張婧婧 張 楠 吳 偉 王 鵬 楊景瑞 段巨洪 于海川

(河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院和分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng)453003)

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mTORC1 信號促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的分化成熟①

張婧婧 張 楠②吳 偉③王 鵬③楊景瑞 段巨洪 于海川

(河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院和分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng)453003)

目的：研究mTORC1 信號對前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化成熟的調(diào)控作用。方法：通過向MC3T3-E1轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Raptor，對mTORC1 信號相關(guān)蛋白Raptor進(jìn)行過表達(dá)。向MC3T3-E1轉(zhuǎn)染Raptor siRNA，對mTORC1 信號蛋白Raptor進(jìn)行基因沉默。通過Real-time PCR方法測定Raptor的基因表達(dá)，通過蛋白免疫印跡法測定Raptor蛋白水平，并通過茜素紅染色檢測成骨礦化情況，以測定成骨分化程度。通過Real-time PCR檢測成骨分化指標(biāo)的基因表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，Raptor過表達(dá)組的Raptor mRNA和蛋白水平明顯增加；茜素紅染色結(jié)果顯示Raptor過表達(dá)組染色更深，說明成骨礦化程度更高；熒光定量PCR結(jié)果顯示，Raptor過表達(dá)組的成骨分化標(biāo)記基因以及成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量均高于對照組。與對照組相比，Raptor siRNA組的Raptor mRNA和蛋白水平明顯降低；茜素紅染色結(jié)果顯示Raptor siRNA組染色更淺，說明成骨礦化程度更低；熒光定量PCR結(jié)果顯示，Raptor siRNA組的成骨分化標(biāo)記基因以及成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量均低于對照組。結(jié)論：mTORC1 信號促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化成熟。

mTORC1信號；成骨分化；前成骨細(xì)胞

前成骨細(xì)胞是一種已經(jīng)向成骨細(xì)胞方向進(jìn)行定向的細(xì)胞類型[1]。前成骨細(xì)胞來源于多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞，并且可以在成骨相關(guān)信號的誘導(dǎo)刺激下進(jìn)一步分化為成熟的成骨細(xì)胞[2]。因此，成骨分化的整個過程包括兩個階段，一是間充質(zhì)干細(xì)胞被定向為前成骨細(xì)胞[3]，另一個過程是前成骨細(xì)胞進(jìn)一步向成熟的成骨細(xì)胞分化[4,5]。這兩個分化過程都受到細(xì)胞外信號的緊密調(diào)控[6,7]。

mTOR信號通路是一種進(jìn)化保守的，營養(yǎng)因子敏感性信號通路，并能在一系列細(xì)胞過程中起到重要的調(diào)控作用[8,9]。mTOR為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，并且在細(xì)胞內(nèi)常以mTORC1或mTORC2兩種不同的復(fù)合物形式存在。這兩種復(fù)合物由不同的成分組成，例如mTORC1包含Raptor蛋白，而mTORC2包含Rictor蛋白[9]。當(dāng)收到上游信號激活后，mTORC1和mTORC2控制不同的下游效應(yīng)因子并影響不同的細(xì)胞過程[9,10]。已有基因敲除小鼠實驗證實，mTORC1在小鼠胚胎發(fā)育過程中的主要功能是對軟骨組織的大小進(jìn)行調(diào)控[11]，而mTORC2主要功能在于促進(jìn)骨質(zhì)形成[12]。然而，通過使用mTOR信號抑制劑Rappamycin對mTOR信號進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)mTOR對成骨分化的調(diào)控既有促進(jìn)效應(yīng)也有抑制效應(yīng)[13,14]。因此，mTOR信號在成骨分化過程中所扮演的具體角色至今尚未有定論。

考慮到成骨細(xì)胞分化的過程包含不同的兩個階段，我們推測mTOR信號對成骨分化的不同階段具有不同的效應(yīng)。因此，本研究著重探索mTORC1對前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成熟的成骨細(xì)胞分化過程的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 MC3T3-E1細(xì)胞購自美國細(xì)胞庫ATCC。DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司，美國)，青鏈霉素(碧云天公司，上海)，LB 培養(yǎng)基、RIPA裂解液和PMSF(苯甲基磺酰氟)(上海生工)，pcDNA3.1-Raptor通過基因克隆方法構(gòu)建，TRIzol 總RNA抽提試劑(TaKaRa公司，日本)，Lipofectamie-2000(Invitrogen公司，美國)，二甲基亞砜(DMSO)、氨芐霉素、臺盼藍(lán)染液、HRP標(biāo)記的二抗(Sigma公司，美國)，SYBRGreen PCR Master Mix(TOYOBO公司，日本)，BMP-2 (R&D公司，美國)，Anti-Raptor一抗(Abcam公司，英國)。siRNA由上海吉瑪生物技術(shù)公司定制。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ以及XhoⅠ、T4 DNA連接酶(NEB公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)以及誘導(dǎo)成骨分化 MC3T3-E1采用含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2及相對濕度條件下培養(yǎng)。采用終濃度為100 ng/ml 的BMP-2對MC3T3-E1進(jìn)行為期7 d或14 d的成骨誘導(dǎo)分化。

1.2.2 RNA提取與熒光定量PCR 根據(jù)試劑盒提供的實驗方案使用TRIzol 總RNA抽提試劑進(jìn)行總RNA提取。以總RNA為模板使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶在25 μl體系中對cDNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR Green Ⅰ mix試劑進(jìn)行熒光定量PCR實驗，使用ABI ⅦA7熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。引物序列如表1所示，熒光定量PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個循環(huán)；采用U6為內(nèi)參。數(shù)據(jù)使用Ct值法(2-ΔΔCt)進(jìn)行分析。

1.2.3 pcDNA3.1-Raptor質(zhì)粒的構(gòu)建 以MC3T3-E1基因組DNA為模板，用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：上游序列AAGGATCCATGCATCGGGCAGTG-GACCC,以及下游序列TTCTCGAGTCATCGAGA-CGTGCTGGCGG。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ以及XhoⅠ對質(zhì)粒pcDNA3.1載體和PCR擴(kuò)增條帶分別進(jìn)行雙酶切，回收DNA條帶后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化到DH5-α感受態(tài)細(xì)胞。挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)并抽取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序鑒定。

1.2.4 pcDNA3.1-Raptor以及Raptor siRNA轉(zhuǎn)染實驗 為實現(xiàn)Raptor過表達(dá)，實驗分組分為陰性對照組,BMP-2組，以及Raptor過表達(dá)組。陰性對照組以及BMP-2組均轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體，過表達(dá)組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Raptor質(zhì)粒。為實現(xiàn)Raptor基因沉默，實驗分組分為陰性對照組,BMP-2組，以及Raptor siRNA組。陰性對照組以及BMP-2組均轉(zhuǎn)染非特異性siRNA陰性對照，過表達(dá)組轉(zhuǎn)染Raptor siRNA。質(zhì)粒和siRNA均使用Lipofectamine? 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)基含10%胎牛血清，50 U/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素，轉(zhuǎn)染后，所有細(xì)胞在37℃溫度和5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。

表1 Real-Time PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences for Real-Time PCR

GenePrimersequencesColⅠ5′?GAGCTGGTGTAATGGGTCCT?3′(Upstream)5′?GAGACCCAGGAAGACCTCTG?3′(Downstream)Ocn5′?AAGCAGGAGGGCAATAAGGT?3′(Upstream)5′?TTTGTAGGCGGTCTTCAAGC?3′(Downstream)Bsp5′?CAGGGAGGCAGTGACTCTTC?3′(Upstream)5′?AGTGTGGAAAGTGTGGCGTT?3′(Downstream)GAPDH5′?GACTTCAACAGCAACTCCCAC?3′(Upstream)5′?TCCACCACCCTGTTGCTGTA?3′(Downstream)Runx25′?GACTGTGGTTACCGTCATGGC?3′(Upstream)5′?ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA?3′(Downstream)Osx5′?GGAAAGGAGGCACAAAGAAGC?3′(Upstream)5′?CCCCTTAGGCACTAGGAGC?3′(Downstream)ATF45′?CCTGAACAGCGAAGTGTTGG?3′(Upstream)5′?TGGAGAACCCATGAGGTTTCAA?3′(Downstream)

1.2.5 免疫印跡實驗 將細(xì)胞用RIPA裂解液和PMSF(苯甲基磺酰氟)處理，冰上孵育30 min。4℃，12 000 r/min離心30 min，得上清蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。一抗anti-Raptor采用1∶1 000的比例進(jìn)行使用,anti-GAPDH，HRP標(biāo)記的二抗均以1∶2 000的比例進(jìn)行使用。通過ECL法進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)Raptor的MT3T3-E1細(xì)胞構(gòu)建成功 為了實現(xiàn)Raptor在MC3T3-E1細(xì)胞的過表達(dá)，我們首先構(gòu)建了Raptor的基因表達(dá)質(zhì)粒。通過以MC3T3-E1細(xì)胞的基因組DNA為PCR模板，我們對Raptor的編碼基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。通過對PCR片段和表達(dá)載體pcDNA3.1進(jìn)行限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，通過連接反應(yīng)獲得pcDNA3.1-Raptor表達(dá)質(zhì)粒。通過Liposome 2000介導(dǎo)，該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細(xì)胞中。經(jīng)3 d培養(yǎng)后，通過定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)，檢測到質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中Raptor mRNA及蛋白水平明顯增加，說明Raptor在MC3T3-E1細(xì)胞的過表達(dá)得以實現(xiàn)，見圖1。

2.2 過表達(dá)Raptor促進(jìn)MT3T3-E1細(xì)胞的成骨分化 在pcDNA3.1-Raptor表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，再利用100 ng/ml BMP-2對MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，檢測14 d后的礦化程度。實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Raptor并用BMP-2處理的細(xì)胞，其茜素紅染色顯示著色更深，說明該組細(xì)胞的礦物沉積顯著增加，礦化程度顯著高于pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染+BMP-2處理組(圖2)。

利用定量PCR方法檢測mTORC1信號對成骨細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，同樣的BMP-2處理條件下，pcDNA3.1-Raptor轉(zhuǎn)染組的成骨細(xì)胞特異性標(biāo)記基因的表達(dá)均顯著升高。具體表現(xiàn)為，在BMP-2處理7 d和14 d后，pcDNA3.1-Raptor組的一型膠原蛋白基因ColⅠ，骨鈣素基因Ocn，骨涎蛋白基因Bsp，其mRNA水平都顯著高于pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組(圖3)。因此，我們認(rèn)為，過表達(dá)Raptor蛋白，激活mTORC1信號能極大地促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)記基因的表達(dá)。

圖1 Raptor在MC3T3-E1細(xì)胞的過表達(dá)Fig.1 Overexpression of Raptor in MC3T3-E1Note: *.P<0.001，n=5.

進(jìn)一步探討過表達(dá)Raptor對成骨細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2，Osx以及ATF4基因表達(dá)的影響。定量PCR實驗顯示，在BMP-2處理7 d和14 d的情況下，pcDNA3.1-Raptor組的Runx2、Osx以及ATF4的mRNA水平都顯著高于pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組(圖4)。因此，我們認(rèn)為過表達(dá)Raptor蛋白以激活mTORC1信號能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx以及ATF4的基因表達(dá)。

2.3 MC3T3-E1細(xì)胞的Raptor基因沉默 通過Liposome 2000介導(dǎo)，Raptor siRNA被轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細(xì)胞中。經(jīng)過3 d培養(yǎng)后，通過定量PCR和免疫印跡技術(shù)，我們檢測到質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中Raptor的表達(dá)量顯著降低，說明Raptor在MC3T3-E1細(xì)胞的基因沉默得以實現(xiàn)(圖5)。

2.4 Raptor基因沉默抑制MC3T3-E1的成骨分化 在Raptor基因沉默的基礎(chǔ)上，再利用100 ng/ml BMP-2對MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，檢測14 d后的礦化程度。實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Raptor siRNA并用BMP-2處理的細(xì)胞，其茜素紅染色顯示著色較淺，說明該組細(xì)胞的礦物沉積顯著降低，礦化程度顯著低于BMP-2處理組(圖6)。

圖2 過表達(dá)Raptor促進(jìn)MT3T3-E1細(xì)胞的礦化Fig.2 Overexpression of Raptor promoted mineralizaion of MC3T3-E1

圖3 過表達(dá)Raptor促進(jìn)ColⅠ、Ocn和Bsp基因表達(dá)Fig.3 Overexpression of Raptor promoted gene expression of ColⅠ,Ocn and BspNote: *.P<0.05；**.P<0.01，n=5.

圖4 過表達(dá)Raptor促進(jìn)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx和ATF4的表達(dá)Fig.4 Overexpression of Raptor promoted gene expression of transcription factor Runx2,Osx and ATF4Note: *.P<0.05；**.P<0.01，n=5.

圖5 Raptor在MC3T3-E1的基因沉默F(xiàn)ig.5 Gene silence of Raptor in MC3T3-E1Note: ***.P<0.001，n=5.

進(jìn)一步探討Raptor基因沉默對成骨細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，同樣的BMP-2處理條件下， Raptor siRNA轉(zhuǎn)染組的成骨細(xì)胞特異性標(biāo)記基因的表達(dá)均顯著降低。具體表現(xiàn)為，在BMP-2處理7 d和14 d后， Raptor siRNA組的一型膠原蛋白基因ColⅠ，骨鈣素基因Ocn，骨涎蛋白基因Bsp,其mRNA水平都顯著低于單獨BMP-2處理組(圖7)。因此，我們認(rèn)為，通過Raptor基因沉默，抑制mTORC1信號能顯著抑制成骨細(xì)胞特異性標(biāo)記基因的表達(dá)。

定量PCR實驗顯示，在BMP-2處理7 d和14 d的情況下，Raptor siRNA組的Runx2、Osx以及ATF4的mRNA水平都顯著低于單獨BMP-2處理組(圖8)。因此，我們認(rèn)為通過Raptor基因沉默以抑制 mTORC1信號能顯著抑制成骨細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx以及ATF4的基因表達(dá)。

圖6 Raptor 基因沉默降低MC3T3-E1礦化水平Fig.6 Gene silence of Raptor reduced mineralization of MC3T3-E1

圖7 Raptor基因沉默抑制ColⅠ、Ocn和Bsp基因表達(dá)Fig.7 Gene silence of Raptor reduced gene expression of ColⅠ,Ocn and BspNote: *.P<0.05；**.P<0.01，n=5.

圖8 Raptor基因沉默抑制成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx和ATF4的表達(dá)Fig.8 Gene silence of Raptor reduced gene expression of transcription factor Runx2,Osx and ATF4

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化是骨骼發(fā)育以及骨質(zhì)維持的重要過程。盡管對成骨分化的研究已經(jīng)揭示了部分分子調(diào)控機(jī)理，包括BMPs以及Wnts等重要信號通路的發(fā)現(xiàn)，Runx2等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明等[3,6]，然而，目前對成骨分化的分子調(diào)控過程的了解依然不足。

本實驗探討了mTORC1信號對成骨分化的調(diào)控作用。實驗結(jié)果顯示，通過Raptor過表達(dá)激活mTORC1信號能顯著增加MT3T3-E1細(xì)胞骨礦化程度，并顯著促進(jìn)了成骨分化的特異性標(biāo)記基因ColⅠ、Ocn、Bsp的基因表達(dá)，以及促進(jìn)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osx以及ATF4的基因表達(dá)。說明過表達(dá)Raptor，激活mTORC1信號能顯著促進(jìn)MT3T3-E1細(xì)胞的分化成熟。與此同時，通過Raptor基因沉默以抑制mTORC1信號，顯著降低了MT3T3-E1細(xì)胞骨礦化程度，并顯著抑制了成骨分化的特異性標(biāo)記基因ColⅠ、Ocn、Bsp的基因表達(dá)，以及抑制成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osx以及ATF4的基因表達(dá)。說明通過Raptor基因沉默以抑制mTORC1信號能顯著抑制MT3T3-E1細(xì)胞的分化成熟。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt7B能通過激活mTORC1信號通路進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。另外，Zhan等[15]通過采用雷帕霉素研究發(fā)現(xiàn)mTORC1信號參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的成骨分化。上述文獻(xiàn)報道結(jié)果與本研究結(jié)論類似。說明已有越來越多的證據(jù)支持mTORC1對成骨分化具有促進(jìn)作用的論斷。

骨重建對骨骼的維持和再生起到關(guān)鍵作用[6]。骨重建的失衡則會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨骼疾病。骨質(zhì)疏松的基本原因是破骨吸收過強而成骨不足，最終導(dǎo)致骨質(zhì)丟失，骨量下降，從而形成骨質(zhì)疏松[16,17]。目前對骨質(zhì)疏松治療的主要思路是抑制骨質(zhì)吸收，減少骨質(zhì)流失[18]。而通過促進(jìn)骨質(zhì)合成從而對骨質(zhì)疏松進(jìn)行治療被認(rèn)為是一條新的思路[19,20]。但是對于如何促進(jìn)骨質(zhì)合成，增加骨量目前尚無有效方法。本實驗證實了mTORC1信號能顯著促進(jìn)成骨分化，因而，推測提高mTORC1信號在人體前成骨細(xì)胞中的水平能相應(yīng)地促進(jìn)成骨分化，增加骨質(zhì)的合成。因此， mTORC1信號具有成為骨質(zhì)疏松治療靶點的潛在可能。

綜上所述，本實驗通過在MT3T3-E1細(xì)胞中過表達(dá)和基因沉默mTORC1信號關(guān)鍵蛋白Raptor，激活或抑制mTORC1信號，印證了mTORC1對前成骨細(xì)胞向成熟的成骨細(xì)胞分化的正向調(diào)控作用。本研究揭示了一種新的成骨分化的分子細(xì)胞機(jī)制，并為日后開發(fā)促進(jìn)骨質(zhì)合成的藥物提供了新的思路。

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[收稿2016-03-26 修回2016-06-08]

(編輯 許四平)

mTORC1 signaling promotes osteoblast differentiation of preosteoblast MC3T3-E1

ZHANG Jing-Jing,ZHANG Nan,WU Wei,WANG Peng,YANG Jing-Rui,DUAN Ju-Hong,YU Hai-Chuan.

Collaborative Innovation Center of Henan Province,Institute of Medical Laboratory Science and Molecular Diognostics and Medical Laboratory Technology,Xinxiang 453003,China

Objective:To investigate the regulatory role of mTORC1 signaling on osteoblast differentiation from preosteoblast cell MC3T3-E1.Methods: To overexpress the gene Raptor,which was a critical component of mTORC1 signaling,pcDNA3.1-Raptor was transfected to preosteoblast cell MC3T3-E1.The Raptor overexpression was confirmed by Real-time PCR and Western blot.For the gene silence of Raptor,Raptor siRNA was transfected to preosteoblast cell MC3T3-E1.Alizarin red staining was used to detect the mineralization of MC3T3-E1.Real-time PCR was used to detect the gene expression of osteoblast specific marker genes.Western blot was used to detect the protein level of Raptor.Results: Compared to the control group,the levels of Raptor mRNA and proteins increased significantly in the Raptor overexpression group;the Alizarin red staining results revealed darker staining in the Raptor overexpression group,suggesting higher level of mineralization;the Real-time PCR results showed that the expression of osteoblast differentiation marker genes and osteoblast transcription factors in the Raptor overexpression group was higher than the control group.Compared to the control group,the levels of Raptor siRNA and proteins decreased significantly in the Raptor siRNA group;the Alizarin red staining results revealed lighter staining in the Raptor siRNA group,indicating lower level of mineralization;the real-time PCR results showed that the expression of osteoblast differentiation marker genes and osteoblast transcription factors in the Raptor siRNA group was lower than the control group.Conclusion: mTORC1 signaling promoted the osteoblast differentiation from preosteoblast cell MC3T3-E1.

mTORC1;Osteoblast differentiation;Preosteoblast

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.002

①本文為國家自然科學(xué)基金項目(No.31301135)。

張婧婧(1982年-)，女，碩士，實驗師，主要從事分子免疫方面的研究。

及指導(dǎo)教師：于海川(1979年-)，男，博士，副教授，主要從事造血免疫分化方面的研究，E-mail：15225991758@163.com。

R329.24

A

1000-484X(2016)11-1573-05

②河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng)453003。

③河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453003。