于立堅(jiān) 張永平 馬潤(rùn)娣 于廷曦

(佛山德溥生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品研發(fā)部，佛山528231)

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土貝母皂苷抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎效應(yīng)的研究①

于立堅(jiān) 張永平②馬潤(rùn)娣 于廷曦③

(佛山德溥生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品研發(fā)部，佛山528231)

目的：研究土貝母皂苷(Tubeimosides，TBMSs，簡(jiǎn)稱(chēng)皂苷)抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎的效應(yīng)。方法：從土貝母塊莖中提取分離出有效部位土貝母皂苷。實(shí)驗(yàn)所用皂苷的主要成分是土貝母苷甲和苷乙(簡(jiǎn)稱(chēng)苷甲、苷乙)，以及微量土貝母苷丙(簡(jiǎn)稱(chēng)苷丙)，其標(biāo)志性成分苷甲的含量≥90%。采用異體和同體兩種對(duì)照的局部涂皮封閉實(shí)驗(yàn)(Buehler test)，研究皂苷對(duì)對(duì)苯二胺(p-phenylenediamine，PPDA)誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎的效應(yīng)的影響。結(jié)果：異體和同體對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，皂苷提前或與PPDA混合應(yīng)用，均可劑量依賴(lài)性地改善，甚至完全抑制PPDA誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎。一分子的土貝母皂苷能抑制或完全逆轉(zhuǎn)6到12分子對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎。結(jié)論：土貝母皂苷有顯著抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎的活性。

土貝母皂苷；對(duì)苯二胺；接觸性皮炎；豚鼠

對(duì)苯二胺是多種染料的中間體。它既是染發(fā)劑中的有效成分，也是對(duì)人體健康具有潛在危害(包括致敏、致癌和損傷肝腎)的物質(zhì)，暴露到它可引起接觸性過(guò)敏、急性皮炎、面部水腫[1]。流行病學(xué)研究指出，普通人群樣本中5.3 %的個(gè)體在染發(fā)后出現(xiàn)不同程度的皮膚反應(yīng)[2]。

1939年確定對(duì)苯二胺為強(qiáng)過(guò)敏原，并被選入北美、歐洲和T.R.U.E斑貼試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)抗原組。對(duì)苯二胺是一個(gè)眾所周知的染發(fā)劑中引起皮炎的最常見(jiàn)抗原,同時(shí)也被認(rèn)為是測(cè)試染發(fā)劑皮炎的最佳抗原。局部涂皮封閉實(shí)驗(yàn)(Buehler test)是一個(gè)有價(jià)值的、行之有效的篩選過(guò)敏原的實(shí)驗(yàn)程序[3，4]。借之用來(lái)篩選抗過(guò)敏物質(zhì)應(yīng)該是順理成章的事。局部涂皮封閉實(shí)驗(yàn)表明，隨著對(duì)苯二胺濃度的升高，皮膚反應(yīng)程度也增強(qiáng)。對(duì)苯二胺濃度為1 mg/ml時(shí),皮膚反應(yīng)強(qiáng)度較低，2.5 mg/ml時(shí)明顯升高，5～20 mg/ml范圍的反應(yīng)強(qiáng)度基本一致[5]。

近年來(lái)染發(fā)人群暴增,其誘發(fā)的皮炎數(shù)量也顯著增加。盡管對(duì)苯二胺皮炎在臨床上多見(jiàn)，但目前還沒(méi)有可以完全替代它的相對(duì)安全又有效的原料成分，因此尋找、篩選、研發(fā)出既不影響對(duì)苯二胺的染發(fā)效果，又能對(duì)抗對(duì)苯二胺引起接觸性皮炎的原料成分具有重要意義。

土貝母[Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet (Cucurbitaceae)]是一種傳統(tǒng)中藥，載于清代趙學(xué)敏所編《本草綱目拾遺》,藥用部分為其鱗莖。在古代用它來(lái)治療乳巖、乳癰、乳腺增生和瘰疬等各種疾患，臨床上顯示出明顯的散結(jié)毒、消癰腫等效果[6]。土貝母皂苷是從土貝母塊莖中提取分離出的有效部位[7]。我們以前的研究已經(jīng)證實(shí)，苷甲具有抗炎[8]、抗促癌[8,9]和抗腫瘤作用[10-12]，本文則報(bào)告皂苷具有抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Hartley豚鼠，普通級(jí)，體重250～350 g，雌雄各半，購(gòu)自長(zhǎng)沙市開(kāi)福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部，湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(湘)2009-0012，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)：No.HNACSDC20100993和No.HNACSDC20101132。SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(20～24℃,40%～60%飽和濕度)喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)，廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2009-0053。實(shí)驗(yàn)前觀察2周。動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用遵照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年9月30日頒布的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.1.2 試劑 PPDA，AMRESCD產(chǎn)品，純度>98%。40℃水浴加熱溶解，配制成10、20 mg/ml對(duì)苯二胺水溶液。

1.1.3 藥物 以土貝母的干燥塊莖粉劑為原料，用熱水回流提取，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，得到土貝母總皂苷。再用有機(jī)溶劑沉淀、重結(jié)晶，得土貝母皂苷。本實(shí)驗(yàn)所用的土貝母皂苷的主要成分是苷甲和苷乙，以及微量苷丙，其標(biāo)志性成分苷甲的含量≥90%(HPLC檢測(cè)結(jié)果)。以去離子水配制成1、2、5、10、20 mg/ml皂苷水溶液。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)程序 按照國(guó)家藥品注冊(cè)技術(shù)指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定，參考Ritz和Buehler改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法[13,14]，制定標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序。

1.2.2 異體對(duì)照 動(dòng)物分組：取檢疫合格、雌雄各半的豚鼠56只，按照性別體重采用區(qū)段隨機(jī)方法分為溶劑對(duì)照組、皂苷對(duì)照組、PPDA組、皂苷(4個(gè)濃度)+PPDA組共7組，每組8只動(dòng)物。

局部涂皮封閉實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前一天用寵物理發(fā)剪對(duì)豚鼠背部脊柱中線兩側(cè)進(jìn)行脫毛處理。脫毛區(qū)不少于3 cm×3 cm。溶劑對(duì)照組：脫毛區(qū)皮膚涂抹去離子水100 μl；皂苷對(duì)照組：脫毛區(qū)皮膚涂抹20 mg/ml的皂苷水溶液100 μl；PPDA組：脫毛區(qū)皮膚涂抹10 mg/ml PPDA 水溶液100 μl；皂苷+PPDA 組：將不同濃度皂苷(1、5、10、20 mg/ml)的水溶液各100 μl分別涂抹在各組豚鼠背部脫毛區(qū)的皮膚上，30 min后再分別涂抹10 mg/ml PPDA 的水溶液100 μl。在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天，各組分別按上述方式涂抹皮膚一次，每次涂抹之后以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布封包固定。24 h 后用溫水清洗皮膚，之后2 h、24 h、48 h觀察并記錄豚鼠局部皮膚反應(yīng)(紅斑、水腫、焦痂、水泡或破潰)，同時(shí)密切觀察動(dòng)物是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身性過(guò)敏反應(yīng)。

1.2.3 同體對(duì)照 動(dòng)物分組：取檢疫合格、雌雄各半的豚鼠48只，按照性別體重采用區(qū)段隨機(jī)方法分為溶劑對(duì)照組、皂苷對(duì)照組、PPDA組、PPDA+皂苷(3個(gè)不同濃度)混合組共6組，每組8只豚鼠。局部涂皮封閉實(shí)驗(yàn)：溶劑對(duì)照組：豚鼠背部脊柱中線兩側(cè)脫毛區(qū)各涂抹蒸餾水100 μl；皂苷對(duì)照組：豚鼠背部脊柱中線左側(cè)脫毛區(qū)涂抹蒸餾水100 μl，右側(cè)涂抹皂苷水溶液(10 mg/ml)100 μl；PPDA組：左側(cè)涂抹蒸餾水100 μl，右側(cè)涂抹PPDA水溶液(10 mg/ml)100 μl；PPDA+皂苷(1 mg/ml)混合組：左側(cè)涂抹PPDA水溶液(10 mg/ml)100 μl；右側(cè)涂抹PPDA(20 mg/ml)50 μl+皂苷(2 mg/ml)50 μl的混合液；PPDA+皂苷(5 mg/ml)混合組：左側(cè)涂抹PPDA水溶液(10 mg/ml)100 μl；右側(cè)涂抹PPDA(20 mg/ml)50 μl+皂苷(10 mg/ml)50 μl的混合液；PPDA+皂苷(10 mg/ml)混合組：左側(cè)涂抹PPDA水溶液(10 mg/ml)100 μl；右側(cè)涂抹PPDA(20 mg/ml)50 μl+皂苷(20 mg/ml)50 μl的混合液。在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天，各組分別按上述方式涂抹皮膚一次，每次涂抹之后以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布封包固定。其余實(shí)驗(yàn)操作及觀察、記錄同上。

1.2.4 皮膚反應(yīng)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 紅斑：0分=無(wú)紅斑；1分=輕度紅斑，勉強(qiáng)可見(jiàn)；2分=中度紅斑，明顯可見(jiàn)；3分=重度紅斑；4分=紫紅色紅斑至輕度焦痂形成。水腫：0分=無(wú)水腫；1分=輕度水腫，勉強(qiáng)可見(jiàn)；2分=中度水腫(邊緣高出周?chē)つw)；3分=重度水腫(皮膚隆起1 mm，輪廓清楚)；4分=嚴(yán)重水腫(皮膚隆起超過(guò)1 mm或有水泡或有破潰)。最高總分為8分，≥2分為反應(yīng)陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)由同一人員操作、觀察、檢查皮膚反應(yīng)并做出評(píng)判。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)所用軟件為SPSS11.0。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差別有非常顯著的意義。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠接觸性皮炎分級(jí) 豚鼠背部脫毛區(qū)的皮膚涂抹PPDA后出現(xiàn)紅斑、水腫等反應(yīng)，按其輕重程度分為0～4級(jí)(圖1)。

2.2 異體對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果 溶劑和皂苷對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)任何豚鼠有皮膚或全身性反應(yīng)，動(dòng)物得分皆為0(圖2A、B)。PPDA組從第3周起少部分豚鼠(2/8)涂抹部位皮膚開(kāi)始出現(xiàn)如紅斑、水腫等陽(yáng)性反應(yīng)，第4周(7/8)、5周(8/8)大部或全部動(dòng)物皮膚出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，嚴(yán)重者出現(xiàn)紫紅色紅斑、重度水腫，乃至起泡、潰爛，皮毛稀疏甚至不長(zhǎng)，第5周皮膚反應(yīng)得3～6分(圖2C)。皂苷(1 mg/ml) +PPDA組的部分動(dòng)物在第3周(2/8)、第4周(4/8)、第5周(4/8)皮膚出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，得2～4分(圖2D)，發(fā)生陽(yáng)性皮膚反應(yīng)的豚鼠數(shù)較PPDA組少，反應(yīng)程度也較輕。皂苷(5 mg/ml)+PPDA組的部分豚鼠在第4周(2/8)、第5周(3/8)皮膚出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，得2～3分(圖2E)，發(fā)生陽(yáng)性皮膚反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)較皂苷(1 mg/ml)+PPDA組少，反應(yīng)程度也較輕。皂苷(10 mg/ml)+PPDA組在第5周僅個(gè)別豚鼠(1/8)出現(xiàn)輕度的紅斑和極輕度的水腫，得2.0分(圖2F)。皂苷(20 mg/ml)+PPDA組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)任何豚鼠有皮膚或全身性反應(yīng)，動(dòng)物得分皆為0(圖2G)。結(jié)果顯示，皂苷的提前應(yīng)用可劑量依賴(lài)性地緩解、改善，甚至完全抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎(表1，圖2)。皂苷本身不僅對(duì)皮膚無(wú)不良影響，而且在一定程度上有使皮膚光滑潤(rùn)澤，促進(jìn)皮毛生長(zhǎng)的作用。

圖1 對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎分級(jí)Fig.1 Grading of p-phenylenediamine-induced contact dermatitis in guinea pigsNote: A.No erythema and edema;B1,B2.Mild erythema and/or edema;C1,C2.Moderate erythema and/or edema;D1,D2.Severe erythema and/or edema;E1,E2.Very severe erythema and/or edema.

2.3 同體對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果 溶劑和皂苷對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)任何豚鼠有皮膚或全身性過(guò)敏反應(yīng)，動(dòng)物得分皆為0。其余各組第5周動(dòng)物皮膚反應(yīng)如下。PPDA組：左側(cè)(涂水)半數(shù)動(dòng)物(4/8)皮膚反應(yīng)陽(yáng)性，動(dòng)物皆得2分，右側(cè)(涂PPDA)絕大部分動(dòng)物(7/8)皮膚反應(yīng)陽(yáng)性，得3～3.5分；可見(jiàn)，PPDA不僅引起直接接觸皮膚的反應(yīng)，還引起鄰近皮膚(未直接接觸)的反應(yīng)。PPDA+皂苷(1 mg/ml)混合組：左右兩側(cè)均有半數(shù)動(dòng)物(4/8)皮膚反應(yīng)陽(yáng)性(得分：左為2.5～3，右為2.0～2.5)；PPDA+皂苷(5 mg/ml)混合組：部分動(dòng)物(左4/8，右3/8)皮膚反應(yīng)陽(yáng)性(得分：左為2.0～2.5，右均為2.0)；PPDA+皂苷(10 mg/ml)混合組：僅個(gè)別動(dòng)物(左1/8，右1/8)皮膚反應(yīng)陽(yáng)性(皆得2分)(表2)。結(jié)果表明，皂苷與對(duì)苯二胺混合后應(yīng)用可劑量依賴(lài)性地緩解、改善，甚至顯著抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎。值得注意的是，皂苷還能抑制相鄰部位同時(shí)應(yīng)用的對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎。

表1 土貝母皂苷對(duì)對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎的抑制效應(yīng)(異體對(duì)照)

Tab.1 Inhibitory effect of tubeimosides on delayed contact hypersensitivity induced by p-phenylenediamine in guinea pigs (heterogeneous contrast)

GroupsAnimalnumbersufferingskinresponses/animalnumbertime(weeks)12345Solventcontrol0/80/80/80/80/8TBMSs(20mg/ml)0/80/80/80/80/8PPDA(10mg/ml)0/80/82/87/88/8PPDA+TBMSs(1mg/ml)0/80/82/84/84/81)PPDA+TBMSs(5mg/ml)0/80/80/82/82)3/82)PPDA+TBMSs(10mg/ml)0/80/80/80/82)1/82)PPDA+TBMSs(20mg/ml)0/80/80/80/82)0/82)

Note：Compared with PPDA group,1)P<0.05，2)P<0.01;Solvent control group vs TBMSs control group,P>0.05；Solvent control group vs PPDA group,P<0.01.

圖2 土貝母皂苷對(duì)對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎的抑制效應(yīng)(異體對(duì)照)Fig.2 Inhibitory effect of tubeimosides on delayed contact hypersensitivity induced by p-phenylenediamine in guinea pigs (heterogeneous contrast)Note: Representative photographs (the fifth week):A.Control;B.TBMSs control (20 mg/ml);C.PPDA (10 mg/ml);D.PPDA+TBMSs (1 mg/ml);E.PPDA+TBMSs (5 mg/ml);F.PPDA+TBMSs (10 mg/ml);G.PPDA+TBMSs (20 mg/ml).

對(duì)苯二胺的結(jié)構(gòu)式如圖3，分子量是108.14。對(duì)苯二胺分子中有苯環(huán)、氨基，因此具有這兩種官能團(tuán)的性質(zhì)。土貝母皂苷主要由土貝母苷甲、苷乙和微量苷丙組成，具有獨(dú)特的五環(huán)三萜類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)，酸水解后釋放出皂苷元貝咢苷元和四種糖：葡萄糖、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖[15,16]。苷甲、苷乙和苷丙為天然結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(圖4)。苷乙與苷甲化學(xué)結(jié)構(gòu)的唯一區(qū)別是：苷乙A(16)位碳連-OH，而苷甲A(16)位碳連-H。苷丙的化學(xué)結(jié)構(gòu)與苷甲的區(qū)別是：苷丙A位碳連-OH，苷甲A位碳連-H；苷丙B位碳連-OH，苷甲B位碳連-O；苷丙C位碳連-CH2O，苷甲C位碳連-H。苷甲、苷乙和苷丙的相對(duì)分子量相當(dāng)接近，分別為1 318、1 334 和1 364，分子式分別為C63H98-O29、C63H98O30和C64H100O31[17]。

表2 土貝母皂苷對(duì)對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎的抑制效應(yīng)(同體對(duì)照)

Tab.2 Inhibitory effect of tubeimosides on delayed contact hypersensitivity induced by p-phenylenediamine in guinea pigs (autogenous contrast)

Note：The experimental result of the fifth week,compared with PPDA group，1)P<0.05，2)P<0.01；Solvent control group vs TBMSs control group,P>0.05；Solvent control group vs PPDA group，P<0.05(left)，P<0.01(right).

本文實(shí)驗(yàn)中所用土貝母皂苷中苷甲含量≥90%，故以苷甲的分子量1 318參與下式的計(jì)算。1 318÷108.14=12.19；計(jì)算結(jié)果提示，土貝母苷甲分子量是對(duì)苯二胺的12.19倍。

本文異體對(duì)照實(shí)驗(yàn)中皂苷(10 mg/ml)+PPDA(10 mg/ml)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅在第5周個(gè)別動(dòng)物(1/8)出現(xiàn)輕度的紅斑和極輕度的水腫?？梢?jiàn)，一分子的土貝母皂苷可抑制或逆轉(zhuǎn)大約12 分子對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)。皂苷(20 mg/ml)+PPDA(10 mg/ml)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)任何豚鼠有皮膚或全身性反應(yīng)?？梢?jiàn)，一分子的土貝母皂苷能完全抑制或逆轉(zhuǎn)6分子對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

圖3 對(duì)苯二胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structure of p-phenylenediamine

圖4 土貝母苷甲、苷乙、苷丙的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structure of tubeimoside Ⅰ，tubeimoside Ⅱ and tubeimoside Ⅲ

綜合起來(lái)可以得出，一分子的土貝母皂苷能抑制甚至完全逆轉(zhuǎn)6到12分子對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

3 討論

對(duì)苯二胺是一種有機(jī)化合物，其分子式為C6H8N2。它本來(lái)是一種白色固體，但空氣氧化能使之變黑。它對(duì)毛發(fā)中的角蛋白有極強(qiáng)的親和力，其氧化過(guò)程就是染發(fā)時(shí)顏色的固著過(guò)程。因此，它是染發(fā)劑的共同成分。

對(duì)苯二胺引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)又名Ⅳ型超敏(變態(tài))反應(yīng)。Ⅳ型超敏反應(yīng)是抗原誘導(dǎo)的一種細(xì)胞性免疫應(yīng)答，包括典型的由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的直接細(xì)胞毒作用。致敏性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致組織與細(xì)胞損傷。此型超敏反應(yīng)發(fā)生較慢，通常在接觸相同抗原后24～72 h出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，因此又稱(chēng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。此型超敏反應(yīng)的發(fā)生與抗體和補(bǔ)體無(wú)關(guān)，而與效應(yīng)T細(xì)胞和吞噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子或細(xì)胞毒性介質(zhì)有關(guān)。臨床常見(jiàn)的有感染性遲發(fā)型超敏反應(yīng)、化學(xué)物質(zhì)(如對(duì)苯二胺)接觸性和移植排斥遲發(fā)型超敏反應(yīng)等。Aeby等[18]研究了對(duì)苯二胺引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。皮膚是對(duì)芳香胺染發(fā)染料的前體(如對(duì)苯二胺)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的靶器官。Aeby 等分析了對(duì)苯二胺的氧化和N-乙烯化衍生物的致敏潛能。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的結(jié)論是：對(duì)苯二胺的N-乙烯化和氧化作用互相競(jìng)爭(zhēng)，而暴露在空氣中的皮膚給對(duì)苯二胺的自身氧化作用提供了條件，正是對(duì)苯二胺的氧化產(chǎn)物提供的危險(xiǎn)信號(hào)，有效地刺激了免疫系統(tǒng)，引起變態(tài)反應(yīng)。

Svalgaard 等[19]研究了對(duì)苯二胺的系統(tǒng)免疫效應(yīng)。對(duì)苯二胺是一種強(qiáng)半抗原，這種半抗原引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)，包括細(xì)胞因子反應(yīng)和T細(xì)胞亞群的局部浸潤(rùn)，結(jié)果導(dǎo)致接觸性皮炎。同體對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，對(duì)苯二胺局部涂抹不僅能引起直接接觸的皮膚的反應(yīng)，還可引起鄰近皮膚(未直接接觸)的反應(yīng)。皂苷與對(duì)苯二胺混合應(yīng)用可劑量依賴(lài)性地緩解、改善，甚至顯著抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎。值得注意的是，皂苷還能抑制相鄰(但未直接接觸)部位同時(shí)應(yīng)用對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠接觸性皮炎。

花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)是二十碳不飽和脂肪酸，經(jīng)環(huán)加氧酶和脂質(zhì)加氧酶途徑代謝，生成各種產(chǎn)物。AA代謝釋放的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致發(fā)熱、疼痛、血管擴(kuò)張、通透性升高及白細(xì)胞滲出等炎癥反應(yīng)。而抗炎藥物如阿司匹林、消炎痛和類(lèi)固醇激素則能抑制花生四烯酸代謝，減輕炎癥反應(yīng)。AA誘發(fā)的鼠耳炎性水腫已經(jīng)被用作篩選脂氧合酶抑制劑的模型[20]。12-O-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)系十四烷酸和佛波醇形成的酯，它能誘發(fā)炎性水腫，并因能激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖或分化的信號(hào)通路而具有促進(jìn)細(xì)胞癌變的作用，是一種活性很高的皮膚黏膜促癌劑[21]。TPA誘發(fā)的鼠耳炎性水腫已經(jīng)被用作檢測(cè)非類(lèi)固醇和類(lèi)固醇制劑抗炎活性的經(jīng)典試驗(yàn)[22]。此外，脂氧合酶抑制劑和脂氧合酶/環(huán)加氧酶雙重抑制劑也抑制TPA誘發(fā)的鼠耳炎性水腫[23]。

我們以前的研究已經(jīng)證實(shí)，土貝母皂苷的標(biāo)志性成分土貝母苷甲對(duì)AA和TPA誘發(fā)的鼠耳炎性水腫具有顯著的抑制作用[8,9]。近期我們的研究又發(fā)現(xiàn)，土貝母皂苷，無(wú)論是在花生四烯酸或12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯之前還是之后應(yīng)用，都能顯著抑制它們誘發(fā)的鼠耳炎性水腫，其效果還表現(xiàn)出明顯的量效依賴(lài)關(guān)系(結(jié)果另文發(fā)表)。土貝母皂苷的抗炎效果可能在土貝母皂苷抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎的過(guò)程中起到一定作用，但絕不是其作用機(jī)制的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。對(duì)于土貝母皂苷抑制對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠接觸性皮炎的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制的闡明，有待于用免疫學(xué)的方法深入研究土貝母皂苷和對(duì)苯二胺對(duì)T淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子，以及巨噬細(xì)胞的影響。

作為半抗原的對(duì)苯二胺誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的機(jī)制學(xué)術(shù)界尚未完全闡明，今次發(fā)現(xiàn)的土貝母皂苷有抑制或逆轉(zhuǎn)對(duì)苯二胺誘發(fā)豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Ⅳ型超敏反應(yīng))顯著效果的實(shí)驗(yàn)事實(shí)，或許能為探究遲發(fā)型超敏反應(yīng)和抗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制提供新的思路。

土貝母皂苷不影響對(duì)苯二胺的染發(fā)效果[24]，現(xiàn)在又發(fā)現(xiàn)它對(duì)對(duì)苯二胺誘發(fā)的豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)具有顯著的抑制作用，之前我們還證實(shí)土貝母皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)兔皮膚無(wú)明顯刺激性，對(duì)豚鼠不引起主動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)(以2,4-二硝基氯苯誘導(dǎo)的接觸性皮炎做陽(yáng)性對(duì)照)[25]，所以土貝母皂苷及其標(biāo)志性成分土貝母苷甲的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景值得期待。

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[24] 于立堅(jiān)，馬潤(rùn)娣，于廷曦.化妝品新原料土貝母總皂苷[P].中國(guó)專(zhuān)利，201510308579.2.

[25] 于立堅(jiān)，馬潤(rùn)娣，于廷曦.化妝品新原料土貝母總皂苷用于消除臭汗癥的用途[P]中國(guó)專(zhuān)利，201510308559.5.

[收稿2016-03-17 修回2016-05-03]

(編輯 倪 鵬)

Studies on inhibitory effect of tubeimosides on delayed contact hypersensitivity induced by p-phenylenediamine in guinea pigs

YU Li-Jian,ZHANG Yong-Ping,MA Run-Di,YU Ting-Xi.

Department of Product Research and Development，F(xiàn)oshan Depu Biomedical Technology Co.,Ltd.,Foshan 528231，China

Objective:To study the inhibitory effect of tubeimosides on the delayed contact hypersensitivity induced by p-phenylenediamine in guinea pigs.Methods: Tubeimosides(TBMSs) was the effective fraction extracted and isolated from the tubers of Bolbostemma paniculatum.The main ingredients of TBMSs used in the experiments were tubeimoside Ⅰ，tubeimoside Ⅱ and a trace of tubeimoside Ⅲ,wherein the content of tubeimoside Ⅰ was equal to or greater than 90%.The closed or occlusive patch tests(Buehler test)of heterogeneous and autogenous contrast on guinea pigs were utilized to this investigation.Results: TBMSs could significantly improve,or even completely suppressed p-phenylenediamine (PPDA)-induced contact dermatitis in guinea pigs in a dose-dependent manner，and that 1 molecule of TBMSs could inhibit or completely reverse the delayed contact hypersensitivity induced by approximately 6 to 12 molecules of PPDA.Conclusion: TBMSs have obvious activity against the delayed contact hypersensitivity induced by PPDA in guinea pigs.

Tubeimosides；p-phenylenediamine；Delayed contact hypersensitivity；Guinea pigs

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.013

①本文受佛山市科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金(2013AA100332)資助。

于立堅(jiān)(1942年-)，男，研究員，主要從事中藥藥理與毒理方面研究，E-mail：yulj2013@163.com。

R392.8

A

1000-484X(2016)11-1626-06

②廣東海洋大學(xué)，海洋藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524025。

③通訊作者，上海交通大學(xué)新華醫(yī)院，上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所，上海200092，E-mail：yutingxi@yahoo.com。