王紹輝 劉同祥

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京100081)

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蘇鐵總黃酮對Lewis肺癌模型小鼠的抑制作用及免疫功能的影響①

王紹輝 劉同祥

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京100081)

目的：探討蘇鐵總黃酮對Lewis 肺癌模型小鼠的抑制作用及免疫功能的影響。方法：選取造模成功的荷瘤小鼠84只，隨機分為模型組、空白對照組、蘇鐵總黃酮高、中、低劑量組、順鉑組、聯(lián)合組，每組12 只。分別給藥干預(yù)14 d，于第15天摘眼球法取血，常規(guī)法剝?nèi)∧[瘤組織、肺、脾、胸腺，并分別稱重，計算抑瘤率、肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)；采用ELISA 法檢測血清中IL-2、IL-10的含量。結(jié)果：蘇鐵高、中、低各劑量組、順鉑組和聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量與模型組比較均降低，差異具有顯著意義(P<0.01)，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯增加，且遠遠高于順鉑組與聯(lián)合組。ELISA 法檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，蘇鐵總黃酮高中低各劑量組、順鉑組和聯(lián)合組的IL-2水平明顯升高，而IL-10水平除了蘇鐵總黃酮中劑量組之外的其他各組均明顯升高。結(jié)論：蘇鐵總黃酮可以調(diào)節(jié)免疫細胞因子IL-2、IL-10 的表達水平，抑制Lewis 肺癌模型小鼠腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移并提高其免疫功能。

蘇鐵總黃酮；Lewis 肺癌；肺指數(shù)；脾指數(shù)；胸腺指數(shù)；免疫功能

肺癌是世界上最常見的原發(fā)于肺部的嚴重威脅著人類生命健康和生存質(zhì)量的惡性腫瘤，隨著大氣污染的加重，其發(fā)病率和死亡率已居各種惡性腫瘤的首位，是全球男性癌癥患者相關(guān)死亡的首要原因和女性癌癥患者相關(guān)死亡的第二大原因[1]。近年來，我國的肺癌發(fā)病率和死亡率的上升更為顯著，大約每年超過60萬人死于肺癌，每年因肺癌死亡的人數(shù)多于乳腺癌、前列腺癌和腸癌死亡人數(shù)的總和，青年肺癌發(fā)病率有所上升[2]。蘇鐵(Cycas Revolute)為蘇鐵科蘇鐵屬常綠棕櫚狀木本植物。具有清熱、止血、散瘀的功效，用于痢疾、吐血、便血、胃痛、尿血、月經(jīng)過多、跌打腫痛[3,4]。近幾年來，研究者發(fā)現(xiàn)蘇鐵中的黃酮類化合物含量較高[5,6]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蘇鐵內(nèi)含鐵樹素(Cyasine)及新鐵樹素甲、乙具有抗癌活性，廣泛用于藥品、食品等方面[7]。免疫監(jiān)視作為免疫系統(tǒng)的主要功能之一，其在清除腫瘤細胞方面發(fā)揮著重要作用[8]，為進一步研究和開發(fā)蘇鐵，本實驗擬通過對蘇鐵總黃酮抑制Lewis肺癌模型小鼠的作用進行研究，并觀察其對Lewis肺癌模型小鼠的免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 雙人單面凈化工作臺(100級)(SW-CJ-2FD型)，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生物顯微鏡(UB200i)，購自重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；臺式大容量冷凍離心機(Centrifuge 5804R)，購自德國Eppendorf公司；微孔板檢測系統(tǒng)(FlexStation3)，購自美國分子儀器公司；電熱恒溫水浴鍋(DK-98-1型)，購自天津市泰斯特儀器有限公司；實驗室級超純水器，購自上海canrex分析儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-1AB)，購自天津市泰斯特儀器有限公司；萬分之一電子分析天平(AL104型)，購自德國Mettler Toledo公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海市躍進醫(yī)療器械一廠；解剖顯微鏡。

1.1.2 實驗細胞和動物 Lewis肺癌瘤源細胞由中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院民族藥物物質(zhì)基礎(chǔ)研究所黃火強教授惠贈； SPF級C57BL/6小鼠，共100只，6～7周齡，體重(21±2.1)g，雄性，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，許可證編號：SCXK(京)2014-0004；

1.1.3 實驗藥品及試劑 蘇鐵總黃酮(自制，含量90%)，注射用順鉑(齊魯制藥有限公司，批號：H37021358)；PBS緩沖液、BOUIN氏液(臨用現(xiàn)配)；小鼠IL-2 ELISA試劑盒、小鼠IL-10 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 Lewis肺癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，傳代后，待細胞達到所需量時，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)至所需要濃度，以0.2 ml(約1×106個細胞)接種于C57BL/6J近交系小鼠右腋部背側(cè)皮下，14 d后以頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠，剝離腫瘤組織，制成瘤細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×106個/ml，取上述瘤細胞懸液0.2 ml(含細胞數(shù)1×106個)接種于C57BL/6J小鼠右腋部背側(cè)皮下，以接種后第2～9天于小鼠右腋皮下觸摸到腫瘤結(jié)節(jié)(腫瘤平均直徑達到約5 mm)為建模成功，將動物隨機分組開始給藥。

1.2.2 分組與給藥 選擇腫瘤體積較均勻的84只荷瘤小鼠隨機分成模型組(Model)、蘇鐵總黃酮高劑量組(H)、蘇鐵總黃酮中劑量組(M)、蘇鐵總黃酮低劑量組(L)、順鉑組(S)、聯(lián)合組(順鉑+蘇鐵總黃酮中劑量，C)、空白對照組(Control)，每組12只。模型組和空白對照組小鼠每天灌胃生理鹽水0.4 ml，共14 d；蘇鐵總黃酮組小鼠每天灌胃0.4 ml，共14 d；順鉑組小鼠于第1、3、5天腹腔注射0.4 ml；聯(lián)合組小鼠上午灌胃蘇鐵總黃酮中劑量0.2 ml，于第1、3、5天下午腹腔注射順鉑0.2 ml，共14 d。

1.2.3 觀察指標(biāo)及測定方法

1.2.3.1 一般情況觀察評估 觀察各組小鼠精神狀態(tài)、活動情況、毛發(fā)、飲食、大小便等情況。每日稱體重，記錄體重變化。

1.2.3.2 腫瘤體積變化情況測定 給藥后第7、10、13、16、19天用游標(biāo)卡尺測量小鼠皮下腫瘤的最大長徑(a)和最小短徑(b)，按照公式V=0.52×ab2計算荷瘤小鼠腫瘤體積及各組均值，繪制腫瘤生長曲線。

1.2.3.3 肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及抑瘤率測定 摘眼球取血后，頸椎脫臼法處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，摘取肺臟、脾臟和胸腺，剔除正常黏連組織后稱重，計算抑瘤率：抑瘤率(%)=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%，肺臟指數(shù)=肺臟質(zhì)量/體質(zhì)量，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.3.4 有無轉(zhuǎn)移灶及其轉(zhuǎn)移率測定 眼球采血后，采取脫頸法處死小鼠，將其固定于解剖蠟板上，用眼科剪剖開胸腔至喉以上部位，小心剝離出氣管，用6號針頭插入氣管并于針管處結(jié)扎，防止Bouin液回流，緩慢注入適量Bouin液，待小鼠肺臟充分膨脹后，結(jié)扎針頭下端氣管，抽出針頭，與結(jié)扎上部將氣管剪斷，然后取出氣管和肺臟，放于Bouin液中24 h固定肺組織。第2天可見黃色肺組織，有粉白色隆起為小鼠肺轉(zhuǎn)移灶，在解剖顯微鏡下仔細計數(shù)小鼠肺轉(zhuǎn)移灶。將肺轉(zhuǎn)移灶分為四個等級：Ⅰ級，<0.5 mm；Ⅱ級，≥ 0.5 mm且<1 mm；Ⅲ級，≥ 1 mm且≤ 2 mm；Ⅳ級，>2mm。腫瘤表面轉(zhuǎn)移灶總數(shù)=Ⅰ×1+Ⅱ×2+Ⅲ×3+Ⅳ×4(個)。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制率(%)=(1-實驗組平均肺表面轉(zhuǎn)移瘤數(shù)/對照組平均肺平面轉(zhuǎn)移瘤數(shù))× 100%。

1.2.3.5 小鼠血清中IL-2和IL-10的含量檢測 接種第20天，動物禁食不禁水，停藥24 h后，采用摘眼球法取血，靜置，3 000 r/min離心5～10 min，取上清，分裝待測。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中IL-2和IL-10的含量。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組小鼠的生存狀況明顯好于順鉑組和聯(lián)合組。與模型組比較，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組小鼠精神狀態(tài)佳，食欲正常，體重質(zhì)量浮動不大，毛色黑亮光潤，喜動惡靜；聯(lián)合組小鼠則食欲不振，體重呈逐漸減輕趨勢，減輕幅度不大，毛色沒有光澤，喜靜厭動；順鉑組小鼠生存狀態(tài)極差，食欲欠佳，飲食量少，體重大幅度下降，部分小鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象。

2.2 蘇鐵總黃酮對Lewis肺癌模型小鼠腫瘤生長的影響 與模型組比較，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組小鼠的體質(zhì)量基本呈逐漸上升趨勢，提示給予腫瘤小鼠蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量，可以增強其食欲。順鉑組和聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量逐漸下降，聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量下降幅度小，提示蘇鐵總黃酮在一定程度上可以緩解順鉑對腫瘤小鼠的毒副作用，而順鉑組小鼠體質(zhì)量下降幅度大，提示蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組小鼠的生存質(zhì)量優(yōu)于模型組、順鉑組和聯(lián)合組。見圖1。

與模型組比較，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組，順鉑組和聯(lián)合組小鼠的腫瘤體積均較低，但仍呈逐漸上升趨勢。第16天前，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組小鼠腫瘤體積增長速度基本一致，第16天之后，蘇鐵總黃酮高劑量組和中劑量組小鼠腫瘤體積急劇增長，但仍低于模型組小鼠腫瘤體積的增長速度，提示蘇鐵總黃酮對小鼠Lewis肺癌具有一定的抑制作用；順鉑組和聯(lián)合組小鼠腫瘤體積增長速度緩慢，順鉑組小鼠腫瘤體積增長尤為緩慢，提示順鉑對小鼠Lewis肺癌具有較好的抑制作用。見圖2。

圖1 各給藥組對Lewis肺癌模型小鼠生長的體質(zhì)量變化曲線圖(n=10)Fig.1 Weight change curve of each dose group on growth of model mice with Lewis lung cancer(n=10)

與模型組比較，蘇鐵高、中、低各劑量組、順鉑組和聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量均降低，差異具有極顯著意義(P<0.01)；與順鉑組和聯(lián)合組比較，其他各組有極顯著性差異(P<0.01)；與蘇鐵總黃酮高劑量組比較，蘇鐵總黃酮中劑量組無顯著性差異，其他各組有極顯著性差異(P<0.01)；與蘇鐵總黃酮中劑量組比較，蘇鐵總黃酮高劑量組和總劑量組無顯著性差異，其他各組有極顯著性差異(P<0.01)，各給藥組均表現(xiàn)出一定程度的抑制腫瘤生長的作用，順鉑組的抑瘤率最高，但其體重卻最輕，聯(lián)合組次之，其體重接近模型組腫瘤小鼠的體重，這可能提示蘇鐵總黃酮聯(lián)合順鉑給藥在一定程度上具有保效減毒的作用。見圖3、4。

圖2 各給藥組對Lewis肺癌模型小鼠生長的腫瘤體積變化曲線圖(n=10)Fig.2 Tumor volume change curve of each dose group on growth of model mice with Lewis lung cancer(n=10)

圖3 各給藥組對Lewis肺癌模型小鼠瘤質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of each dose group on tumor mass of model mice with Lewis lung cancerNote: n=10,*.P<0.01，vs model group;△.P<0.01，vs cisplatinum group;#.P<0.01，vs combination group.

表1 各給藥組對Lewis肺癌模型小鼠肺癌轉(zhuǎn)移情況的影響

Tab.1 Effect of each dose group on lung tumor metastases of model mice with Lewis lung cancer

GroupsnTransfernumberTransferrate(%)NumberofmetastaticfociH10660．0013M12758．3310L12541．6714S10440．009C12433．338Model121083．3321

圖4 各給藥組對Lewis肺癌模型小鼠的抑瘤率(n=10)Fig.4 Inhibition rate of each dose group on model mice with Lewis lung cancer(n=10)

2.3 蘇鐵總黃酮對Lewis肺癌模型小鼠肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 順鉑組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均低于模型組、空白對照組、蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組和聯(lián)合組、提示注射用順鉑的毒副作用可能導(dǎo)致Lewis肺癌小鼠的免疫能力進一步降低；蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯增加，但其值仍低于空白對照組小鼠相關(guān)指數(shù)，提示蘇鐵總黃酮在一定程度上可以促進Lewis肺癌小鼠脾臟和胸腺的發(fā)育，增強其免疫能力；聯(lián)合組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均大于模型組，這提示蘇鐵總黃酮聯(lián)合順鉑給藥在一定程度上起到增效減毒的作用。見圖5。

2.4 蘇鐵總黃酮Lewis肺癌模型小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用 與模型組比較，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組、順鉑組和聯(lián)合組小鼠的肺癌轉(zhuǎn)移灶數(shù)及發(fā)生轉(zhuǎn)移例數(shù)均減少，蘇鐵總黃酮低劑量組、順鉑組和聯(lián)合組較蘇鐵總黃酮高劑量組和中劑量組顯示出較強的抗肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。見表1。

圖5 各給藥組對Lewis肺癌模型小鼠肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Fig.5 Effect of each dose group on lung,spleen and thymus index of model mice with Lewis lung cancerNote: n=10,*.P<0.05，**.P<0.01，vs control group;△.P<0.05，△△.P<0.01，vs model group.

圖6 各給藥組對Lewis肺癌模型小鼠血清中IL-2、IL-10含量的影響Fig.6 Effect of each dose group on IL-2，IL-10 contents in serum of model mice with Lewis lung cancerNote: n=10,*.P<0.05，**.P<0.01 vs control group；△△.P<0.01 vs model group.

2.5 蘇鐵總黃酮對Lewis肺癌模型小鼠血清IL-2、IL-10的影響 與模型組比較，蘇鐵總黃酮高中低各劑量組、順鉑組和聯(lián)合組的IL-2水平明顯升高，而IL-10水平除了蘇鐵總黃酮中劑量組之外的其他各組均明顯升高。與空白對照組比較，蘇鐵總黃酮高中低各劑量組、順鉑組和聯(lián)合組的IL-10水平明顯升高，而IL-2水平除了蘇鐵總黃酮高劑量組和聯(lián)合組之外的其他各組均低于空白對照組。見圖6。

3 討論

蘇鐵，又名鐵樹、鳳尾蕉、鳳尾鐵、鳳尾松。蘇鐵有“植物界的大熊貓”之稱[3,4]，性味甘、平、澀，有小毒[9]。傣藥記載其根可用于解毒、收斂、通經(jīng)、健胃、止咳、祛瘀[10]。民間驗方記載其與半邊蓮、白花蛇舌草、紅棗的水煎劑可用于治療多種腫瘤。孫玲玲等[11]研究發(fā)現(xiàn)鐵樹葉提取液對K564和HL-60細胞增殖具有明顯的抑制作用，其抑制作用可能與鐵樹葉中的蘇鐵甙、新蘇鐵甙A、新蘇鐵甙B以及蘇鐵雙黃酮等蘇鐵毒甙類成分有關(guān)[11,12]，這為臨床上用鐵樹葉治療白血病奠定了一定的理論基礎(chǔ)?？追贝涞萚13]的研究結(jié)果表明鐵樹提取物能明顯誘導(dǎo)A549細胞凋亡，其作用機制可能是改變與凋亡相關(guān)基因的表達。迄今為止，有關(guān)蘇鐵抗腫瘤的研究主要集中在體外實驗上，而在體實驗報道較少，本實驗通過建立Lewis肺癌模型小鼠，探討蘇鐵總黃酮對蘇鐵總黃酮對Lewis肺癌模型小鼠的抑制作用及免疫功能的影響。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能有關(guān)，在關(guān)于肺癌的研究中，肺癌患者的免疫功能受到損害，特別是與免疫有關(guān)的Th1/Th2類細胞因子。Th1細胞主要分泌IL-2、IL-15、TNF等因子，主宰機體的細胞免疫，Th2細胞主要分泌IL-10、IL-4、IL-3等因子[14]，主宰機體的體液免疫。其中作為機體免疫調(diào)節(jié)中最重要的細胞因子之一的IL-2能刺激T細胞的生長與分化， 激活自然殺傷細胞、巨噬細胞等，促進CTL的功能，進而殺滅腫瘤細胞。IL-10是一種抑制細胞因子合成的因子，促進Th2分化并抑制Th1分化，而促進腫瘤細胞由Th2向Th1逆轉(zhuǎn)將為腫瘤的免疫治療提供新的途徑[14,15]。

本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，只有蘇鐵總黃酮中劑量組IL-2水平明顯升高，IL-10水平明顯降低，說明蘇鐵總黃酮中劑量組可以促使機體的免疫細胞由Th2向Th1型逆轉(zhuǎn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組的瘤質(zhì)量、肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)均低于模型組，提示蘇鐵總黃酮對腫瘤的生長轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。蘇鐵總黃酮高、中、低各劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯增加，但其值仍低于空白對照組小鼠相關(guān)指數(shù)，提示蘇鐵總黃酮在一定程度上可以促進Lewis肺癌模型小鼠脾臟和胸腺的發(fā)育，增強其免疫能力，聯(lián)合組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均大于模型組，這提示蘇鐵總黃酮聯(lián)合順鉑給藥在一定程度上起到增效減毒的作用。

綜上所述，蘇鐵總黃酮可以抑制Lewis肺癌模型小鼠腫瘤細胞的生長、降低肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及增強其自身的免疫功能，其抗腫瘤的作用機制可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2相關(guān)細胞因子的表達有關(guān)，而蘇鐵總黃酮的抗腫瘤作用機制值得進一步深入研究。

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[收稿2015-11-16 修回2015-12-03]

(編輯 許四平)

Effects of total flavonoids from Cycas Revolute on inhibition and immune function of model mice with Lewis lung cancer

WANG Shao-Hui,LIU Tong-Xiang.

Institute of Chinese Minority Traditional Medicine,Minzu University of China,Beijing 100081,China

Objective:To explore the inhibition effect of total flavonoids from Cycas Revolute on the model mice with Lewis lung cancer,and its impacts on the immune function of tumor-bearing mice.Methods: 84 successful tumor-bearing mice were selected and then randomly divided into seven groups:model group,control group,high-dose group,medium-dose group,low-dose group,cisplatinum group,and combination group,12 mice in each group.Drug intervention for 14 days respectively,on the fifteenth day,pick the eyeball method for blood,use conventional methods to strip tumor tissues,lung,spleen and thymus and weight them,then calculate the inhibition rate,lung index,spleen index and thymus index.Using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the IL-2 and IL-10 leves in serum.Results: Compared with the model group,the tumor weight of the mice from the high-dose group,medium-dose group,low-dose group,cisplatinum group,and combination group were decreased.The difference was highly significant (P<0.01).The spleen index and thymus index of the high-dose group,medium-dose group and low-dose group were significantly increased,and far higher than the cisplatinum group and combination group.The ELISA results showed that compared with the model group,the IL-2 levels of the high-dose group,medium-dose group,low-dose group,cisplatinum group and combination group were significantly increased,and the IL-10 levels were significantly higher than the other groups in addition to the medium-dose group.Conclusion: The total flavonoids from Cycas Revolute may modulate the expression level of the IL-2 and IL-10,inhibit the growth and metastasis of the model mice with Lewis lung cancer and improve the immune function.

Total flavonoids from Cycas Revolute；Lewis lung cancer；Lung index；Spleen index；Thymus index；Immune function

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.007

①本文為中央民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目(GCYS2016110001)。

王紹輝(1990年-)，男，在讀博士，主要從事腫瘤新藥的研究與開發(fā)工作，E-mail: 860848015@qq.com。

及指導(dǎo)教師：劉同祥(1968年-)，男，博士，教授，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事民族藥物資源與民族藥新藥研究開發(fā)工作，E-mail:tongxliu123@hotmail.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)11-1598-05