王博遠(yuǎn) 吳 純 何少林 黃 愷 李大主

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢430022)

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·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

TSLPR抗體抑制ApoE敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成①

王博遠(yuǎn) 吳 純 何少林 黃 愷 李大主

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢430022)

目的：探討TSLPR抗體在抑制動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中的作用。方法：8周齡載脂蛋白E-/-小鼠，給予高脂飼養(yǎng) 12周，期間分別周期性尾靜脈注射TSLPR抗體和同型無關(guān)IgG抗體，檢測(cè)各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成時(shí)間，血小板聚集和釋放功能，血小板膜糖蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組相比，TSLPR抗體處理組血栓形成時(shí)間明顯長(zhǎng)，血小板聚集功能和釋放功能明顯低，血小板活化指標(biāo)CD62p、CD63、PAC-1表達(dá)明顯低，靜息指標(biāo)CD42b表達(dá)明顯高。結(jié)論：靜脈注射TSLPR抗體可以明顯抑制血小板聚集功能和釋放功能，降低血小板活化程度，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成。

TSLPR抗體；動(dòng)脈粥樣硬化；動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成；血小板

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是由血脂代謝異常誘發(fā)的動(dòng)脈血管斑塊形成為特征的免疫炎性疾病[1]。動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成是動(dòng)脈粥樣硬化的主要并發(fā)癥，因其導(dǎo)致的急性冠脈綜合征(ACS)已成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者最常見的死因。細(xì)胞因子介導(dǎo)的血小板的活化、聚集在這一過程中發(fā)揮著重要的作用[2,3]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，參與了包括過敏性疾病、腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展[4-9]。目前，靶向TSLP/TSLP受體(TSLPR)信號(hào)通道已成功用于疾病的干預(yù)[10,11]。我們的前期研究表明，血小板表面有TSLPR表達(dá)，ACS患者血小板表面TSLPR表達(dá)明顯增加，TSLP可促進(jìn)血小板活化，提示TSLP/TSLPR可能參與并促進(jìn)ACS患者血小板活化后致血栓形成[12,13]，阻斷TSLP/TSLPR信號(hào)通道是否抑制血小板聚集和血栓形成目前尚無研究。本文探討TSLPR抗體對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 AS易感(ApoE基因敲除C57BL/6)小鼠(ApoE小鼠)和野生型C57BL/6小鼠(WT小鼠)購(gòu)自北京維通利華公司；TSLPR antibody及其同型無關(guān)對(duì)照IgG抗體購(gòu)自R&D公司；FITC-抗CD42b-Ab、PE-抗CD62p Ab、PE-抗CD63 Ab、FITC-PAC-1 Ab及相應(yīng)同型無關(guān)對(duì)照IgG抗體均為eBioscience公司產(chǎn)品；膠原購(gòu)自Chro-Log公司；血小板功能分析儀和流式細(xì)胞分析儀均為BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組和高脂飼養(yǎng) 將8周齡雄性實(shí)驗(yàn)小鼠分為3組；WT對(duì)照組：WT小鼠，普食喂養(yǎng)12周，期間PBS每隔2周靜脈注射1次；TSLPR抗體處理組：ApoE小鼠，用1%膽固醇、30%脂肪的高脂飼料喂養(yǎng)12周[4]，期間TSLPR抗體(80 μg/ml)每隔1周尾靜脈注射1次，每次0.3 ml[11]；IgG對(duì)照組：ApoE小鼠，用同樣高脂飼料喂養(yǎng)12周，期間同型無關(guān)IgG抗體(80 μg/ml)每隔1周尾靜脈注射一次，每次0.3 ml。

1.2.2 動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成模型 用戊巴比妥(100 mg/kg)將小鼠麻醉后固定于解剖顯微鏡下，鈍性分離以暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。將充分浸潤(rùn)有10%氯化鐵的濾紙敷在暴露的頸總動(dòng)脈外膜表面2.5 min，從而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成。利用微型多普勒探針連續(xù)測(cè)定頸動(dòng)脈遠(yuǎn)端動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成前，直到動(dòng)脈血管完全閉塞的血液流量變化，計(jì)錄血管閉塞所需要的時(shí)間[13]。

1.2.3 小鼠血小板制備 小鼠用戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉后，從眶后叢用肝素涂層的玻璃毛細(xì)管將血液收集到含3%ACD(1/9 V/V)的小管中。將血液以1 500 r/min×7 min離心得到富含血小板的血漿(PRP)。再將PRP用PBS以2 000 r/min×5 min洗滌3次得到沉淀血小板，最后將沉淀血小板懸浮于改良的Tyrode-HEPES緩沖液(pH7.4，不含CaCl2)中待用，調(diào)整血小板至終濃度1×1012L-1。

1.2.4 血小板聚集實(shí)驗(yàn) 采用比濁法，測(cè)試前補(bǔ)充CaCl2(終濃度1 mmol/L)，刺激試劑為膠原(終濃度 16 μg/ml)，用血小板功能分析儀(BD公司)測(cè)定血小板聚集率，測(cè)試時(shí)間5 min。

1.2.5 血小板釋放實(shí)驗(yàn) 測(cè)試前各組分別加入魯米那發(fā)光劑(終濃度20 nmol/L)，孵育2 min，補(bǔ)充CaCl2(終濃度1 mmol/L)，刺激試劑為膠原(終濃度 16 μg/ml)，用血小板功能分析儀測(cè)定血小板ATP釋放水平，測(cè)試時(shí)間5 min。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)血小板膜糖蛋白實(shí)驗(yàn) 取各實(shí)驗(yàn)組血小板懸浮液，分別加入FITC-抗CD42b Ab、PE-抗CD62p Ab和PE-抗CD63 Ab、FITC-PAC-1 Ab， 室溫避光反應(yīng)30 min，加2 ml含有1%BSA的pH7.4 PBS稀釋，3 300 r/min離心10 min，重復(fù)3次，即用流式細(xì)胞術(shù)分析，測(cè)定平均熒光強(qiáng)度(MFI)，每份樣本均設(shè)陰性對(duì)照(加相應(yīng)IgG抗體),以消除本底熒光的影響。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成 各實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血血小板濃度無明顯差異(P>0.05)。TSLPR抗體處理組血管閉塞時(shí)間明顯長(zhǎng)于IgG對(duì)照組 (P<0.05)，WT對(duì)照組血管閉塞時(shí)間明顯長(zhǎng)于IgG對(duì)照組(P<0.05)，WT對(duì)照組與TSLPR抗體處理組血管閉塞時(shí)間無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

2.2 各組小鼠血小板聚集功能 TSLPR抗體處理組血小板聚集率明顯低于IgG對(duì)照組和WT對(duì)照組(P<0.05)。WT對(duì)照組和IgG對(duì)照組血小板聚集率無明顯差異 (P>0.05)，見圖2。

2.3 各組小鼠血小板釋放功能 TSLPR抗體處理組血小板ATP釋放水平明顯低于IgG對(duì)照組和WT對(duì)照組(P<0.05)。WT對(duì)照組血小板ATP釋放水平明顯低于IgG對(duì)照組(P<0.05)，見圖3。

圖1 各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成Fig.1 Atherothrombosis in different groupsNote: A.Platelet concentration，there was no significant in different groups (P>0.05)；B.Occlusion time of blood flow，*.P<0.05,vs TSLPR antibody group;#.P<0.05,vs WT control group.

圖2 各組小鼠血小板聚集功能Fig.2 Platelet aggregation function in different groupsNote: A.Aggregation rate of platelet aggregation induced by collagen in different groups.*.P<0.05,vs TSLPR antibody group;B.Representative figure of platelet aggregation rate analysis was shown.

圖3 各組小鼠血小板釋放功能Fig.3 Platelet release function in different groupsNote: *.P<0.05,vs TSLPR antibody group;#.P<0.05,vs WT control group.

圖4 各組小鼠血小板膜糖蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of platelet membrane glycoprotein in different groupsNote: A.The mean fluorescence intensity(MFI) of CD42b,CD62p，CD63 and PAC-1 in platelets,*.P<0.05,vs TSLPR antibody group;#.P<0.05,vs WT control group;B.Representative figures are shown.

2.4 各組小鼠血小板膜糖蛋白表達(dá) TSLPR抗體處理組血小板CD62p 、CD63、PAC-1表達(dá)明顯低于PBS對(duì)照組和WT對(duì)照組(P<0.05)，CD42b表達(dá)明顯高于IgG對(duì)照組和WT對(duì)照組(P<0.05)；WT對(duì)照組血小板CD62p表達(dá)明顯低于IgG對(duì)照組(P<0.05)，CD42b表達(dá)明顯高于PBS對(duì)照組 (P<0.05)，CD63、PAC-1表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，如圖4。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是由血脂代謝異常誘發(fā)的動(dòng)脈血管斑塊形成為特征的免疫炎性疾病[1,3,14]。動(dòng)脈粥樣硬化的主要并發(fā)癥為動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成，其并發(fā)的心血管事件已成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者最常見的死因。急性冠脈綜合征是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式，其發(fā)生的主要原因?yàn)楣跔顒?dòng)脈粥樣硬化斑塊病變處炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，趨化和誘導(dǎo)下游炎癥因子，促使斑塊破裂，斑塊破裂后暴露的膠原蛋白使血小板活化、黏附和聚集，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成，管腔閉塞，從而引發(fā)急性冠脈綜合征等心血管事件。在這一病理過程中血小板的活化、聚集和釋放發(fā)揮著重要的作用，抗血小板治療成為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的基石[2]。然而血小板活化是復(fù)雜的過程，其確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。已知血小板激活途徑包括膠原、血栓素A2(TXA2)、二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶和血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體等方面，但現(xiàn)有抗ADP和環(huán)氧化酶(COX)、GPⅡb/Ⅲa等途徑并不能完全阻斷血小板的活化，說明可能還有其他活化機(jī)制，如細(xì)胞因子的作用[15,16]。

TSLP是一種新型的、與IL-7具有交叉生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，具有重要的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。既往研究發(fā)現(xiàn)TSLP/TSLPR可促進(jìn)Th1和Th17介導(dǎo)的免疫損傷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘黏膜和過敏性皮炎局部都有TSLP/TSLPR過表達(dá)，并在這些疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7-10]。新近的動(dòng)物和臨床研究均表明，TSLP抗體可減輕支氣管哮喘患者的氣道炎性反應(yīng)并改善支氣管狹窄狀況[10,11]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素Ⅱ或ox-LDL的誘導(dǎo)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的TSLP表達(dá)增加，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者AS斑塊局部有TSLPR過表達(dá)，提示TSLP/TSLPR可能在AS中起到重要作用；我們還發(fā)現(xiàn)，人血小板表面有TSLPR表達(dá)，而ACS患者血小板表面TSLPR表達(dá)明顯增加，TSLP可促進(jìn)血小板活化，以上結(jié)果提示TSLP/TSLPR可能參與并促進(jìn)ACS患者血小板活化后造成的血栓形成過程[4-6,12,13]。研究新型抗血小板活化抗體——TSLPR抗體可能為防治AS血栓形成提供更為有效的手段。

本實(shí)驗(yàn)通過在高脂喂養(yǎng)ApoE小鼠過程中周期性靜脈注射TSLPR抗體，檢測(cè)血小板功能和血栓形成，探究TSLPR抗體對(duì)抑制動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的影響。我們的研究表明，TSLPR抗體處理組血栓形成時(shí)間明顯長(zhǎng)于IgG對(duì)照組，TSLPR抗體處理組血小板聚集功能和釋放功能明顯低于IgG對(duì)照組，TSLPR抗體處理組血小板活化指標(biāo)CD62p、CD63、PAC-1表達(dá)明顯低于 IgG對(duì)照組，靜息指標(biāo)CD42b表達(dá)明顯高于IgG對(duì)照組，表明TSLPR抗體可以明顯抑制血小板聚集和釋放功能，降低血小板活化程度，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成。使用TSLPR單克隆抗體抗AS血栓形成，相比于傳統(tǒng)抗血小板藥物(如阿司匹林、氯吡格雷等)，具有半衰期長(zhǎng)，特異性強(qiáng)，安全性高等優(yōu)點(diǎn)。希望本次研究結(jié)果可以為將來TSLPR抗體應(yīng)用于臨床提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2015-11-30 修回2016-01-07]

(編輯 倪 鵬)

TSLPR antibody inhibits platelet function and atherothrombosis in ApoE-/-mice

WANG Bo-Yuan,WU Chun,HE Shao-Lin,HUANG Kai,LI Da-Zhu.

Department of Cardiology,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Objective:To explore the role of TSLPR antibody in the atherothrombosis inhibition.Methods: 8 weeks old ApoE-/-mice were fed with high-cholesterol diet for 12 weeks.During this time,mice in different groups were injected periodically with TSLPR antibody or isotype IgG respectively.The time of atherothrombosis,platelet aggregation function,platelet release function,and the expression of platelet membrane glycoprotein in different groups were detected.Results: Compared with those in the IgG control group,in the TSLPR antibody group the time of atherothrombosis was prolonged,the function of platelet aggregation and release was weakened,the expression of CD62p，CD63，PAC-1 was decreased，the expression of CD42b was increased.Conclusion: TSLPR antibody injection could inhibit atherosclerosis thrombus formation via weakening platelet aggregation and release function and repressing platelet activation.

TSLPR antibody;Atherosclerosis;Atherothrombosis;Platelet

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.001

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(81170258)和湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助。

王博遠(yuǎn)(1986年-)，男，在讀博士，主要從事冠心病發(fā)病機(jī)理及其診斷與治療的研究，E-mail:wby1101@163.com。

及指導(dǎo)教師：李大主(1964年-)，男，博士，教授, 博士生導(dǎo)師,主任醫(yī)師，主要從事冠心病發(fā)病機(jī)理及其診斷與治療的研究，E-mail:lidazhuhp@sohu.com。

R392.11

A

1000-484X(2016)11-1569-04