王 菲， 喻文立， 賈莉莉， 顧向前， 翁亦齊， 杜洪印

(1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院， 天津 300070； 2天津市第一中心醫(yī)院麻醉科， 天津 300192)

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異丙酚通過抑制JAK/STAT通路減輕肝冷缺血再灌注大鼠腎損傷*

王 菲1， 喻文立2△， 賈莉莉1， 顧向前1， 翁亦齊2， 杜洪印2

(1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院， 天津 300070；2天津市第一中心醫(yī)院麻醉科， 天津 300192)

目的： 探討JAK/STAT信號通路在異丙酚減輕大鼠肝冷缺血再灌注后腎損傷中的作用。方法:SD大鼠隨機分為4組(n=8)：假手術(shù)組(sham組)；肝冷缺血再灌注模型組(I/R組)；異丙酚組(Pro組)，于再灌注前5 min經(jīng)右側(cè)股靜脈給予異丙酚20 mg·kg-1·h-1持續(xù)泵注30 min；JAK2抑制劑AG490組(AG490組)，于建立模型前30 min腹腔注射AG490 10 mg/kg。再灌注6 h后處死大鼠，采集血樣和腎組織標(biāo)本，檢測血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度及腎組織超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平；觀察腎組織的病理學(xué)改變，并進行腎小管損傷評分；檢測腎組織細(xì)胞凋亡并計算凋亡指數(shù)(AI)；檢測p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平。結(jié)果:與sham組比較，I/R組血清的Cr和BUN濃度、腎組織的MDA含量、腎小管損傷評分及AI均明顯升高，SOD活性降低，p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)。與I/R組相比，Pro組和AG490組的血清BUN和Cr濃度、腎組織的MDA含量、AI和腎小管損傷評分降低，SOD活性升高，p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論:異丙酚可減輕肝冷缺血再灌注后腎損傷，其機制可能與抑制JAK/STAT信號通路激活有關(guān)。

異丙酚； 缺血再灌注損傷； JAK/STAT信號通路； 肝； 腎

肝冷缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)是創(chuàng)傷性休克、肝臟外科臨床中常見的病理生理過程，不僅會導(dǎo)致肝臟損傷，還可導(dǎo)致遠(yuǎn)隔臟器的損傷及功能下降，其中腎臟是最容易受累的臟器之一[1]，目前尚缺乏有效對策。異丙酚(propofol,Pro)作為一種臨床常用的靜脈麻醉藥物，可通過抗炎、抗氧化及抗凋亡等不同機制發(fā)揮器官保護作用[2]。研究表明，異丙酚可減輕腎缺血再灌注損傷[3-4]，且Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路的活化與腎缺血再灌注損傷密切相關(guān)[5]，但異丙酚能否減輕肝冷缺血再灌注后的腎損傷以及JAK/STAT通路是否與此作用有關(guān)，仍不十分明確。本實驗采用大鼠肝冷缺血再灌注模型，探討JAK/STAT信號通路在異丙酚減輕大鼠肝冷缺血再灌注腎損傷中的作用，為異丙酚應(yīng)用于移植手術(shù)防治遠(yuǎn)隔器官損傷提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

異丙酚(AstraZeneca)；AG490(Selleck)；IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(上海拜沃公司)；蛋白質(zhì)定量試劑盒、MDA試劑盒和SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL試劑盒(Roche)；兔抗p-JAK2和p-STAT3(Abcam)；兔抗p-STAT1及GAPDH(CST)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore)。熒光顯微鏡(Olympus)；全自動生化分析儀(Roche)。

2 動物選擇及分組

SPF級成年健康雄性SD大鼠32只，8～10周齡，體重200～250 g，購于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組：假手術(shù)組(sham組)僅開腹，游離肝臟周圍血管及韌帶后關(guān)腹；肝冷缺血再灌注模型組(I/R組)參照文獻建立肝冷缺血再灌注模型；異丙酚組(Pro組)建立模型，于再灌注前5 min經(jīng)右側(cè)股靜脈給予異丙酚，按20 mg·kg-1·h-1的劑量持續(xù)泵注30 min；AG490(JAK2抑制劑)組于建立模型前30 min腹腔注射AG490 10 mg/kg。

3 主要方法

3.1 模型制備 參照文獻[6]并加以改良，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射5%水合氯醛60 mg/kg麻醉，備皮消毒后，經(jīng)腹正中切口入腹，顯露劍突，離斷肝鐮狀韌帶并鈍性分離肝上下腔靜脈，在右腎靜脈水平以上鈍性分離肝下下腔靜脈，腸系膜上靜脈與脾靜脈匯合處以上分離門靜脈及肝固有動脈，同時電凝右腎上腺靜脈和肝食管靜脈叢。然后使用無損傷血管夾夾閉肝固有動脈和門靜脈，靠近右腎靜脈水平以上阻斷肝下下腔靜脈，從而阻斷入肝血流。于門靜脈阻斷水平以上用肝素針灌注4 ℃肝素生理鹽水1 mL，將肝內(nèi)血液沖入體循環(huán)，之后夾閉肝上下腔靜脈。然后用顯微組織剪在肝下下腔靜脈血管夾上方開口1～2 mm，作為灌注液流出道，經(jīng)門靜脈灌注道常壓灌注4 ℃乳酸林格氏液6～8 mL/min，灌注時間為40 min?？梢姼闻K逐漸變至土黃色，觸之冰涼。灌注結(jié)束后，使用8-0無損傷縫合線縫合肝下下腔靜脈流出道，棉球按壓門靜脈穿刺點止血，依次開放肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈、門靜脈、肝固有動脈，恢復(fù)肝臟血流，用溫生理鹽水沖洗腹腔后關(guān)腹。術(shù)后烤燈照射至大鼠復(fù)蘇，自由飲水。

3.2 血清BUN、Cr、IL-6和TNF-α濃度的測定 于再灌注6 h時經(jīng)下腔靜脈抽取血樣4 mL，離心后留取上清，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清BUN及Cr的濃度。酶聯(lián)免疫吸附法測定血清IL-6和TNF-α的含量。

3.3 腎組織MDA和SOD水平的測定 采血后，取左腎組織制備10%組織勻漿，參照MDA及SOD試劑盒說明書，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

3.4 腎組織的病理學(xué)觀察 取右腎組織，10%中性甲醛溶液固定后進行石蠟包埋，制備病理切片(厚約4 μm)，HE染色后于光鏡下(×200)觀察腎組織病理學(xué)結(jié)果。由兩位病理科醫(yī)師雙盲下采用Jablonski半定量評分[7]，評價腎小管損傷程度(0～4分)。正常為0分；最輕度損傷(<5%的皮質(zhì)或髓質(zhì)外層損傷)為1分；輕度損傷(5%～25%的皮質(zhì)或髓質(zhì)外層損傷)為2分；中度損傷(26%～75%的皮質(zhì)或髓質(zhì)外層損傷)為3分；嚴(yán)重?fù)p傷(>75%的皮質(zhì)或髓質(zhì)外層損傷)為4分。

3.5 腎組織細(xì)胞凋亡的檢測 腎組織切片脫蠟水化后，采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行，后用DAPI復(fù)染。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，正常細(xì)胞核為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為紅色；每張切片隨機取5個高倍視野(×200)，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計算凋亡指數(shù)(apoptotic index， AI; %)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3.6 p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白水平的檢測 采用Western blot法進行檢測。取左腎組織，稱重、研磨，加蛋白裂解液(質(zhì)量∶體積=1∶10)、蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑，勻漿裂解30 min后，4 ℃ 13 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量。上樣量為50 μg，于10%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，隨后加入兔抗p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min 3次；加入 II 抗，于室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光自顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Gel-Pro32圖像分析軟件測定蛋白條帶的灰度值，以p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3分別與內(nèi)參照灰度的比值反映目的蛋白的水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本各組均數(shù)間的多重比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血清BUN、Cr、IL-6和TNF-α及腎組織MDA、SOD的水平

與sham組比較，其余3組腎功能受損，BUN和Cr濃度明顯升高，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激增強，IL-6和TNF-α濃度及MDA含量明顯升高，SOD水平降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pro組和AG490組腎功能明顯改善，BUN和Cr濃度降低，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激緩解，IL-6和TNF-α濃度及MDA含量降低，SOD水平升高(P<0.05)，見表1。

表1 血清BUN、Cr、IL-6和TNF-α及腎組織MDA、SOD的水平

2 腎組織的病理學(xué)改變

光鏡下觀察sham組腎小管排列整齊，間質(zhì)無充血水腫；I/R組可見多數(shù)腎小管上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞空泡變性，腎小管擴張，管腔狹窄，排列紊亂，間質(zhì)擴張淤血；Pro組和AG490組損傷較I/R組減輕，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣改變減少，腎小管輕度擴張，腎小管上皮細(xì)胞排列趨于正常，間質(zhì)淤血明顯減輕，見圖1。

3 腎組織的細(xì)胞凋亡情況

Sham組僅見極少凋亡細(xì)胞；I/R組腎組織細(xì)胞凋亡明顯，AI升高(P<0.05)；給予Pro和AG490后，細(xì)胞凋亡明顯減輕，AI降低(P<0.05)，見圖2。

4 Western blot實驗結(jié)果

Sham組的p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3幾乎測不出，缺血再灌注后p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平均顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pro組和AG490組p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平均降低(P<0.05)，提示異丙酚和AG490同樣可抑制JAK/STAT通路的激活，見圖3。

Figure 1. The pathological changes of the kidney tissues (HE staining,×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變

Figure 2.Apoptosis analysis of the kidney tissues with different treatments (TUNEL staining,×200). AI: apoptotic index. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖2 TUNEL染色觀察各組大鼠細(xì)胞凋亡情況

Figure 3.The protein levels of p-JAK2, p-STAT1a and p-STAT3 in the kidney tissues. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖3 Western blot法檢測p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平

討 論

肝臟缺血再灌注損傷是引發(fā)多器官功能障礙的重要因素[1, 8]。由于腎臟的解剖與生理特征，阻斷肝血流以及再灌注過程均可引起腎損傷，嚴(yán)重影響患者生存和預(yù)后。因此，研究肝缺血再灌注后腎損傷機制并制定有效的防治措施至關(guān)重要。

已有研究證實，異丙酚可改善離體肥厚性心肌缺血再灌注損傷后的功能恢復(fù)[9]，且減輕高糖血癥大鼠的腎缺血再灌注損傷[10]。然而，對于肝冷缺血再灌注后異丙酚的腎臟保護作用研究甚少，且潛在機制仍不明確。因此本研究參照文獻建立肝冷缺血再灌注模型，對靜脈用藥異丙酚的腎保護作用進行研究。參照文獻[11-12]及預(yù)實驗，本研究選擇于再灌注前5 min給予異丙酚20 mg·kg-1·h-1，持續(xù)泵注30 min，于建立模型前30 min腹腔注射AG490 10 mg/kg，并于再灌注后6 h對各項指標(biāo)進行檢測。

肝臟缺血再灌注誘發(fā)腎損傷涉及多種因素。再灌注后，激活的Kupffer細(xì)胞大量釋放IL-6、TNF-α等促炎因子, 其可介導(dǎo)趨化因子的表達，促進中性粒細(xì)胞的激活、聚集與浸潤，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[13]?；罨闹行粤＜?xì)胞向內(nèi)皮下間隙聚集，產(chǎn)生大量的活性氧，生物酶及細(xì)胞因子，導(dǎo)致腎臟的直接損傷[8]。MDA含量以及SOD活性可反映腎臟氧化應(yīng)激水平。內(nèi)皮細(xì)胞的完整性對于減慢白細(xì)胞向受損區(qū)域聚集，緩解腎臟損傷至關(guān)重要。Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)肝缺血再灌注可導(dǎo)致顯著的腎臟內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加劇腎臟損傷。本研究結(jié)果表明，給予異丙酚后腎功能明顯改善，BUN和Cr濃度降低，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激緩解，IL-6和TNF-α濃度及MDA含量降低，SOD水平升高，病理損傷減輕，腎小管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少。然而，其腎保護作用所涉及的具體信號通路尚需要進一步研究。

JAK/STAT信號通路作為細(xì)胞內(nèi)的一條重要的信號傳導(dǎo)途徑，分別由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族組成，參與細(xì)胞生長、增殖分化、炎癥、凋亡等多種病理生理過程。研究表明，JAK/STAT信號通路參與缺血再灌注損傷過程，然而此通路及其抑制劑AG490在缺血再灌注損傷過程中的作用仍存在爭議。Buendia 等[15]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素受體激動劑Neu-P11能夠激活JAK/STAT通路減輕腦缺血再灌注模型中氧化應(yīng)激反應(yīng)。Si 等[16]發(fā)現(xiàn)抑制JAK2/STAT3通路減輕了腎缺血再灌注腎小管細(xì)胞凋亡。與李毅等[17]研究結(jié)果相一致，我們發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下，腎組織中僅有少量的p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白，而缺血再灌注損傷后p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平顯著增高，給予JAK2特異性抑制劑AG490后，p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平下調(diào)。與此同時，AG490組大鼠腎功能得到改善，腎臟病理損傷減輕，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡均明顯減輕。提示本研究模型中，抑制JAK/STAT信號通路激活可減輕腎臟損傷。與此同時，Western blot實驗的結(jié)果顯示給予異丙酚后，p-JAK2和p-STAT1、p-STAT3的蛋白水平明顯降低，提示異丙酚可抑制JAK/STAT信號通路激活。表明異丙酚減輕肝冷缺血再灌注后腎損傷可能與抑制該通路激活有關(guān)。

綜上所述，JAK/STAT信號通路的激活參與了肝冷缺血再灌注所致腎損傷的發(fā)生，異丙酚可通過抑制此通路激活減輕炎癥反應(yīng)、氧化損傷與細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮其腎臟保護作用。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Propofol attenuates kidney injury after liver cold ischemia/reperfusion in rats via inhibiting JAK/STAT signaling activation

WANG Fei1, YU Wen-li2, JIA Li-li1, GU Xiang-qian1, WENG Yi-qi2, DU Hong-yin2

(1TheFirstCenterClinicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2DepartmentofAnesthesiology,TianjinFirstCenterHospital,Tianjin300192,China.E-mail:yzxyuwenli@163.com)

AIM: To investigate the role of Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signaling pathway in propofol (Pro)-induced reduction of kidney injury after liver cold ischemia/reperfusion in rats. METHODS: Sprague-Dawley rats were assigned randomly to 4 groups (n=8 each group): sham operation group (sham group); liver cold ischemia/reperfusion model group (I/R group); propofol group (Pro group): propofol at dose of 20 mg·kg-1·h-1was infused continuously for 30 min via right femoral vein 5 min before reperfusion; JAK2 inhibitor AG490 group (AG490 group): AG490 at dose of 10 mg/kg was applied by intraperitoneal injection 30 min before establishing the model. The rats were sacrificed at 6 h after reperfusion. Blood samples and kidney tissues were obtained to detect the serum concentrations of creatinine (Cr), blood urea nitrogen (BUN), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and the tissue levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD). The pathologic changes of the renal tissues and nephritic cell apoptosis were analyzed, the damage of the renal tubules was scored and apoptotic index (AI) was calculated. The protein levels of p-JAK2, p-STAT1 and p-STAT3 were determined by Western blot. RESULTS: Compared with sham group, the levels of Cr, BUN, IL-6, TNF-α and MDA, AI, and renal tubular damage score were significantly increased, the SOD activity was decreased, and the protein levels of p-JAK2, p-STAT1 and p-STAT3 were up-regulated in I/R group (P<0.05). Compared with I/R group, the levels of Cr, BUN, IL-6, TNF-α and MDA, AI, and renal tubular damage score were significantly decreased, the SOD activity was increased, and the protein levels of p-JAK2, p-STAT1 and p-STAT3 was down-regulated in Pro group and AG490 group (P<0.05). CONCLUSION: Propofol reduces kidney injury induced by liver cold ischemia/reperfusion, and the mechanism is possibly associated with inhibiting the JAK/STAT pathway activation.

Propofol; Ischemia/reperfusion injury; JAK/STAT signaling pathway; Liver; Kidney

1000- 4718(2016)11- 2026- 05

2016- 05- 31

2016- 08- 11

天津市衛(wèi)生行業(yè)重點攻關(guān)項目(No. 13KG105)；天津市衛(wèi)生局科技基金(No. 2011KY12)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃面上項目(No.05YFJMJC14800)

R363.2

A

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