李艷春 趙麗娜 張獻(xiàn)宇 喬紅梅

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒呼吸一科，長(zhǎng)春130021)

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小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)前后細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3、CD4、CD44、CD62L的變化

李艷春 趙麗娜①?gòu)埆I(xiàn)宇②喬紅梅③

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒呼吸一科，長(zhǎng)春130021)

目的：探討體外培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞后,細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3、CD4、CD44、CD62L的變化。方法：用淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，37℃細(xì)胞孵箱中體外培養(yǎng)3 d后，向細(xì)胞中加入流式抗體Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3、CD4、CD44、CD62L的水平。結(jié)果：小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離后直接做流式檢測(cè)，CD3+CD4+細(xì)胞占19.09%,其中98.61%的細(xì)胞為CD44+，68.71%為CD62L+。體外培養(yǎng)后CD3+CD4+細(xì)胞占8.96%,其中71.82%為CD44+,11.27%為CD62L+。哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離后直接做流式檢測(cè)，CD3+CD4+細(xì)胞占20.33%,其中97.72%的細(xì)胞為CD44+,75.74%為CD62L+。體外培養(yǎng)后CD3+CD4+細(xì)胞占7.2%,CD44陽(yáng)性細(xì)胞占58.21%，CD62L陽(yáng)性細(xì)胞僅占2.77%。結(jié)論：小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)后,細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44和CD62L發(fā)生巨大變化,CD62L呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢(shì)，接近消失,CD44也有下調(diào)。

表面標(biāo)記物；小鼠；淋巴細(xì)胞

細(xì)胞表面存在眾多表面標(biāo)記分子，可用以區(qū)分不同類(lèi)型、不同功能的細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物的表達(dá)量來(lái)評(píng)估該種類(lèi)細(xì)胞的數(shù)量變化，是目前較常應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)與臨床中的檢測(cè)技術(shù)。此種檢測(cè)方法多是將包含有該細(xì)胞的組織或血液采集出來(lái)后經(jīng)過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟制成細(xì)胞懸液，然后在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)特定細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的相對(duì)數(shù)量。也有部分實(shí)驗(yàn)是將細(xì)胞從組織或血液中分離出來(lái)，進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予干預(yù)措施后再應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面特異分子以鑒定特定細(xì)胞的數(shù)量變化。但培養(yǎng)基不能完全等同于細(xì)胞生活的體內(nèi)環(huán)境，細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，其表面標(biāo)記物是否會(huì)由于脫離活體微環(huán)境而在表達(dá)上發(fā)生變化呢？本實(shí)驗(yàn)即是帶著這樣的疑問(wèn)體外培養(yǎng)了小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，觀察其表面標(biāo)記物CD3、CD4、CD44、CD62L的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，18～22 g，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；實(shí)驗(yàn)試劑 1640 培養(yǎng)液(HyClone)，胎牛血清(Gibco)，流式抗體Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC、Rat IgG2bκPE、Rat IgG2aκ APC ，溶血素(BD biosciences公司)，淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)，ConA(Sigma)；實(shí)驗(yàn)儀器：菲恰爾 TDL-4A 離心機(jī)，流式細(xì)胞儀(BD 公司)；實(shí)驗(yàn)器具：剪刀、鑷子、磨玻璃板、培養(yǎng)皿、15 ml 試管、200 目濾網(wǎng)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘小鼠模型構(gòu)建 選取 BALB/c 小鼠，于第0、7、14天給予 OVA+乳化氫氧化鋁混合液腹腔注射，每只小鼠注射100 μl。于第21天開(kāi)始，每日給予小鼠2%OVA混懸液霧化吸入1次，每次1 h。

1.2.2 細(xì)胞分離 將小鼠脫臼處死，無(wú)菌取脾臟，用剪刀將脾臟剪成小塊，放置于磨玻璃板間研磨，經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞。一部分淋巴細(xì)胞直接加入流式抗體上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，另一部分淋巴細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液、放入5%CO2、37℃細(xì)胞孵箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 正常小鼠淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)3 d(體外培養(yǎng)液中加入ConA 5 μg/ml)后，離心，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入適量1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，輕輕混勻。用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞(在95%以上)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度在1×107ml-1。同樣，哮喘小鼠淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)3 d(體外培養(yǎng)液中加入OVA 80 μg/ml)，同法培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

1.2.4 流式檢測(cè) 設(shè)空白管、同型對(duì)照管、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)管，每管中加入100 μl細(xì)胞懸液?？瞻坠懿患涌贵w；同型對(duì)照管加 CD3e-PE-CY7、CD4-FITC 和 2 個(gè)同型對(duì)照抗體 Rat IgG2bκPE、Rat IgG2bκPE；實(shí)驗(yàn)檢測(cè)管加 Mouse CD3e PE-CY7、Mouse CD4 FITC、Mouse CD44 PE、Mouse CD62L APC。抗體量按照說(shuō)明書(shū)指示添加。加完抗體后混勻，室溫避光孵育 20 min。向各管中加入 1×溶血素1 ml，輕柔混勻，室溫避光孵育 5～10 min。待紅細(xì)胞完全裂解，離心，2 500 r/min，5 min，棄上清。每管加入1 ml PBS液洗滌2次，離心 2 500 r/min，5 min。每管加入約300 μl PBS 液，混勻細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 上樣后用空白管調(diào)節(jié)電壓等參數(shù)。在 CD3+CD4+的細(xì)胞群上設(shè)門(mén)，分析其中CD44、CD62L標(biāo)記細(xì)胞的比例，結(jié)果用百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 正常小鼠檢測(cè)結(jié)果 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離后直接做流式檢測(cè)，CD3、CD4、CD44、CD62L標(biāo)記清晰,效應(yīng)記憶T細(xì)胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-細(xì)胞占24.14%。CD3+CD4+細(xì)胞占19.09%,其中98.61%的細(xì)胞為CD44+,只有1.39%為陰性;68.71%為CD62L+,31.29%為CD62L陰性，見(jiàn)圖1。小鼠脾臟淋巴細(xì)胞加ConA體外培養(yǎng)3 d后檢測(cè)， CD3、CD4、CD44仍存在，CD62L標(biāo)記大部分消失；CD3+CD4+細(xì)胞占8.96%,其中CD44下調(diào),71.82%為陽(yáng)性,有28.18%為陰性,CD62L下調(diào)更為明顯,只有11.27%為陽(yáng)性，絕大多數(shù)88.73%為陰性，見(jiàn)圖2。

2.2 哮喘小鼠檢測(cè)結(jié)果 哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離后直接做流式檢測(cè)，效應(yīng)記憶T細(xì)胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-細(xì)胞占32.06%。CD3、CD4、CD44、CD62L標(biāo)記清晰,CD3+CD4+細(xì)胞占20.33%,其中97.72%的細(xì)胞為CD44+,只有2.28%為陰性;75.74%為CD62L+,24.26%為CD62L-，見(jiàn)圖3。哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)3 d后檢測(cè)，CD3、CD4、CD44仍存在，CD62L標(biāo)記幾乎完全消失， CD3+CD4+細(xì)胞占7.2%, CD44陰性細(xì)胞占41.79%,58.21%為陽(yáng)性，CD62L陽(yáng)性細(xì)胞僅占2.77%，見(jiàn)圖4。

圖1 正常小鼠脾臟淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3、CD4、CD44、CD62L的檢測(cè)Fig.1 Expression of surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on normal mouse spleen lymphocytes

圖2 正常小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)3 d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖Fig.2 Expression of surface markers on normal mouse spleen lymphocytes after culture in vitro for 3 days

圖3 哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3、CD4、CD44、CD62L的檢測(cè)Fig.3 Expression of surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on asthmatic mouse spleen lymphocytes

圖4 哮喘小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)3 d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖Fig.4 Expression of surface markers on asthmatic mouse spleen lymphocytes after culture in vitro for 3 days

3 討論

細(xì)胞表面標(biāo)志包括眾多表面分子，廣泛應(yīng)用于區(qū)分各類(lèi)細(xì)胞及細(xì)胞亞群，CD分子是研究較多的一類(lèi)細(xì)胞表面標(biāo)志。CD3+CD4+淋巴細(xì)胞即CD4+T淋巴細(xì)胞，是一類(lèi)重要的免疫細(xì)胞，是細(xì)胞免疫的主要應(yīng)答細(xì)胞，已經(jīng)證實(shí)其在感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等多種類(lèi)疾病中發(fā)揮重要作用[1-3]。

CD44是一種糖蛋白，廣泛表達(dá)于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和白細(xì)胞。CD44在細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中具有多種重要生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、黏附、遷移、造血以及淋巴細(xì)胞的活化、歸巢等[4]。CD62L是一個(gè)重要的黏附分子，表達(dá)于靜止初始T細(xì)胞、中心型記憶T細(xì)胞和一些效應(yīng)記憶T細(xì)胞表面，能夠調(diào)控白細(xì)胞向炎癥部位的遷移，調(diào)控淋巴細(xì)胞在血液與淋巴組織之間的循環(huán)[5,6]。在小鼠中，一般以 CD44的表達(dá)來(lái)界定記憶 T 細(xì)胞，即 CD44low為初始 T 細(xì)胞，CD44high為記憶 T 細(xì)胞。再用CD62L來(lái)區(qū)分中心型或是效應(yīng)型記憶 T 細(xì)胞，即 CD62L+為中心型，CD62L-為效應(yīng)型[7，8]。

正常小鼠由于未接觸過(guò)多的抗原刺激，其記憶T細(xì)胞即CD3+CD4+CD44HighCD62L-細(xì)胞的比例低，而哮喘小鼠由于經(jīng)過(guò)抗原OVA的致敏、激發(fā)，機(jī)體產(chǎn)生免疫記憶，效應(yīng)型記憶T細(xì)胞比例較正常小鼠明顯升高。但細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)后，不論是正常小鼠還是哮喘小鼠，其細(xì)胞表面標(biāo)記物均呈明顯下調(diào)趨勢(shì)。分析其原因：①淋巴細(xì)胞脫離活體環(huán)境后，細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生變化，缺乏維持細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的相關(guān)因子；②雖然培養(yǎng)液中也加了相應(yīng)的抗原成分，但缺乏抗原提呈細(xì)胞，淋巴細(xì)胞沒(méi)有抗原的激發(fā)較難產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)、表達(dá)相應(yīng)的表面標(biāo)記物。表面標(biāo)記物改變了的淋巴細(xì)胞也會(huì)改變其相應(yīng)的生物學(xué)功能。Florek等[9]發(fā)現(xiàn)小鼠和人的Treg細(xì)胞冷凍后再融化，其細(xì)胞表面CD62L的表達(dá)會(huì)下降，而且這樣的Treg細(xì)胞在移植物抗宿主疾病中的保護(hù)作用也會(huì)降低。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，淋巴細(xì)胞體外放置或培養(yǎng)后，表面標(biāo)記物會(huì)自然變化，對(duì)于CD44和CD62L來(lái)說(shuō)，即是出現(xiàn)表達(dá)下降，其他表面標(biāo)記物會(huì)發(fā)生怎樣的變化，還需要進(jìn)一步來(lái)研究與證實(shí)。因此，在體外條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并擬行表面標(biāo)記物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需充分考慮到該表面標(biāo)記物可能會(huì)自然下降的因素。

[1] DiPiazza A,Richards KA,Knowlden ZA,etal.The role of CD4 T cell memory in generating protective immunity to novel and potentially pandemic strains of influenza[J].Front Immunol,2016,7:10.

[2] Karin N,Wildbaum G.The role of chemokines in shaping the balance between CD4(+) T cell subsets and Its therapeutic implications in autoimmune and cancer diseases[J].Front Immunol,2015,6:609.

[3] Liu M,Wu W,Sun X,etal.New insights into CD4+T cell abnormalities in systemic sclerosis[J].Cytokine Growth Factor Rev,2016,28:31-36.

[4] Jordan AR,Racine RR,Hennig MJP,etal.The Role of CD44 in Disease Pathophysiology and Targeted Treatment[J].Front Immunol,2015,6:182.

[5] Spadaro M,Caldano M,Marnetto F,etal.Natalizumab treatment reduces L-selectin (CD62L) in CD4+T cells[J].J Neuroinflammation,2015，12:146.

[6] Trinité B,Chan CN,Lee CS,etal.Suppression of foxo1 activity and down-modulation of CD62L (L-Selectin) in HIV-1 infected resting CD4 T cells[J].PLoS One,2014,9(10):e110719.

[7] Myou S,Leff AR,Myo S,etal.Blockade of inflammation and airway hyperresponsiveness in immune-sensitized mice by dominant-negative phosphoinositide 3-kinase-TAT [J].J Exp Med,2003,198(10):1573-1582.

[8] Wherry EJ,Ahmed R.Memory CD8 T-cell differentiation during viral infection [J].J VIROL,2004,78(11):5535-5545.

[9] Florek M,Schneidawind D,Pierini A,etal.Freeze and thaw of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells results in loss of CD62L expression and a reduced capacity to protect against graft-versus-host disease[J].PLoS One,2015,10(12):e0145763.

[收稿2016-06-12 修回2016-06-23]

(編輯 倪 鵬)

Changes of cell surface markers CD3,CD4,CD44,CD62L on mouse spleen lymphocytes after culture in vitro

LI Yan-Chun,ZHAO Li-Na,ZHANG Xian-Yu,QIAO Hong-Mei.

Pediatric Respiratory Department,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To study the changes of cell surface markers CD3,CD4,CD44 and CD62L on mouse spleen lymphocytes after culture in vitro.Methods: Spleen cells were separated from BALB/c mice and asthmatic mice and lymphocytes were isolated by using lymphocyte separation liquid.We cultured lymphocytes with RPMI1640 medium(10% FBS) in cell incubator for 3 days.Then the four cell surface markers were detected by using flow cytometry.Results: In normal mice,19.09% of lymphocytes stained positively for CD3 and CD4,among these cells 98.61% was CD44+T cell and 68.71% was CD62L+T cell before the culture.After culture with ConA for 3 days,CD3+CD4+and CD3+CD4+CD44+T cell population was down regulated to 8.96% and 71.82%,respectively.While CD62L almost disappeared,accounting for 11.27% only.For asthmatic mice,CD3+CD4+T cell accounted for 20.33% in total lymphocytes,among which 97.72% was CD44+and 75.74% was CD62L+before the culture.After culture,CD3+CD4+T cell accounted for 7.2%,among which CD44+only 58.21% and CD62L+only 2.77%.Conclusion: In both normal and asthmatic mice,CD3,CD4,CD44 and CD62L on spleen lymphocytes were down regulated after culture in vitro regardless with or without stimulating factors,especially CD62L,almost disappeared.This should be given full consideration when these markers are detected after cell culture.

Cell surface marker;Mouse;Lymphocyte

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.009

李艷春(1980年-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制與治療新策略方面研究。

R392.12

A

1000-484X(2016)11-1607-03

①吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院甲狀腺外科，長(zhǎng)春130033。

②吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手足外科，長(zhǎng)春130033。

③通訊作者，E-mail：2670132366@qq.com。