楊士芳， 李曉明， 安 弘， 高興林

(廣東省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所， 廣東 廣州 510080)

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HIF-1α介導(dǎo)了間歇低氧對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響*

楊士芳， 李曉明， 安 弘， 高興林△

(廣東省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所， 廣東 廣州 510080)

目的： 探討缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是否介導(dǎo)間歇低氧對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外活力、凋亡以及侵襲的影響。方法:采用體外轉(zhuǎn)染方法將特異性針對(duì)HIF-1α的siRNA導(dǎo)入A549細(xì)胞，在間歇低氧條件下培養(yǎng)后通過(guò)real-time PCR和Western blot法檢測(cè) HIF-1α及其下游Bcl-2、Bax、P53、P21、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)；通過(guò)MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)A549細(xì)胞的活力、凋亡及細(xì)胞周期；通過(guò)Transwell小室檢測(cè)A549細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果:未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞[間歇低氧空白對(duì)照組(IHC組)、間歇低氧空載體對(duì)照組(IHE組)及間歇低氧陰性對(duì)照組(IHN組)]經(jīng)間歇低氧干預(yù)后的HIF-1α、Bcl-2及VEGF表達(dá)均明顯高于常氧對(duì)照組(RA組)，Bax及P21表達(dá)均明顯低于RA組(P<0．05)，而轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞[間歇低氧siRNA組(IHS組)]較IHC組、IHE組及IHN組經(jīng)間歇低氧干預(yù)后的HIF-1α、BCL-2及VEGF表達(dá)均明顯下調(diào)，Bax及P21表達(dá)較均明顯上調(diào)(P<0.05)；所有間歇低氧組A549細(xì)胞的P53表達(dá)均較RA組升高(P<0.05)，但各間歇低氧組之間無(wú)顯著性差異。IHC組、IHE組及IHN組A549細(xì)胞經(jīng)間歇低氧干預(yù)后較RA組的細(xì)胞活力增強(qiáng)，凋亡率下降，侵襲力增強(qiáng)(P<0.05)，而IHS組A549細(xì)胞經(jīng)間歇低氧干預(yù)后細(xì)胞周期被阻滯于G1期，較未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力下降，凋亡增加，侵襲能力下降(P<0.05)。結(jié)論:間歇低氧可通過(guò)HIF-1α途徑調(diào)控其下游基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)A549細(xì)胞的活力和轉(zhuǎn)移；通過(guò)RNA干擾技術(shù)造成HIF-1α基因沉默可以抑制間歇低氧引起的A549細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

間歇低氧； 缺氧誘導(dǎo)因子1α； RNA干擾； A549細(xì)胞

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)的特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作的呼吸暫停伴間歇性低氧血癥(周期性血氧飽和度下降-上升)、胸內(nèi)負(fù)壓波動(dòng)和睡眠覺(jué)醒，其中慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是造成OSAHS患者其他臟器損害的基礎(chǔ)。近年來(lái)，多項(xiàng)多中心隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)OSAHS患者肺癌發(fā)病率和死亡率升高[1-2]，但具體機(jī)制尚不清楚。低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是一個(gè)受氧調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子，研究發(fā)現(xiàn)，間歇低氧可增強(qiáng)HIF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性[3]，同時(shí)HIF-1α又稱(chēng)為促癌因子，在腫瘤的血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)及發(fā)展等各方面起到重要作用[4]?；谏鲜鲅芯?，本實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌A549為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察間歇低氧對(duì)A549細(xì)胞HIF-1α表達(dá)及其下游基因表達(dá)和A549細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響，并采用RNA干擾技術(shù)沉默細(xì)胞中HIF-1α，觀察HIF-1α基因沉默后間歇低氧對(duì)A549細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞來(lái)源

人肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含體積分?jǐn)?shù)10%新生胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待傳至第5代時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；XbaI、HpaI及T4 DNA連接酶購(gòu)自大連TaKaRa；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen；總RNA抽提試劑TRIzol購(gòu)自Life Technologies；鼠抗單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG購(gòu)自天津賽爾生物有限公司；凝聚胺、多聚賴(lài)氨酸和噻唑藍(lán)購(gòu)自Sigma；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。所有引物由TaKaRa根據(jù)設(shè)計(jì)合成，詳細(xì)序列見(jiàn)表1。

3 主要方法

3.1HIF-1α干擾序列及轉(zhuǎn)染、分組 帶FAM熒光標(biāo)記的HIF-1α干擾序列(HIF-1α-siRNA)購(gòu)自大連TaKaRa，其上游引物序列為5’-UGUAGUAGCU GCAUGAUCGdTdT-3’，下游引物序列為5’-GACUACUGGUCGUUGAACUdTdT-3’；無(wú)關(guān)序列陰性對(duì)照siRNA的上游引物序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游引物序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT3’。采用脂質(zhì)體法將HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，按普通視野下計(jì)數(shù)細(xì)胞及熒光下相同視野計(jì)熒光細(xì)胞數(shù)。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[5]建立間歇低氧細(xì)胞模型，并根據(jù)轉(zhuǎn)染內(nèi)容和干預(yù)方式不同分為5組：間歇低氧siRNA組(IHS組：轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA細(xì)胞+間歇低氧干預(yù))、間歇低氧陰性對(duì)照組(IHN組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列細(xì)胞+間歇低氧干預(yù))、間歇低氧空載體對(duì)照組(IHE組：轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞+間歇低氧干預(yù))、間歇低氧空白對(duì)照組(IHC組：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+間歇低氧干預(yù))及常氧對(duì)照組[RA組：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞+常氧干預(yù)(21% O2，5% CO2條件下培養(yǎng))]。間歇低氧模式均為5% O2、5% CO2低氧35 min，21% O2、5% CO2復(fù)氧25 min，低氧和常氧交替進(jìn)行，所有細(xì)胞在干預(yù)72 h 后回收用于以下檢測(cè)。

3.2 Real-time PCR檢測(cè)A549細(xì)胞干預(yù)后HIF-1α及其下游基因的mRNA表達(dá) 收集經(jīng)上述干預(yù)72 h的細(xì)胞，用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列通過(guò)Primer 5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由TaKaRa合成。用Applied Biosystems 7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為10 μL：上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，Real-Time PCR Master Mix 5 μL，蒸餾水2.2 μL。將各組cDNA及相應(yīng)上述試劑分別加入TB板孔內(nèi)，并將樣品倍比稀釋后分別加入各檢測(cè)基因的上下游引物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)副孔；上樣完畢后上機(jī)檢測(cè)，設(shè)置為兩步法： 95 ℃ 60 s； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40 個(gè)循環(huán)，并添加融解曲線。 以Bio-Rad CFX Manager 3.0分析，用2-ΔΔCt來(lái)表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.3 Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞干預(yù)后HIF-1α及其下游蛋白的表達(dá) 收集干預(yù)后的A549細(xì)胞，用預(yù)冷PBS清洗2遍，加入冰冷 RIPA 蛋白裂解緩沖液，4 ℃輕搖勻漿，冰浴 45 min，12 000 r/min 離心 20 min，收集上清液即總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。灌制10%分離膠、5%濃縮膠。吸取60 μg總蛋白，恒壓80 V，30 min，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠，把電壓提高到120 V，繼續(xù)電泳90 min 直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的脫脂奶粉/TBS T封閉1 h，加入 I 抗(HIF-1α、Bax、Bcl-2、P21、P53、VEGF及GAPDH抗體，均購(gòu)自Santa Cruz)4 ℃孵育過(guò)夜。再加入1∶4 000稀釋 的II 抗IgG，孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影。UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 5.0軟件分析條帶灰度值，將各樣本蛋白量(灰度值)除以?xún)?nèi)參照GAPDH蛋白量以校正誤差，所得數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品蛋白的相對(duì)含量(相對(duì)灰度值)。

3.4 四甲基偶氮唑鹽法(MTT)法檢測(cè)干預(yù)后A549細(xì)胞的增殖 各組A549細(xì)胞經(jīng)干預(yù)72 h后向各孔加入20 μL(5 g/L)的MTT溶液，于4 h后吸去上清，再向各孔內(nèi)加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)振蕩10 min，至結(jié)晶充分溶解，經(jīng)調(diào)零孔調(diào)零后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度(A)值，以O(shè)D值反映A549細(xì)胞活力，每組重復(fù)3孔。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-PE雙染色法檢測(cè)干預(yù)后A549細(xì)胞的凋亡 各組A549細(xì)胞經(jīng)干預(yù)72 h后用預(yù)冷PBS液洗滌細(xì)胞2次，棄上清，加入1×binding buffer 500 μL，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/L，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-PE，避光混勻后，再加入5 μL 7-AAD，另設(shè)空白管加入等體積PBS作為對(duì)照，輕輕震蕩混勻后，室溫避光孵育15 min，加入1× binding buffer約400 μL，用200目濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm檢測(cè)，Cellquest軟件讀取細(xì)胞1 000個(gè)，并用Modifit軟件分析。

3.6 流式細(xì)胞術(shù)PI染色法測(cè)干預(yù)后A549細(xì)胞的細(xì)胞周期 各組A549細(xì)胞干預(yù)72 h后，用預(yù)冷PBS液洗滌細(xì)胞2次，移至1.5 mL離心管中，加入冰冷70%乙醇3 mL固定細(xì)胞，4 ℃放置24 h，冷PBS清洗細(xì)胞2次，加入1 mL PI染液(含RNase)，輕輕震蕩混勻，室溫下避光放置15 min，用200目濾膜過(guò)濾細(xì)胞后上機(jī)分析：激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm檢測(cè)，Cellquest軟件讀取細(xì)胞1 000個(gè)，并用Modifit軟件分析。

3.7 Transwell小室檢測(cè)間歇缺氧對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外侵襲的影響 在Transwell上室的聚碳酸酯膜上先加入1∶2(Matrigel∶DMEM)的Matrigel 60 μL，置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠；Transwell下室中加入10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μL，各組細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，在上室孔中每孔準(zhǔn)確加入細(xì)胞1×105個(gè)，細(xì)胞懸液體積150 μL，每組重復(fù)3孔，根據(jù)分組進(jìn)行常氧或間歇低氧培養(yǎng)72 h后擦去上面的Matrigel，蘇木素-伊紅染色，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)背面穿過(guò)的腫瘤細(xì)胞數(shù)，各選5個(gè)視野，計(jì)算平均值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞后可見(jiàn)綠色熒光，24 h后轉(zhuǎn)染效率約為87%，見(jiàn)圖1。

2 HIF-1α及其下游基因Bcl-2、Bax、P21、P53及VEGF的mRNA表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后HIF-1α的mRNA表達(dá)均明顯高于RA組(P<0．05)，而轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(HIS組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后HIF-1α的mRNA表達(dá)明顯下降，顯著低于IHC組、IHE組及IHN組(P<0．05)；IHC組、IHE組及IHN組A549細(xì)胞經(jīng)間歇低氧干預(yù)后Bcl-2及VEGF的mRNA均明顯高于RA

Figure 1.The A549 cell transfection efficiency (24 h after transfection, ×200). A: under bright field; B: under fluorescence field.

圖1 A549細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后的轉(zhuǎn)染效率

組(P<0．05)，而HIF-1α沉默后IHS組A549細(xì)胞Bcl-2及VEGF的mRNA表達(dá)較IHC組、IHE組及IHN組均明顯下調(diào)(P<0．05)；IHC組、IHE組及IHN組A549細(xì)胞經(jīng)間歇低氧干預(yù)后Bax及P21的mRNA均明顯低于RA組(P<0．05)，而HIF-1α沉默后IHS組A549細(xì)胞Bax及P21的mRNA表達(dá)較IHC組、IHE組及IHN組均明顯上調(diào)(P<0．05)；所有間歇低氧組A549細(xì)胞P53的mRNA表達(dá)均較常氧對(duì)照組升高(P<0．05)，但各間歇低氧組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表2。

表2 A549細(xì)胞HIF-1α及其下游基因的mRNA表達(dá)

3 HIF-1α及其下游Bcl-2、Bax、P21、P53及VEGF的蛋白表達(dá)

與mRNA表達(dá)相似，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后HIF-1α的蛋白表達(dá)均明顯高于RA組(P<0．05)，而轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(HIS組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后HIF-1α的蛋白表達(dá)明顯下降，顯著低于IHC組、IHE組及IHN組(P<0．05)；IHC組、IHE組及IHN組A549細(xì)胞經(jīng)間歇低氧干預(yù)后Bcl-2及VEGF的蛋白均明顯高于RA組(P<0．05)，而HIF-1α沉默后IHS組A549細(xì)胞Bcl-2及VEGF的蛋白表達(dá)較IHC組、IHE組及IHN組均明顯下調(diào)(P<0．05)；IHC組、IHE組及IHN組A549細(xì)胞經(jīng)間歇低氧干預(yù)后Bax及P21的蛋白均明顯低于RA組(P<0．05)，而HIF-1α沉默后IHS組A549細(xì)胞Bax及P21的蛋白表達(dá)較IHC組、IHE組及IHN組均明顯上調(diào)(P<0．05)；所有間歇低氧組A549細(xì)胞P53 蛋白表達(dá)均較常氧組升高(P<0．05)，但各間歇低氧組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

4 MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞活力

綜上所述，通過(guò)對(duì)病毒性肝炎患者展開(kāi)血常規(guī)及生化檢驗(yàn)，可對(duì)其血細(xì)胞功能及生化水平進(jìn)行充分掌握，從而為臨床診治提供科學(xué)可靠的參考數(shù)據(jù)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后，A值分別為0.64±0.02、0.60±0.01和0.63±0.20，均明顯高于RA組(0.31±0.02)(P<0．05)；而轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHS組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后A值為0.10±0.01，顯著低于IHC組、IHE組及IHN組(P<0．05)，見(jiàn)圖3。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后的凋亡率分別為1.37%、1.41%和1.55%，明顯低于RA組(3.55%)(P<0.05)，而HIF-1α沉默組(IHS組)A549細(xì)胞間歇缺氧狀態(tài)下的凋亡水平為12.48%，較IHC組、IHE組及IHN組明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后處于G1階段的細(xì)胞量分別占總細(xì)胞量

Figure 2.HIF-1α and its downstream protein expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRA;#P<0.05vsIHS.

圖2 A549細(xì)胞HIF-1α及其下游蛋白的表達(dá)

Figure 3.Avalues of A549 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n= 3.*P<0.05vsRA;#P<0.05vsIHS.

圖3 間歇缺氧和HIF-1α沉默對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

的50.80%、49.81%和47.21%，與RA組(61.98%)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但HIF-1α沉默后IHS組A549細(xì)胞G1階段的細(xì)胞量為77.76%，明顯高于IHC組、IHE組及IHN組組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后穿膜細(xì)胞數(shù)分別為92.67±4.35、89.20±5.16和90.73±3.17，明顯高于RA組(43.40±3.50)(P<0.05)，而HIF-1α沉默組(IHS組)A549細(xì)胞經(jīng)間歇低氧刺激后穿膜細(xì)胞數(shù)為27.20±4.65，較 IHC組、IHE組及IHN組明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

OSAHS是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，可造成全身各個(gè)系統(tǒng)的綜合性損傷，其核心特征即為反復(fù)發(fā)作的呼吸暫停伴間歇性低氧血癥。近年來(lái)，多項(xiàng)多中心隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)OSAHS患者肺癌發(fā)病率和死亡率升高[1,2]，但目前對(duì)于肺癌合并OSAHS的患者死亡率高的原因尚不清楚。

HIFs作為最重要的能夠應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)氧濃度的降低而對(duì)多種基因進(jìn)行調(diào)控的轉(zhuǎn)綠因子家族，在多種疾病的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。HIF是由α亞基和β亞基組成的具有轉(zhuǎn)錄活性的異源二聚體，其中α亞基為功能亞基，受氧濃度調(diào)控，哺乳動(dòng)物存在3種α亞基(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)，3種亞基作用不同，研究較為深入的是HIF-1α。在常氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)后被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)迅速降解；但低氧環(huán)境下，HIF-1α的泛素降解途徑遭到破壞，HIF-1α從胞漿進(jìn)入胞核，與胞核內(nèi)的HIF-1β二聚化，形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的異二聚體 HIF-1，激活的HIF-1與下游靶基因結(jié)合后能激活下游眾多缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，使機(jī)體對(duì)缺氧反應(yīng)進(jìn)行一系列的調(diào)節(jié)[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在腫瘤的血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)及發(fā)展等各方面起到重要作用[4]。

本實(shí)驗(yàn)以人肺腺癌A549為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察間歇低氧對(duì)A549細(xì)胞HIF-1α表達(dá)及其下游基因表達(dá)和A549細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響，并采用RNA干擾技術(shù)沉默細(xì)胞中HIF-1α，觀察HIF-1α基因沉默后間歇低氧對(duì)A549細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后與常氧對(duì)照組(RA組)相比，HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)升高，凋亡率下降；而HIF-1α沉默明顯增加了A549細(xì)胞間歇缺氧狀態(tài)下的凋亡率，提示間歇缺氧可通過(guò)HIF-1α途徑抑制A549細(xì)胞凋亡，而經(jīng)RNA干擾技術(shù)將HIF-1α沉默可促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。眾所周知，與人類(lèi)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白主要有Bcl-2家族蛋白和P53蛋白[7]。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要調(diào)控作用，根據(jù)其功能可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是抑制細(xì)胞凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xL等；另一類(lèi)是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，如Bax、Bid等，其中Bcl-2與Bax之間的失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，當(dāng)Bcl-2/Bax的比值增加，細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋放減少，caspase酶活性受到抑制，引起凋亡的抑制效應(yīng)[8]。P53作為人體內(nèi)重要的抑癌基因，在DNA復(fù)制、修復(fù)、重組及細(xì)胞周期調(diào)控中都起到重要作用，它的失活可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。HIF-1α通過(guò)何種途徑發(fā)揮抗凋亡作用的呢？本研究Real-time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后Bcl-2表達(dá)明顯高于RA組，Bax表達(dá)明顯低于RA組，而HIF-1α沉默后A549細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)升高，提示HIF-1α可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗A549細(xì)胞的凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)P53的mRNA和蛋白在沉默組(HIS組)和非沉默組IHC組、IHE組及IHN組表達(dá)無(wú)差異，究其原因我們推測(cè)P53表達(dá)可能由HIF-2α調(diào)控，而非HIF-1α[10]。綜合上述結(jié)果提示HIF-1α可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)而非P53途徑來(lái)發(fā)揮抗A549細(xì)胞的凋亡作用。

Figure 4.The effect of intermittent hypoxia andHIF-1αgene silencing on A549 cell apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRA;#P<0.05vsIHS.

圖4 間歇缺氧和HIF-1α沉默對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5.The effect of intermittent hypoxia andHIF-1αgene silencing on A549 cell cycle distribution. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIHS.

圖5 間歇缺氧和HIF-1α沉默對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

Figure 6.The number of invasive A549 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRA;#P<0.05vsIHS.

圖6 間歇缺氧和HIF-1α沉默對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

腫瘤主要表現(xiàn)為細(xì)胞周期紊亂和失控性生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后MTT 實(shí)驗(yàn)A值均顯高于RA組，而HIF-1α沉默的A549細(xì)胞(IHS組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后MTT 實(shí)驗(yàn)A值顯著低于HIF-1α未沉默的A549細(xì)胞，提示間歇缺氧可通過(guò)HIF-1α途徑增加A549細(xì)胞活力，沉默HIF-1α可以抑制A549細(xì)胞活力。而且流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示HIF-1α沉默組(IHS組)G1階段的細(xì)胞量明顯高于未轉(zhuǎn)染組(IHC組、IHE組及IHN組)，提示HIF-1α沉默可通過(guò)使A549細(xì)胞出現(xiàn)G1周期停滯進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。P21是一種重要的胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子，主要參與調(diào)控細(xì)胞在G1/S期的轉(zhuǎn)換，它可以使細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖[10]。P21可以通過(guò)兩條途徑發(fā)揮作用，一條途徑是由P53介導(dǎo)的，另一條是非P53依賴(lài)途徑，在P53蛋白或基因缺失的細(xì)胞中，其它因子也可以誘導(dǎo)P21的表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后P21表達(dá)明顯高于RA組(P<0.05)，而HIF-1α沉默后IHS組A549細(xì)胞較非沉默組IHC組、IHE組及IHN組A549細(xì)胞P21表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；而前述P53 mRNA和蛋白在沉默組(HIS組)和非沉默組IHC組、IHE組及IHN組表達(dá)無(wú)差異。上述結(jié)果提示間歇缺氧可能通過(guò)HIF-1α上調(diào)P21表達(dá)，而非P53表達(dá)，使A549細(xì)胞停滯于G1期，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

肺癌預(yù)后差主要體現(xiàn)在通過(guò)血管和淋巴轉(zhuǎn)移，因此有效抑制腫瘤血管生成是提高肺癌生存率的重要策略。腫瘤血管的形成與某些血管生成素和生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等有關(guān)，其中VEGF在腫瘤的血管形成過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)實(shí)體腫瘤組織VEGF高表達(dá)，并與其生物學(xué)行為相關(guān)[13]，且腫瘤缺氧時(shí)HIF-1α在調(diào)節(jié)VEGF的信號(hào)途徑中起紐帶作用，它不僅能使VEGF的mRNA穩(wěn)定性增加，而且還能增加VEGF的轉(zhuǎn)錄活性[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA的A549細(xì)胞(IHC組、IHE組及IHN組)經(jīng)間歇低氧干預(yù)后VEGF表達(dá)明顯升高，且Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IHC組、IHE組及IHN組 A549細(xì)胞侵襲能力明顯高于RA組；而沉默HIF-1α使A549細(xì)胞在間歇低氧干預(yù)下VEGF表達(dá)明顯下降，侵襲能力下降。上述結(jié)果提示，間歇低氧可通過(guò)HIF-1α途徑上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，沉默HIF-1α可降低VEGF表達(dá)，減少腫瘤組織新生血管形成，進(jìn)而對(duì)A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移起到阻滯作用。

綜上所述，慢性間歇低氧可通過(guò)HIF-1α途徑調(diào)控其下游的腫瘤凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因以及新生血管相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；通過(guò)RNA干擾技術(shù)造成HIF-1α基因沉默可以抑制間歇低氧引起的A549細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此可以推測(cè)，糾正間歇低氧可能有助于肺癌合并OSAHS患者的抗腫瘤治療，并且針對(duì)HIF-1α的靶向治療有望在肺癌合并OSAHS患者的抗腫瘤治療中顯現(xiàn)出極具前景的價(jià)值。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

HIF-1α mediates effect of intermittent hypoxia on biological behavior of A549 cells in vitro

YANG Shi-fang, LI Xiao-ming, AN Hong, GAO Xing-lin

(DepartmentofRespiratoryDiseases,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,GuangdongInstituteofGeriatrics,Guangzhou510080,China.E-mail:xinglingao@hotmail.com)

AIM: To investigate whether hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) mediates the effect of intermittent hypoxia on A549 cell viability, apoptosis and invasive abilityinvitro.METHODS: A549 cells were transfected with HIF-1α-siRNA and cultured under intermittent hypoxia. The expression of HIF-1α and its downstream genes, such as Bcl-2, Bax, P53, P21 and VEGF at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. The viability of the A549 cells was measured by MTT assay. The apoptosis and cell cycle distribution of the A549 cells were examined by flow cytometry. The invasive ability of the A549 cells was detected by transwell test. RESULTS: The expression levels of HIF-1α, Bcl-2 and VEGF in non-HIF-1α-siRNA transfected A549 cells cultured in intermittent hypoxia environment [blank control group (IHC), empty vector control group (IHE) and negative control group (IHN)] were higher than those in the A549 cells in normoxia group (RA), but the expression levels of Bax and P21 were lower than those in RA group (P<0.05). The siRNA-mediatedHIF-1αgene silencing [intermittent hypoxia silenced group (IHS)] resulted in obvious down-regulation of HIF-1α, Bcl-2 and VEGF, and significant increase in the protein expression of P21 and Bax (P<0.05). The expression level of P53 in intermittent hypoxia groups was significantly higher than that in RA group, and no significant difference of P53 expression in different intermittent hypoxia groups was observed. Compared with normoxia, intermittent hypoxia resulted in significantly enhanced cell viability, decreased apoptosis, and enhanced invasive ability of non-HIF-1α-siRNA transfected A549 cells (P<0.05). The siRNA-mediatedHIF-1αgene silencing resulted in significant cell viability inhibition, elevated apoptotic rate and decreased invasive ability under hypoxic condition (P<0.05). CONCLUSION: Intermittent hypoxia promotes the viability and invasion of A549 cells by HIF-1α-mediated downstream gene expression.HIF-1αgene silencing inhibits A549 cell growth and invasion under intermittent hypoxia by inhibition of HIF-1α signal pathwaysinvitro.

Intermittent hypoxia; Hypoxia-inducible factor 1α; RNA interference; A549 cells

1000- 4718(2016)11- 1958- 08

2016- 07- 21

2016- 10- 26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81300034)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2014A020212677)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(No.A2015029)

R730.23；R734.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.007

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