許禮發(fā) 王曉春 王 健 張榮波

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，淮南232001)

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·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

結(jié)核分枝桿菌Esx-1底物蛋白Rv3615c的原核表達(dá)及其免疫功能研究①

許禮發(fā) 王曉春 王 健 張榮波

(安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，淮南232001)

目的：構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌(M.tb)Esx-1底物蛋白Rv3615c的原核表達(dá)質(zhì)粒pET30b-Rv3615c并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)；以全血IFN-γ分析試驗(yàn)(WBIA)檢測rRv3615c蛋白能否被淮南市M.tb感染者T細(xì)胞所識別；在小鼠模型中檢測其免疫原性。方法：以分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體pET30b-Rv3615c并表達(dá)、純化rRv3615c蛋白，以WBIA檢測rRv3615c抗原刺激淮南市M.tb感染者和未感染者外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性IFN-γ水平。此外聯(lián)合佐劑SAS免疫C57BL/6小鼠，評價(jià)其體液免疫應(yīng)答和Th1型應(yīng)答水平。結(jié)果：成功構(gòu)建pET30b-Rv3615c質(zhì)粒，SDS-PAGE和Western blot顯示其正確表達(dá)和純化。rRv3615c蛋白特異性刺激淮南市M.tb感染者淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ濃度顯著高于健康對照者。Rv3615c/SAS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的IgG、IgG1、IgG2a以及Rv3615c1SAS誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的特異性IFN-γ、TNF-α和IL-2，均顯著高于PBS組和SAS組，顯示rRv3615c可誘導(dǎo)趨向于Th1型免疫應(yīng)答。結(jié)論：Rv3615c可被淮南市M.tb感染者T細(xì)胞識別，具有較強(qiáng)的免疫原性，是用于結(jié)核病(TB)預(yù)防和診斷的潛力靶抗原。

Rv3615c；原核表達(dá)；免疫功能；全血IFN-γ分析試驗(yàn)；結(jié)核分枝桿菌

卡介苗(Bacille calmette-Guerin，BCG)作為當(dāng)前全球范圍內(nèi)唯一廣泛應(yīng)用于結(jié)核病(Tuberculosis，TB)預(yù)防的減毒活疫苗，盡管對嬰幼兒TB(尤其是結(jié)核性腦膜炎和粟粒性TB)預(yù)防效果較好，但卻受制于免疫保護(hù)期較短、對成人TB保護(hù)性不夠理想的缺陷[1,2]。因此，篩選具有高度免疫原性的、能夠被活動(dòng)性TB(Active TB,ATB)患者和潛伏感染者(Latent TB infection,LTBI)T細(xì)胞所識別的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)靶抗原，并應(yīng)用于TB臨床診斷和疫苗研制一直是TB研究熱點(diǎn)[3]。靶抗原誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答水平(尤其是抗原特異性IFN-γ水平)被公認(rèn)為與抗TB保護(hù)性密切相關(guān)[4]，而能否誘導(dǎo)效應(yīng)性和記憶性CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的IFN-γ和IFN-γ/IL-2多功能應(yīng)答效應(yīng)，則是評價(jià)候選疫苗免疫原性的重要依據(jù)[5]。

M.tb生長早中期分泌到胞外的一類蛋白質(zhì)稱為分泌性蛋白，具有高度免疫原性和特異性，常作為新型TB診斷和預(yù)防研究的重要靶抗原。對分泌性蛋白研究較深入的是6 kD早期分泌抗原(ESAT-6)和早期濾液蛋白-10(CFP-10)，其編碼基因位于RD1基因區(qū)中；二者均隸屬于Esx-1分泌系統(tǒng)，被公認(rèn)為免疫原性較強(qiáng)的M.tb靶抗原[6]。ESAT-6/CFP-10能誘發(fā)特異性Th1應(yīng)答，與細(xì)菌的毒力密切相關(guān)，可提供抗M.tb感染的保護(hù)性。如ESAT-6參與構(gòu)建融合蛋白亞單位疫苗Hybrid 1(Ag85B-ESAT-6)和H56(Ag85B-ESAT-6-Rv2660c)，在小鼠和靈長類動(dòng)物TB模型中顯示了持久而穩(wěn)定的抗感染保持性，同時(shí)已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)[7,8]。此外CFP-10被認(rèn)為是M.tb感染者T細(xì)胞識別診斷實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，而基于ESAT-6/CFP-10建立的兩種商業(yè)化的檢測技術(shù)T-SPOT和QuantiFERON-Gold已在臨床上廣泛應(yīng)用，其基本原理是通過IFN-γ釋放試驗(yàn)(IFN-γ release assays,IGRAs) 對M.tb感染者進(jìn)行有效診斷，且不受BCG預(yù)防接種的影響[9]。盡管IGRAs可用于各年齡段和高危人群中M.tb感染者的特異性篩查，但因抗原組成成分較少而使其診斷的靈敏性受限。有鑒于此，Esx-1家族蛋白作為研究M.tb感染診斷和防控的靶抗原備受關(guān)注。

Esx-1底物蛋白Rv3615c是含有103個(gè)氨基酸的ESAT-6樣蛋白，分子量與ESAT-6、CFP-10相近(僅為10.1 kD)，其N-末端的20個(gè)氨基酸在ESAT-6家族成員中相對保守，BLAST比對顯示其序列與ESAT-6、CFP-10高度相似[10]。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)研究顯示Rv3615c在低pH值和低鐵條件下轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，提示M.tb體內(nèi)感染時(shí)Rv3615c可在巨噬細(xì)胞的吞噬體內(nèi)活躍表達(dá)[11]。因此，我們假設(shè)Rv3615c可被淮南市M.tb感染者(包括LTBI)T細(xì)胞特異性識別，從而構(gòu)建其原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)以WBIA檢測其特異性刺激淮南市M.tb感染者外周血淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平；然后在小鼠模型中驗(yàn)證其抗原特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)水平，為研究Rv3615c是否可作為候選靶抗原應(yīng)用于TB診斷及疫苗研究提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、動(dòng)物及分組M.tb標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv由安徽省淮南市疾控中心提供，E.coliDH5α、BL21(DE3)菌株和抗His鼠單抗購自北京天根生物公司；Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)、內(nèi)毒素去除試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自Invitrogen公司;人IFN-γ、鼠細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物公司;IgG、IgG1、IgG2a兔抗鼠二抗和SAS佐劑系統(tǒng)購自Sigma公司;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠(購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，分為PBS組、BCG組、SAS組和Rv3615c/SAS組(6只/組)，免疫方式為皮下2點(diǎn)注射，注射劑量如下：PBS組為200 μl/只，BCG組為200 μl/只(含菌1×106CFU)；SAS組為100 μl SAS混合100 μl PBS/只；Rv3615c/SAS組為含40 μg rRv3615c蛋白溶液100 μl混合100 μl SAS/只。注射方式為PBS組和BCG組僅0周注射1次；SAS和Rv3615c/SAS組每3周注射1次，共3次。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 以酚-氯仿法抽提M.tbH37Rv基因組DNA作為模板，根據(jù)Rv3615c全序列酶切位點(diǎn)及原核表達(dá)載體pET30b上的多克隆位點(diǎn)分析設(shè)計(jì)特異性引物(P1: TTCCATATGACGGAAAACTTGACCGTCCAGCCC;P2: ATCTCGAGGGTAAACAA-CCCGTCGATAGCCTT)。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；94℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s，30 cycles；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物克隆入N端標(biāo)記有6-His的pET30b中，將重組質(zhì)粒命名為pET30b-Rv3615c，以NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切和測序鑒定。

1.2.2 原核表達(dá)、蛋白純化和免疫印跡檢測 重組質(zhì)粒pET30b-Rv1789轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中過夜培養(yǎng)(加入終濃度為50μg/ml的卡那霉素)，轉(zhuǎn)搖至150mlLB培養(yǎng)基后加入IPTG(終濃度0.5mmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)并進(jìn)行可溶性鑒定。以Ni-NTA純化體系進(jìn)行蛋白純化，蛋白洗脫液復(fù)性則應(yīng)用1×PBS配制的尿素進(jìn)行4℃過夜梯度透析(尿素濃度分別為8、6、5、4、3、1、0mol/L，pH7.9)。用內(nèi)毒素去除試劑盒檢測并去除內(nèi)毒素(<0.1EU/ml)，BCA試劑盒測定純化蛋白濃度并估算表達(dá)量，以15%SDS-PAGE分析蛋白純度。同時(shí)以鼠抗-His6抗體作一抗、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG作二抗進(jìn)行Westernblot檢測。

1.2.3 受試者分類和WBIA檢測人群外周血抗原特異性IFN-γ濃度 從淮南市疾控中心選擇40名受試者進(jìn)行問卷調(diào)查、病史采集及全身體檢，同時(shí)進(jìn)行TST(結(jié)核菌素試驗(yàn))、痰涂片(或痰培養(yǎng))檢測，并且排除合并免疫異常性疾病及HIV感染。M.tb感染者(包括TB患者和LTBIs)和健康對照者的臨床診斷和篩選標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。無菌收集受試者新鮮抗凝全血，在6h內(nèi)加入無菌24孔板(0.5ml/孔)；每孔加入rRv3615蛋白5μg/孔進(jìn)行刺激，并以同體積PBS和PHA分別為陰、陽對照，震蕩混勻后置37℃溫箱孵育24h，收集血漿，按說明書以人IFN-γ檢測試劑盒檢測各孔IFN-γ濃度并加以比較，各孔最終值為實(shí)際測得值減去PBS刺激的本底值后所得數(shù)值。

1.2.4ELISA檢測小鼠血清中抗原性特異性抗體水平 免疫后9周，將各組小鼠摘除眼球取血收集血清；處死各組小鼠后解剖并分離脾淋巴細(xì)胞。將96孔板以rRv3615c蛋白包被和BSA-PBST封閉后，把每列血清樣本以PBS按1∶200進(jìn)行倍比稀釋，加入HRP標(biāo)記兔抗鼠二抗(IgG、IgG1、IgG2a)并以TMB底物顯色，以酶標(biāo)儀檢測OD值?？贵w滴度以出現(xiàn)陽性結(jié)果的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示，即log10(抗體滴度)。以log10(抗體滴度)計(jì)算各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，以IgG2a和IgG1實(shí)際測得的稀釋倍數(shù)計(jì)算IgG2a∶IgG1。

1.2.5ELISA檢測脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗原特異性IFN-γ、TNF-α、IL-2水平 24孔板中每孔加入2.5×106/個(gè)脾淋巴細(xì)胞，陰性對照、陽性對照和實(shí)驗(yàn)組刺激物分別為RPMI1640培養(yǎng)基、PPD(10μg/孔)和rRv3615c重組蛋白(10μg/孔)，37℃培養(yǎng)72h，離心后收集細(xì)胞上清。按小鼠ELISA檢測試劑盒說明書檢測相應(yīng)細(xì)胞因子水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間比較采用非參數(shù)U檢驗(yàn)，以SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1rRv3615c原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)純化和免疫印跡分析 編碼Rv3615基因序列大小為312bp，插入pET30b(+)后構(gòu)建重組質(zhì)粒成功，NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切及測序鑒定無誤，見圖1A、B。rRv3615c蛋白經(jīng)鑒定為包涵體形式表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA柱以變性條件純化，SDS-PAGE顯示其分子量大小為12.5kD，與預(yù)期符合；以鼠抗-His6抗體作一抗Westernblot鑒定證明rRv3615c蛋白成功表達(dá)(見圖1D)。收集所有洗脫液中的重組蛋白經(jīng)內(nèi)毒素去劑盒檢測并去除內(nèi)毒素(<0.1EU/ml)，BCA試劑盒測定蛋白濃度為0.75mg/ml，蛋白總表達(dá)量為4.5mg。重組蛋白純度測定在Bio-Rad凝膠成像儀上拍攝電泳圖，采用ImageLabTM軟件進(jìn)行圖像分析，rRv3615蛋白純度為94.5%。

圖1 Rv3615c重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及鑒定Fig.1 Construction,expression,purification and identifi-cation of recombinant prokaryotic expression plasmid pET30b-Rv3615c

表1 受試人群的特征

Tab.1 Characteristics of human subjects

GroupsMtbinfectionsActivepulmonaryTBpatients(ATB)LatentTBinfections(LTBIs)HealthycontrolsClinicaldiagnosisclinicalsymptomofpulmonaryTB，positiveacid?fastbacilliinsputumsmearsofculturing，suggestivechestX?ray，TST≥5mmcloseTBcontacts，noclinicalsymptomnorabnormalchestradiograph，TST≥5mmnopriorMtbcontactorexposure，TST<5mmNoofsubjects141610Meanage283398361Male/Female8/610/65/5

圖2 rRv3615c和PHA刺激活動(dòng)性TB患者、潛伏感染者和健康對照者全血IFN-γ水平Fig.2 Whole blood IFN-γ profiles in response to rRv3615c and PHA in ATB,LTBIs and healthy controls

圖3 各組小鼠rRv3615c特異性小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a抗體水平(n=3)Fig.3 rRv3615-specific IgG,IgG1 and IgG2a antibodies in immunized mice(n=3)

圖4 不同免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性分泌IFN-γ、IL-2 和TNF-α水平(n=3)Fig.4 Levels of IFN-γ,IL-2 and TNF-α secreted by splenic lymphocytes of differently immunized mice (n=3)

2.2 Rv3615c誘導(dǎo)ATB、LTBI和健康對照者特異性IFN-γ水平比較 由淮南市疾控中心篩選出符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的ATB患者14例，LTBI受試者16例，健康對照者10例(如表1所示)。由圖2A可見rRv3615c蛋白刺激M.tb感染者外周血中淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平均顯著高于健康者(P<0.05)，同時(shí)誘導(dǎo)ATB人群外周血中淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平顯著高于LTBI人群(P<0.001)。由圖2B可見PHA刺激M.tb感染者和健康對照者外周血中淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.001)。

2.3 Rv3615c/SAS免疫小鼠誘導(dǎo)高水平的特異性IgG抗體 如圖3所示，免疫后9周SAS組無顯著特異性IgG抗體及其亞類產(chǎn)生；Rv3615c/SAS組誘導(dǎo)產(chǎn)生最高水平的抗體滴度，IgG2a/IgG1>1且為各組最高(5.33±2.31)，顯示傾向于Th1型免疫應(yīng)答。

2.4 Rv3615c/SAS免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌高水平特異性Th1型細(xì)胞因子 不同免疫組小鼠經(jīng)PPD和rRv3615c蛋白刺激后，如圖4所示，無論是PPD或rRv3615c蛋白刺激，PBS組均分泌最低水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α。PPD刺激時(shí)，BCG組均分泌最高水平的3種細(xì)胞因子；rRv3615c蛋白刺激時(shí)，則Rv3615c/SAS組相應(yīng)細(xì)胞因子分泌水平最高。

3 討論

BCG與M.tb標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv進(jìn)行基因組雜交比較后發(fā)現(xiàn)，BCG在進(jìn)化過程中缺失129個(gè)開放讀碼框，即RD(Regions of deletion,RD)區(qū)，包括RD1-16，在M.tb有毒株中均存在[12]。RD1基因區(qū)(Rv3871-Rv3879c)包括ESAT-6和CFP-10，是M.tb重要的毒力因子，其中Rv3871、Rv3877是ESAT-6/CFP-10分泌所必需的，其突變株在表型上與RD-1區(qū)缺失菌株相似，對巨噬細(xì)胞的毒力減弱，在感染巨噬細(xì)胞的過程中引發(fā)較弱的免疫應(yīng)答[13]。有研究發(fā)現(xiàn)除RD-1區(qū)外，Rv3614c～Rv3616c區(qū)域基因共同形成一個(gè)操縱子，是Esx-1型分泌系統(tǒng)必不可少的組成部分；該區(qū)域內(nèi)任何一個(gè)基因表達(dá)受阻均會(huì)導(dǎo)致菌株對實(shí)驗(yàn)小鼠的肺、脾臟的毒力減弱[14]。采用酵母雙雜交技術(shù)分析Rv3615c表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)它們自身間相互作用密切。在本研究中我們選擇了Rv3615c，構(gòu)建其原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中成功表達(dá)，相關(guān)研究有助于闡明TB的發(fā)生、發(fā)展及分子基礎(chǔ)，為篩選抗TB基因藥物的作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。 Rv3615c可能是免疫原性較強(qiáng)的靶抗原，在M.tb感染者尤其是BCG已初免者的診斷具有重要意義。Kerry等以Rv3615c肽刺激ATB和LTBI的PBMC，進(jìn)行ELISPOT檢測IFN-γ反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)頻率較高，與ESAT-6/CFP-10特異性反應(yīng)頻率相比甚至更敏感，提示Rv3615c包含多重和廣泛的T細(xì)胞表位，是誘導(dǎo)ATB和LTBI產(chǎn)生Th1型應(yīng)答的重要靶抗原[15]。Sidders等[16]研究發(fā)現(xiàn)感染牛分枝桿菌的小鼠盡管無法識別ESAT-6-CFP-10多肽，卻可部分被Rv3615c誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的IFN-γ細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而有效提高了診斷的敏感度。同樣推測Rv3615c作為Esx-1底物蛋白也可用于人類的TB診斷，與ESAT-6/CFP-10作用類似[17]。我們此次構(gòu)建、表達(dá)純化的rRv3615c蛋白可特異刺激淮南市ATB和LTBI受試者產(chǎn)生顯著高于健康者的IFN-γ水平，同時(shí)誘導(dǎo)ATB特異性IFN-γ水平顯著高于LTBI受試者，驗(yàn)證了以WBIA技術(shù)篩選M.tbT細(xì)胞抗原的合理性，也提示了Rv3615c是可被淮南市M.tb感染人群T細(xì)胞所識別的特異性抗原。 有研究認(rèn)為能同時(shí)分泌IFN-γ和IL-2的抗原特異性T細(xì)胞，對于疫苗設(shè)計(jì)和評估其效果至關(guān)重要[18]。如ESAT-6可刺激小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的IFN-γ和IFN-γ/IL-2應(yīng)答并由此獲得保護(hù)性，而Ag85A重組腺病毒可誘導(dǎo)肺部產(chǎn)生多功能T細(xì)胞并與保護(hù)性相關(guān)[19]。ESAT-6、CFP-10、Ag85B和TB10.4的相關(guān)研究均顯示，候選疫苗靶抗原必須能在自然感染時(shí)被單獨(dú)分泌IFN-γ和同時(shí)分泌IFN-γ/IL-2的多功能T細(xì)胞所識別[20,21]。有研究發(fā)現(xiàn)Rv3615c刺激ATB時(shí)單獨(dú)分泌IFN-γ和共分泌IFN-γ/IL-2的多功能T細(xì)胞均可產(chǎn)生，而刺激經(jīng)治療的ATB和LTBI時(shí)以共分泌IFN-γ/IL-2的CD4+T細(xì)胞為主[15]。本研究中，PPD刺激BCG組小鼠脾淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α和IL-2顯著高于其他組，體現(xiàn)出CD4+Th1型應(yīng)答對BCG免疫保護(hù)性的重要作用；同時(shí)rRv3615c蛋白亦可刺激Rv3615c/SAS組分泌顯著高于PBS和佐劑組的特異性Th1型細(xì)胞因子，提示rRv3615c蛋白的保護(hù)性可能亦來自于有效誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答的潛在能力。此外，由于IFN-γ能夠刺激機(jī)體表達(dá)IgG2a亞類抗體并抑制IgG1型抗體的產(chǎn)生[22]，而Rv3615c/SAS組小鼠血清IgG2a∶IgG1比例大于1，亦提示Rv3615c誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)傾向于Th1型免疫應(yīng)答。

綜上所述，本研究證實(shí)了Rv3615c可被淮南M.tb感染人群T細(xì)胞特異性識別，同時(shí)具有較好的免疫原性，既可用于作為M.tb感染人群(尤其是LTBIs)輔助診斷的候選靶抗原，亦可作為有效的亞組分用于構(gòu)建融合蛋白亞單位疫苗，從而有效提高抗M.tb感染的保護(hù)性。本課題研究為進(jìn)一步評價(jià)該疫苗在不同感染動(dòng)物模型中的保護(hù)性效果奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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[收稿2016-04-05 修回2016-08-26]

(編輯 張曉舟)

Prokaryotic expression and study on immunological function of Rv3615c(Esx-1 substrate protein) of Mycobacterium tuberculosis

XU Li-Fa,WANG Xiao-Chun,WANG Jian，ZHANG Rong-Bo.

Department of Pathogenic Biology and Immunology,Medical College of Anhui University of Science and Technoglgy,Huainan 232001,China

Objective:To construct recombinant prokaryotic expression plasmid pET30b-Rv3615c expressing Esx-1 substrate protein and expressed inE.coliBL21(DE3);to detect whether rRv3615c protein could be recognized by T cells ofM.tbinfections from Huainan using WBIA and to confirm its immunogenicity through mice model. Methods: Prokaryotic expression vector pET30b-Rv3615c was constructed using molecular cloning technology,then rRv3615c protein was expressed and purified.WBIA was performed to detect the specific concentration of IFN-γ stimulated from peripheral-blood lymphocyte of HuainanM.tbinfections and non-infections.Moreover,C57BL/6 mice were immunized by protein rRv3615c combing with adjuvant SAS and responses of humoral immune and Th1-type cell-mediated immune were evaluated.Results: Recombinant plasmid pET30b-Rv3615c was constructed successfully and expressed correctly according to the results of SDS-PAGE and Western blot.The mean level of IFN-γ detected by rRv3615c-WBIA inM.tbinfected donors was much higher than that in healthy donors from Huainan.Meanwhile,Rv3615c/SAS induced higher levels of rRv3615c-specific antibodies(IgG,IgG1，IgG2a)and cytokines(IFN-γ,TNF-α,IL-2)from splenic lymphocyte than that of PBS and SAS，which indicated that Rv3615c/SAS mainly induced the Th1-type cell-mediated immune response.Conclusion: Since Rv3615c could be recognized by T cells ofM.tbinfections from Huainan and also has strong immunogenicity,it may be utilized as a potential candidate antigen in TB prevention and TB diagnosis.

Rv3615c;Prokaryotic expression;Immunological function;Whole-blood IFN-γ release assay;Mycobacteriumtuberculosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.015

①本文受2015度安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2015A093)資助。

許禮發(fā)(1968年-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：ahhnlfxu@126.com。

R378.91+1

A

1000-484X(2016)11-1636-06