劉 陽 余海靜 劉 爭

(同濟醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,武漢430030)

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IL-23在變應性鼻炎小鼠模型中的作用及機制的研究①

劉 陽 余海靜②劉 爭

(同濟醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,武漢430030)

目的：探討IL-23在變應性鼻炎小鼠模型中的作用及機制的研究。方法：應用卵清蛋白(OVA)致敏建立小鼠變應性鼻炎模型，給予抗IL-23p19單克隆抗體干預，計量抗原激發(fā)后小鼠搔鼻數(shù)量。應用HE染色方法檢測IL-23對小鼠鼻黏膜炎癥影響，應用ELISA法檢測小鼠灌洗液中IL-4、IFN-γ及IL-17A含量。應用PCR方法檢測鼻黏膜中FOXP3的含量。結(jié)果：治療后抗IL-23p19抗體組小鼠搔鼻癥狀相對于抗體對照組明顯減輕(P<0.05)，與PBS組比較，OVA組小鼠鼻黏膜炎癥細胞浸潤明顯(P<0.01)，鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)明顯升高(P<0.05)；抗IL-23p19抗體治療后，小鼠鼻黏膜炎癥細胞浸潤顯著降低(P<0.05)，鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)明顯降低(P<0.05)；抗IL-23p19抗體治療后，IL-4及IL-17A含量較IgG抗體對照組降低(P<0.05)，IFN-γ含量不變(P>0.05)?？笽L-23p19抗體治療后，F(xiàn)OXP3含量較IgG抗體對照組增高(P<0.05)。結(jié)論：抗IL-23p19抗體可有效治療小鼠變應性鼻炎，其機制可能是抑制Th17細胞的增殖并且促進調(diào)節(jié)性T細胞的功能。

IL-23；變應性鼻炎；IL-17A

變應性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是上呼吸道Ⅱ型超敏反應引起的一種疾病，患者以打噴嚏，流清涕，鼻塞及鼻癢為主要癥狀，嚴重影響著患者的生活質(zhì)量[1]。臨床上，變應性鼻炎患者以鼻噴激素和鼻噴抗阻胺藥物以及口服抗阻胺藥物治療為主，針對某些特異過敏原患者，可以嘗試使用脫敏療法，但每個患者療效不一[2]。因此，研發(fā)有效的新的臨床藥物成為耳鼻咽喉科臨床工作者的重要目標。IL-23是一個擁有異二聚體結(jié)構(gòu)的造血細胞因子，由p40和p19兩個亞基組成，結(jié)構(gòu)上與IL-12共享p40亞基，它具有促進Th17輔助淋巴細胞增殖的作用[3,4]。研究表明IL-23在哮喘、皮炎及其他免疫性疾病中扮演十分重要的作用[5-7]，但其在變應性鼻炎中鮮有研究，其機制也不十分清楚。我們前期研究顯示IL-23在變應性鼻炎患者鼻黏膜局部是增加的，并且和患者鼻黏膜局部炎性細胞正相關(guān)[8]。鑒于此，本研究旨在研究體內(nèi)IL-23在變應性鼻炎中的作用及機制，為變應性鼻炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J雌性小鼠32只，購自華中科技大學動物中心，隨機分成4組，每組8只。OVA購于Sigma-Aldrich，抗IL-23p19單克隆抗體以及對照IgG單克隆抗體分別購于eBioscience 和BD Bioscience。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 模型建立及給予抗體參照文獻[9-11]。①OVA組：用卵清白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)小鼠，在第0天和第7天，試驗組小鼠經(jīng)右腿股部皮下注射400 μl含有10 μg OVA/1.6 mg氫氧化鋁懸濁液，于第14天經(jīng)鼻腔給予40 μl含有10 μg的OVA溶液，每天鼻腔激發(fā)一次，第19天取材。②PBS組：給予PBS代替致敏以及激發(fā)的OVA。③抗IL-23p19抗體組：于每日OVA激發(fā)前30 min鼻腔給予抗IL-23p19單克隆抗體(5 mg/kg，溶解在40 μl PBS中)，第19天取材。④IgG抗體對照組：將抗IL-23p19單克隆抗體換成對照IgG單克隆抗體，5 mg/kg，溶解在40 μl PBS中。其余處理同前。

1.2.2 標本取材 參照文獻[9],小鼠脫臼處死以后，于氣管內(nèi)注射1 ml生理鹽水。收集細胞計數(shù)，鼻腔灌洗液保存于-20℃冰箱進行后續(xù)試驗。部分小鼠鼻部常規(guī)固定待后續(xù)切片染色。

1.2.3 小鼠臨床癥狀判斷 參照文獻[10],每只小鼠于最后一次激發(fā)后10 min內(nèi)計數(shù)其搔鼻次數(shù)。

1.2.4 鼻腔灌洗液滴片 參考文獻[9]，細胞滴片常規(guī)HE染色，計數(shù)每毫升灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)。嗜酸性粒細胞呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿鮮紅色嗜酸性顆粒。細胞核通常有2～3葉，呈眼鏡狀，深紫色。

1.2.5 鼻腔灌洗液ELISA檢測 IL-4、IL-17A及IFN-γ ELISA試劑盒購于武漢博士德公司，操作按說明書的程序進行。

1.2.6 鼻黏膜FOXP3檢測 小鼠鼻黏膜總的RNA常規(guī)抽提和逆轉(zhuǎn)錄。 以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進行熒光定量PCR分析相關(guān)基因的表達。讀取測得預循環(huán)(Threshold cycle,ct) 值， 根據(jù)公式：Δct=ct(目的基因)-ct(內(nèi)參基因)，ΔΔct=Δct(模型組)-Δct(對照組)，計算出2-ΔΔct，以反映出目的基因相對于對照組在模型組的表達水平。 PCR反應以GADPH作為內(nèi)參照， GADPHF ：5-CGGATTTGGCCGTATTGGG-3；GADPH-R ：5-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3,FOXP3F:5′-GA-AAGCGGATACCAAATGA-3′,FOXP3R:5′-CTGTGA-GGACTACCGAGCC-3′。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠搔鼻數(shù)目情況的比較 OVA組小鼠出現(xiàn)明顯鼻癢癥狀，搔鼻次數(shù)顯著多于PBS 組(P<0.01)，而抗IL-23p19抗體處理小鼠搔鼻次數(shù)顯著減少(P<0.01)。見圖1。

2.2 各組小鼠鼻黏膜炎性細胞情況 鼻黏膜組織切片HE染色結(jié)果顯示，OVA組(圖2B)小鼠鼻黏膜中見大量炎性細胞的浸潤，而抗IL-23p19抗體處理后(圖2D)，小鼠鼻黏膜中炎性細胞顯著減少(P<0.05)。

2.3 各組小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細胞情況 細胞滴片HE染色結(jié)果顯示，OVA組(圖3B)小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)目顯著多于PBS組 (圖3A)(P<0.01)，而抗IL-23p19抗體處理后，小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)。

圖1 各組小鼠搔鼻數(shù)目情況的比較Fig.1 Comparison of nasal rubs among different groupsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖2 各組小鼠鼻黏膜中炎性細胞情況比較(×200)Fig.2 Comparison of total inflammatory cells in nasal mucosa among different groups(×200)Note: *.P<0.05；**.P<0.01；A.PBS;B.OVA;C.IgG control;D.Anti-IL-23p19.

圖3 各組小鼠鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)目情況的比較(×200)Fig.3 Comparison of eosinophils in nasal lavage among different groups(×200)Note: ；*.P<0.05；Arrow.Eosinophils；A.PBS；B.OVA；C.IgG control；D.Anti-IL-23p19.

圖4 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-17A及IFN-γ表達量情況的比較Fig.4 Comparison of level of IL-4,IL-17A and IFN-γ in nasal lavage among different groupsNote: ；*.P<0.05；**.P<0.01；N.D.Not detected.

圖5 各組小鼠鼻黏膜中FOXP3表達量情況的比較Fig.5 Comparison of mRNA level of FOXP3 in nasal mucosa among different groupsNote: *.P<0.05.

2.4 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-17A及IFN-γ檢測情況 OVA組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4及IL-17A顯著高于PBS組(P<0.01)，而抗IL-23p19抗體處理使其IL-4及IL-17A顯著減少(P<0.05)。而對IFN-γ沒有任何作用(P>0.05)。見圖4。

2.5 各組小鼠鼻黏膜中FOXP3檢測情況 OVA組小鼠鼻黏膜中FOXP3高于PBS組(P<0.05)，而抗IL-23p19抗體處理使其顯著增加(P<0.05)。見圖5。

3 討論

細胞因子由大量5～20 kD的小分子蛋白組成，包括白介素、趨化因子、腫瘤壞死因子等[12]，變應性鼻炎為一種免疫細胞及免疫分子介導的Ⅱ型超敏反應，大量的細胞因子已經(jīng)被證實在其發(fā)生和發(fā)展中扮演了積極的促進作用[13]。因此，針對變應性鼻炎，開發(fā)細胞因子相關(guān)藥物制劑，應用于臨床會給患者帶來福音。

IL-23是近年來研究比較熱門的一種細胞因子，它主要由樹突狀細胞產(chǎn)生。我們前期研究發(fā)現(xiàn)IL-23在變應性鼻炎患者鼻黏膜局部是增高的，并且和鼻黏膜局部炎性細胞的個數(shù)呈正相關(guān)，表明IL-23可能促進變應性鼻炎的發(fā)生和發(fā)展[8]。本研究中我們擬用變應性鼻炎小鼠模型探討IL-23的體內(nèi)作用，并研究其可能的作用機制。IL-23由p40和p19兩個亞基組成，結(jié)構(gòu)上與IL-12共享p40亞基。因此本實驗中我們采取體內(nèi)給予抗IL-23p19抗體中和的方法來研究其作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，在激發(fā)階段鼻腔給予小鼠抗IL-23p19抗體后，小鼠的搔鼻次數(shù)明顯減少。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)給予抗體治療后，小鼠鼻黏膜局部炎性細胞明顯減少，這表明抗IL-23p19抗體對小鼠變應性鼻炎有明顯治療作用。本研究通過小鼠模型證實了抗IL-23p19抗體具有治療小鼠變應性鼻炎的作用，為變應性鼻炎的臨床研究提供了理論基礎。

鑒于IL-23被證實在越來越多的疾病中扮演了十分重要的作用，大量的研究在探討其在疾病中的作用機制，為其在疾病中的調(diào)控提供理論基礎。研究表明它可以刺激Th17細胞的增殖[14]，但其具體的機制還不十分清楚。我們研究發(fā)現(xiàn)在激發(fā)階段鼻腔給予小鼠抗IL-23p19抗體后，鼻腔灌洗夜中Th2細胞的標志性細胞因子IL-4及Th17細胞標志性因子IL-17的量明顯減少，而Th1細胞的標志性細胞因子INF-γ沒有明顯變化，這與前期哮喘中研究的結(jié)果是一致的，提示抗IL-23p19抗體可能通過直接作用于Th2細胞的極化或其分化，或者是通過間接作用于Th17 細胞來抑制Th2細胞因子的分泌，但這有待進一步研究。

近來有研究顯示IL-23可能通過抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的增殖來發(fā)揮其促炎作用[15]。本研究顯示在激發(fā)階段鼻腔給予小鼠抗IL-23p19抗體后，鼻腔黏膜局部調(diào)節(jié)性T細胞的核轉(zhuǎn)錄因子FOXP3量明顯增加，提示抗IL-23p19抗體可能通過直接作用于調(diào)節(jié)性T細胞來促進變應性鼻炎的發(fā)生和發(fā)展，但這需要在未來進一步研究。當然此實驗有一定的局限性，大量研究表明FOXP3量并不能代表調(diào)節(jié)性T細胞的細胞水平和其抑制功能，因此我們需要對IL-23對調(diào)節(jié)性T細胞的作用在細胞水平進行進一步研究。

總之，抗IL-23p19抗體在變應性鼻炎小鼠中的治療作用是肯定的，但其在疾病中是否是直接通過Th17和調(diào)節(jié)性T細胞起作用，其機制還有待進一步研究。

[1] Kariyawasam HH,Rotiroti G.Allergic rhinitis,chronic rhinosi-nusitis and asthma:unravelling a complex relationship[J].Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg,2013,21(1):79-86.

[2] Hankin CS,Cox L,Bronstone A,etal.Allergy immunotherapy:reduced health care costs in adults and children with allergic rhinitis[J].J Allergy Clin Immunol,2013,131(4):1084-1091.

[3] Oppmann B,Lesley R,Blom B,etal.Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine,IL-23,with biological activities similar as well as distinct from IL-12[J].Immunity,2000(13):715-725.

[4] Lousten J,Boniface K,de Waal Malefyt R.Development and function of Th17 cells in health and disease[J].J Allergy Clin Immunol,2009,123(5):1004-1011.

[5] Peng J,Yang XO,Chang SH,etal.IL-23 signaling enhances Th2 polarization and regulates allergic airway inflammation[J].Cell Res,2010，20(1)：62-71.

[6] Krueger GG,Langley RG,Leonardi C,etal.A human interleukin-12/23 monoclonal antibody for the treatment of psoriasis[J].N Engl J Med,2007,356(6):580-592.

[7] Langrish CL,Chen Y,Blumenschein WM,etal.IL-23 drives a pathogenic T-cell population that induces autoimmune inflammation[J].J Exp Med,2005,201(2):233-240.

[8] 劉 陽,劉 爭,陸 翔,等.白細胞介素23在變應性鼻炎患者鼻黏膜中的表達及意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2010,24(14)：638-640.

[9] Liu Y,Yu HJ,Wang N,etal.Clara cell 10-kDa protein inhibits T(H)17 responses through modulating dendritic cells in the setting of allergic rhinitis[J] .J Allergy Clin Immunol,2013,131(2):387-394.

[10] Kim YH,Yang TY,Park CS,etal.Anti-IL-33 antibody has a therapeutic effect in a murine model of allergic rhinitis[J].Allergy,2012,67(2):183-190.

[11] Hidefumi W,Koichi H,Yuko M,etal.IL-23 and Th17 cells enhance Th2-cell-mediated eosinophilic airway inflammation in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2008,178(10) 1023-1032.

[12] Dinarello CA.Proinflammatory cytokines[J].Chest,2000,118 (2):503-508.

[13] Scadding G.Cytokine profiles in allergic rhinitis[J].Curr Allergy Asthma Rep,2014,14(5):435.

[14] McGeachy MJ,Cua DJ.Th17 cell differentiation:the long and winding road[J].Immunity,2008,28(4):445-453.

[15] Izcue A,Hue S,Buonocore S,etal.Interleukin-23 restrains regulatory T cell activity to drive T cell-dependent colitis[J].Immunity,2008,28(4):559-570.

[收稿2016-02-29 修回2016-03-30]

(編輯 倪 鵬)

Effect of IL-23 in a model of allergic rhinitis and its mechanism

LIU Yang，YU Hai-Jing,LIU Zheng.

Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To explore the effect of IL-23 in the treatment of allergic rhinitis in mice.Methods: A model of allergic rhinitis was established with Ovalbumin(OVA),and then the mice were treated with anti-IL-23p19.The nasal rubs were counted.HE staining was performed and the number of total inflammatory cells and eosinophils was counted in the nasal lavage.The content of IL-4，IFN-γ and IL-17A were measured by ELISA.The amount of FOXP3 in the local mucosa was measured by Real-time PCR method.Results: Compared to IgG control group,after the treatment of anti-IL-23p19,the nasal rubs were decreased (P<0.05).Compared to PBS group,the total inflammatory cells in the nasal mucosa and NLF eosinophils showed significant difference for the OVA group(P<0.01 andP<0.05 respectively),but after the anti-IL-23p19 treatment,they were significantly decreased (P<0.05).IFN-γ was not different among different groups (P>0.05).But after the anti-IL23p19 treatment,the IL-4 and IL-17A production was significantly decreased (P<0.05).Moreover,after the anti-IL23p19 treatment,the amount of local FOXP3 was significantly enhanced (P<0.05).Conclusion: Anti-IL-23p19 treatment has a therapeutic effect on the allergic rhinitis of mice partly by limiting Th17 response and enhancing T regulatory response.

IL-23；Allergic rhinitis；IL-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.018

①本文為國家自然科學基金項目(81300812)。

劉 陽(1979年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事變應性鼻炎方面研究，E-mail：noah_05@sina.com。

及指導教師：劉 爭(1973年-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事鼻部炎癥性疾病的研究，E-mail：zhengliuent@hotmail.com。

R765 .21

A

1000-484X(2016)11-1649-04

②華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染科，武漢430030。