，可在家禽飼料中添加應(yīng)用[5]，也可對其蛋白分離純化或酶解獲得多肽，作為生物活性物質(zhì)在食品中添加[6]。薺藍(lán)籽表皮附著植物多糖膠質(zhì)，采用水提醇沉法可獲得薺藍(lán)膠，其中含有70%以上的多糖和少量蛋白質(zhì)[7]。薺藍(lán)膠中含有大量的植物多糖，已有研究表明，植物多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗衰老、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等，并且具有毒副作用小，不易造成殘留等優(yōu)點[8]。近年來，多糖的研究被重視，研究方面包括分離純化、理化性質(zhì)測定，以及生物活性的探討。目前，嚴(yán)奉偉等[9]、稅丹等[10]研究表明菜籽多糖具有清除自由基的能力，有明顯的抗氧化作用；毛豐瑋等[11]研究了亞麻籽殼多糖，對其提取工藝，分離純化，多糖結(jié)構(gòu)進行了研究。而薺藍(lán)籽殼提取到的薺藍(lán)膠中的多糖，其分離純化及理化性質(zhì)研究至今鮮見報導(dǎo)。

本研究對薺藍(lán)膠脫除蛋白方法進行了比較，對多糖成分進行了分離純化，并探討了純化后多糖的理化性質(zhì)，旨在為薺藍(lán)膠多糖進一步的結(jié)構(gòu)或構(gòu)效關(guān)系研究、保健品的開發(fā)應(yīng)用，提供一定的理論基礎(chǔ)，同時，進一步提高油料作物薺藍(lán)的經(jīng)濟效益。

1 材料與儀器

薺藍(lán)膠：自制；單糖標(biāo)品-葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶：Sigma公司；8～14 ku透析袋：美國聯(lián)合碳化公司；DE-52：Whatman Intermational Ltd；三氟乙酸、茚三酮-乙醇溶液、費林試劑、雙縮脲試劑、三氯化鐵、碘-碘酸鉀溶液、CTAB：分析純級。

752型紫外光柵分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司； HL-2S 恒流泵、SBS-100 電腦全自動部分收集器、層析柱(1.6 cm×40 cm)、HD-5 電腦紫外檢測儀：上海青浦滬西儀器廠；DYCZ-24D雙垂直電泳槽電泳儀、DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；UV-VIS紫外-可見光光譜分析儀：澳大利亞瓦里安有限公司；SY-4000K高效液相色譜設(shè)備：北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司；sugar pakⅠ色譜柱：沃特世公司；RI-K-2301示差折光檢測器：北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司；5DX紅外光譜儀：美國尼高力公司。

2 試驗方法

2.1 薺藍(lán)膠脫除蛋白

薺藍(lán)膠的制備：按比例稱取薺藍(lán)籽殼與蒸餾水，重量比為1∶33，在61 ℃下浸提3.5 h，勻漿后離心處理，獲得上層膠液，多次加入無水乙醇沉淀，脫水濃縮，紗布過濾，得到的膠質(zhì)在60 ℃下鼓風(fēng)干燥。干燥后制品為纖維狀，粉碎后過篩(80目)，制得薺藍(lán)膠粉。

配制50 mL 0.4%薺藍(lán)膠溶液，分別使用Sevag法、堿性蛋白酶+Sevag法、胰蛋白酶+Sevag法對其進行脫蛋白處理[12-13]，用考馬斯亮藍(lán)染色法與苯酚-硫酸法分別測定3 種方法處理后的蛋白質(zhì)含量以及多糖含量。脫除蛋白后的粗多糖液透析，冷凍干燥，制得薺藍(lán)膠粗多糖。

2.2 DEAE-52離子層析

稱取薺藍(lán)膠粗多糖，配制濃度為1.0 mg/mL的溶液，經(jīng)微孔濾膜過濾后上樣，上樣量為10 mL。DE-52(Cl-型) (1.6 cm×40 cm) 蒸餾水洗脫4 h后，經(jīng)0～1.5 mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.6 mL/min，以5 mL/管分部收集。收集得到的洗脫液采用苯酚-硫酸法檢測糖峰部分，合并單一含糖峰位，蒸餾水中透析48 h后冷凍干燥，精制得到多糖組分。

2. 3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用pH8.3的Tris-甘氨酸為緩沖液，電泳條件為電壓400 V，電泳時間8 h。0.5%甲苯胺藍(lán)染色后，再用乙醇∶水∶乙酸(5∶5∶0.1)脫色處理。

2. 4 紫外光譜

稱取薺藍(lán)膠精制多糖，配制0.1 mg/mL的水溶液，紫外分析儀UV1800進行掃描，范圍為190～400 nm。

2.5 紅外光譜分析

KBr壓片法。紅外掃描范圍在4 000～400 cm-1。

2.6 單糖組成分析[14]

單糖標(biāo)準(zhǔn)液配置濃度為2.0 mg/mL。多糖的酸水解：稱取10 mg多糖CSP加入螺口試管中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)，充氮氣封管；100 ℃水浴6 h后取出；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮至干(溫度低于40 ℃)，加入甲醇再由氮氣吹干，重復(fù)4～5次，直到完全除去TFA，最后配成溶液。

高效液相(HPLC)法分析CSP多糖的單糖組成成分，以warers sugar pakⅠ為色譜柱， 0.05 g /L EDTA鈣鈉溶液為流動相，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫為90 ℃，RI-K-2301示差折光檢測器。

2.7 CSP多糖的理化性質(zhì)[12]

對多糖CSP的多種理化性質(zhì)進行檢測觀察，包括顏色、狀態(tài)、溶解性、CTAB絡(luò)合反應(yīng)、碘-碘酸鉀反應(yīng)、費林試劑反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 薺藍(lán)膠脫除蛋白

薺藍(lán)膠中蛋白質(zhì)含量較高，sevag法需反復(fù)處理7次以上，才能使游離蛋白質(zhì)除盡，最終蛋白質(zhì)含量5.01 mg/mL，脫去58.5%的蛋白質(zhì)，多糖損失率23.46%。酶解后，使用sevag法處理，可以減少后續(xù)有機溶劑脫除蛋白的次數(shù)，降低了多糖隨凝膠物沉淀而損失的可能。堿性蛋白酶處理后，sevag法僅處理2次，蛋白質(zhì)脫除率為59.90%，胰蛋白酶處理后，仍需sevag法處理5次，其優(yōu)點是蛋白質(zhì)脫除率最高(63.60%)，但多糖損失率很大。綜上所述，堿性蛋白酶+sevag法可以有效提高蛋白脫除效率，減少多糖損失，酶法與sevag法結(jié)合是脫除薺藍(lán)膠中蛋白的有效方法。

表1 不同脫蛋白方法處理的試驗結(jié)果

注：蛋白含量測定：考馬斯亮藍(lán)法。薺藍(lán)膠蛋白含量12.06 mg/mL。

3.2 薺藍(lán)膠多糖的分離純化

采用 DE-52(C1-型)柱層析，蒸餾水洗脫4 h后，用0～1.5 mol/L NaCl梯度洗脫。NaCl溶液梯度洗脫可獲得一種主要的分離組分，命名為CSP(camelina sativa polysaccharide)，分離效果見圖1。柱層析時，蒸餾水洗脫后檢驗無組分，NaCl溶液梯度洗脫后有組分，該組分是被DE-52吸附的酸性多糖峰，這說明薺藍(lán)膠多糖中的組分是酸性多糖，而不是中性多糖。

圖1 薺藍(lán)膠多糖的柱層析圖譜

3.3 凝膠電泳

薺藍(lán)膠多糖CSP組分達(dá)到了電泳純，凝膠電泳獲得到單一區(qū)帶(圖2)，這表明CSP為單一組分多糖。

圖2 CSP的聚丙烯酰胺凝膠電泳譜圖

3.4 紫外掃描光譜

紫外掃描圖譜(圖2)表明，多糖CSP中不含蛋白質(zhì)、多肽及核酸的成分，其掃描范圍內(nèi)260、280 nm處均無吸收。

圖3 CSP的紫外掃描圖譜

3.5 多糖紅外掃描分析

圖4 CSP紅外光譜圖

3.6 單糖組成分析

如圖5、圖6所示，CSP是一種雜多糖。其單糖組成包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖，相對摩爾比為：11.95∶13.95∶0.79∶0.27。結(jié)合多糖的紅外掃描，可知薺藍(lán)膠多糖CSP是由β-糖苷鍵連接的4種單糖組成的雜多糖。

圖5 單糖標(biāo)樣HPLC檢測圖譜

圖6 CSP的單糖HPLC檢測圖譜

表2 單糖的HPLC洗脫信息

3.7 多糖CSP的理化性質(zhì)

多糖CSP的CTAB絡(luò)合反應(yīng)為陽性外，其他反應(yīng)均為陰性，表明CSP組分具有水溶性，有較高黏度，是非淀粉類酸性多糖。同時，CSP組分不含淀粉、還原糖、酚類物質(zhì)、蛋白、多肽物質(zhì)。

表3 CSP的理化性質(zhì)

注：“+”表示陽性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)。

4 結(jié)論

薺藍(lán)膠脫除蛋白方法的研究，結(jié)果表明堿性蛋白酶+sevag法是有效的脫除薺藍(lán)膠蛋白質(zhì)的方法，可以顯著減少sevag法處理的次數(shù)，并降低多糖的損失。

薺藍(lán)膠粗多糖經(jīng)離子交換柱層析，進行分離純化，得到一個主要組分CSP。該組分聚丙烯酰胺凝膠電泳只有一條帶，紫外掃描260、280 nm處無吸收，純度鑒定表明CSP為單一組分。高效液相色譜分析表明，CSP多糖含有4種單糖，分別為鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖，摩爾比為11.95∶13.95∶0.79∶0.27。糖苷鍵分析結(jié)果表明，薺藍(lán)膠多糖CSP是由β-糖苷鍵連接的4種單糖組成的雜多糖。紅外掃描表明CSP是多糖類化合物，具有吡喃糖的β-糖苷鍵結(jié)構(gòu)，并含有糖醛酸。其理化性質(zhì)試驗表明，CSP是非淀粉類多糖，具有水溶性、較高黏度，是不含淀粉、還原糖、酚類物質(zhì)、蛋白、多肽的酸性多糖類物質(zhì)。

[1]黃鳳洪,謝筆鈞,劉昌盛.新型油料作物——薺藍(lán)[J].中國油脂,2005,30(10):76-77

[2]Zubr J. Dietary fatty acids and amino acids of [ J].Journal of food quality,2003, 26( 6): 451-462

[3]Zubr J,Matthaus B. Effects of growth conditions on fatty acids and to copherols in Camelina sativa oil[J]. Industrial crops and products,2002,15(2):155-162

[4]Djoussé L,Hunt S C,Arnett D K,et al. Dietary linolenic acid is inversely associated with plasma triacylglycerol the National Hear,t Lung, and Blood Institute Family Heart Study [J]. The American Journal of Clinical Nutrition,2003,78(12): 1098-1102

[5]鄧乾春,黃鳳洪,黃慶德等.薺藍(lán)籽餅粕在家禽飼料中的應(yīng)用效果研究[J].中國飼料,2009,17:3-7

[6]戴昱旻,朱曉聰,云田田等.薺藍(lán)籽蛋白酶解制備抗氧化肽工藝的研究[J].中國糧油學(xué)報,2008,23(5):149-153

[7]李澤珍,陳敏,戴蘊青等.薺藍(lán)膠提取工藝的優(yōu)化[J].中國食品學(xué)報,2010,10(2):142-148

[8]Ge Y, Duan Y F,Fang G Z,et al.Study on biological activities of Physalis alkekengivar francheti polysaccharide[J]. The Science of Food and Agriculture,2009,89(9):1593-1598

[9]嚴(yán)奉偉,羅祖友,吳季勤.菜籽多糖的抗氧化作用與機理研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(1):157-162

[10]稅丹,王立峰,袁建，等.酸法提取菜籽多糖的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2011,32(21):98-101

[11]毛豐瑋.亞麻籽殼多糖的提取﹑分離純化與結(jié)構(gòu)研究[D]:浙江工商大學(xué),2012

[12]張維杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1999

[13]尹艷,高文宏,于淑娟.多糖提取技術(shù)的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2007(2): 248-250

[14]郭振楚.糖類化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,106-180

[15]Xu W T, Zhang F F, Luo Y B, et al. Antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide purified from Pteridium aquilinum [J]. Carbohydrate Research,2009,344 (2): 217-222

[16]Cai W R,Gu X H, Tang J. Extraction, purification, and characterization of the polysaccharides from Opuntia milpaalta [J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 71(3): 403-410.

Isolation, Purification and Physicochemical Properties of the Polysaccharides from Camelina Sativa Gum

Li Zezhen1Di Jianbing1Chen Min2

(College of Food Science & Engineering，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801)(College of Food Science & Nutritional Engineering，China Agricultural University2，Beijing 100083)

The methods of deprotein from Camelina Sativa gum,isolating and purifying the polysaccharides, and determining the partial physicochemical characters of polysaccharides were investigated. Water extraction and alcohol precipitation are employed to isolate Camelina Sativa gum from seed shell. Comparison was carried out between three different methods, Sevag, combination of Sevag with trypsase, combination of Sevag with alkaline protease for deproteinization. After the removal of protein, the Camelina Sativa polysaccharides were purified by DEAE-cellulose chromatography. The purity is identified by polyacrylamide gel electrophoresis and UV scanning, while its structure and monosaccharides composition were analyzed by IR scanning and HPLC, and particial physicochemical properties are measured. The results showed that Sevag method combined with alkaline protease could greatly increases removal rate of protein；separated and purified Camelina sativa polysaccharide was an homogeneous component which contains uronic acids, pyranoid ring and β-glycosidic bond. And physichemical characters of CSP showed that it mainly contains rhamnose, xylose, arabinose and glucose in the molar ratio of 11.95∶13.95∶0.79∶0.27. CSP was an acidic polysaccharides with water-soluble, high viscosity.

camelina sativa polysaccharide, ioslation and puirifcation, physichemical characters

TS201.1

A

1003-0174(2016)06-0052-05

2015-04-29

李澤珍，女，1980年出生，講師，果蔬貯藏與加工，天然產(chǎn)物開發(fā)

陳敏，女， 1956年出生，教授，天然產(chǎn)物開發(fā)