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(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院口腔科,湖北 武漢 430060;2.武漢大學(xué)口腔醫(yī)院)

·臨床醫(yī)學(xué)·

PTEN基因表達(dá)與腮腺多形性腺瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

劉志明1，張虹2，黃麗1，張周文1，彭友儉1

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院口腔科,湖北 武漢 430060;2.武漢大學(xué)口腔醫(yī)院)

目的分析PTEN基因表達(dá)與腮腺多形性腺瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法選取本院口腔科收治的腮腺多形性腺瘤25例，同時(shí)選取正常腮腺組織20例作為對(duì)照，分別采集腮腺多形性腺瘤患者的腺瘤組織、瘤旁0.5 cm～2 cm組織、舌下腺組織，以及正常對(duì)照的腮腺組織，比較不同組織中PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)差異；比較復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組和正常腮腺組織中PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果腺瘤組織、瘤旁0.5 cm組織、瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織中PTEN mRNA表達(dá)均低于正常腺體組織和舌下腺組織；腺瘤組織(56.0%)和瘤旁0.5 cm組織(64.0%)中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均低于正常腺體組織(100.0%)和舌下腺組織(96.0%)；復(fù)發(fā)組腺瘤組織中PTEN mRNA表達(dá)(0.413±0.052)均低于正常腺體組織(0.947±0.061)和未復(fù)發(fā)組腺瘤組織(0.639±0.058)；復(fù)發(fā)組腺瘤組織中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(27.3%)均低于正常腺體組織(100.0%)和未復(fù)發(fā)組腺瘤組織(71.4%)(P均<0.05)。結(jié)論腮腺多形性腺瘤組織中的PTEN表達(dá)低于正常腮腺和舌下腺組織，復(fù)發(fā)組腺瘤組織中的PTEN表達(dá)低于未復(fù)發(fā)組和正常組。

腮腺多形性腺瘤； PTEN mRNA； PTEN蛋白； 復(fù)發(fā)

腮腺多形性腺瘤作為一種常見(jiàn)上皮病變性良性腫瘤,其具有多種病理形態(tài)[1]，且瘤體成分復(fù)雜，其中包含有上皮組織、皮下粘液和膠質(zhì)[2]，造成其具有較高侵襲性及復(fù)發(fā)性，能夠惡化成為惡性腫瘤[3]。既往研究顯示，腮腺多形性腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤和基因異變具有相關(guān)性，但關(guān)于具體何種基因決定其生長(zhǎng)及惡化[4]，醫(yī)學(xué)界仍處于爭(zhēng)論中。

PTEN作為新發(fā)現(xiàn)一種腫瘤抑制基因，存在于人10號(hào)染色體上，其能夠抑制特異性磷酸酶活性，從而實(shí)現(xiàn)抑癌功效[5]。文獻(xiàn)稱，PTEN參與和影響多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展，并能顯著調(diào)控細(xì)胞凋亡及遷移[6]，故筆者選擇選取本院口腔科收治的25例腮腺多形性腺瘤標(biāo)本作為研究對(duì)象，旨在探討PTEN表達(dá)和腮腺多形性腺瘤生長(zhǎng)及惡化間相關(guān)性?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取本院口腔科收治的腮腺多形性腺瘤25例，其中男性17例，女性8例，年齡29～65歲，平均年齡(42.34±7.85)歲，其中復(fù)發(fā)性腮腺多形性腺瘤11例，其中男性7例，女性4例，年齡32～63歲，平均年齡(41.42±7.43)歲，復(fù)發(fā)時(shí)間2.8～7.2年，平均(4.29±1.45)年；未復(fù)發(fā)腮腺多形性腺瘤14例，其中男性10例，女性4例，年齡30～65歲，平均年齡(42.62±7.32)歲；同時(shí)選取正常腮腺組織20例作為對(duì)照，其中男性14例，女性6例，年齡30～65歲，平均年齡(42.59±7.18)歲。病例組和對(duì)照，復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)組在年齡上無(wú)顯著差異(P>0.05)。

1.2納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 病例納入標(biāo)準(zhǔn)[7](1)經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生讀取病理切片確診的腮腺多形性腺瘤患者。(2)符合醫(yī)學(xué)倫理，并且和研究對(duì)象簽訂了知情同意書(shū)。

對(duì)照納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)選取具有可比性的對(duì)照，并采集腮腺組織。(2)符合醫(yī)學(xué)倫理，并且和研究對(duì)象簽訂了知情同意書(shū)[8]。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)病理標(biāo)本保存不完整的患者。(2)不愿參與研究的研究對(duì)象。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1 PTEN mRNA檢測(cè)方法 兔抗人PTEN多克隆抗體(工作濃度1∶50)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，SP免疫組化試劑盒購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司。釆用Trizol法提取組織總PTEN mRNA。取出-70 ℃冷存下100 mg胰腺多形性腺瘤與正常涎腺組織分別提取其總RNA，滴入1 mL Trizol放有提取組織玻璃勻漿器內(nèi)，并于冰上充分勻漿。后將10 mL漿液體置于DEPC處理后EP管內(nèi)，室溫下靜置5 min。滴入5 mL氯仿，充分混勻，室溫下靜置3 min。4 ℃、4 000 rpm離心5 min。棄上清液，滴入1 mL DEPC水配制75%乙醇，4 ℃、3 200 rpm離心5 min，棄上清液，晾干、滴入20 μL DEPC水，加熱至60 ℃促溶10 min，-25 ℃冷存。波長(zhǎng)260 nm分光測(cè)定mRNA表達(dá)，OD取值1，在光路中，n倍稀釋樣品選擇ddH2O，雙蒸水作為空白對(duì)照，讀出OD260值，稀釋前樣品濃度：RNA=40×OD260值×稀釋倍數(shù)n/1 000，RNA濃度=OD260值×2.4。PCR法檢測(cè)mRNA，反應(yīng)體系：2 μL dNTP Mixture，4 μL MgCl2，0.5 μL RNasin，2 μL 10×buffer，0.75 μL反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL Oligo DT引物，8～20 μL ddH2O。反應(yīng)條件：45 ℃ 60 min，95℃ 5 min，5℃5min。上游引物序列：5′-AGATGGGTCTATGTTGTCCAGG-3′，下游引物序列：5′-GGGTGCAGTAATGACATTGTGG-3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為220 bp。擴(kuò)增體系：1 μL dNTP Mixture，2 μL cDNA，5 μL 10×PCR buffer，上、下游引物各1.25 μL，0.25 μL反轉(zhuǎn)錄酶，35～50 μLddH2O，3.7 μL MgCl2。

反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變5 min，94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃終末延伸5 min，共36個(gè)循環(huán)，5 ℃保溫。2.0%瓊脂糖凝膠電凝，凝膠圖象分析儀檢測(cè)分析PTEN mRNA，bp值和產(chǎn)物電泳條帶數(shù)量。

1.3.2 PTEN蛋白檢測(cè)方法 免疫組織化學(xué)測(cè)定PTEN蛋白，取多形性腺瘤與正常涎腺組織常規(guī)制備石蠟標(biāo)本后切成厚度為3～4 μm切片，后將切片置于多聚賴氨酸處理后玻片上，并對(duì)其行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，放入PBS洗3次，5 min/次，3%H2O2滴入切片玻片上，靜置30 min，PBS洗3次，5 min/次。滴加山羊血清封閉液，于室溫下反應(yīng)20 min，甩去多余液體。滴入50 μL兔抗人PTEN多克隆抗體作為一抗，室溫條件下靜置1h，置于4℃過(guò)夜后，37℃復(fù)溫30 min。PBS洗3次，5 min/次，滴入50 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素作為二抗，室溫靜置30 min，PBS洗3次，5 min/次，DAB顯色5 min，顯微鏡觀察及掌握染色程度，取出自來(lái)水沖洗5 min，蘇木精復(fù)染5 min，鹽酸酒精分化，常規(guī)脫水、透明及封片，置于光鏡下檢查。

1.4觀察指標(biāo)和檢查方法分別采集腮腺多形性腺瘤患者的腺瘤組織、瘤旁0.5 cm組織、瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織、瘤旁2 cm組織、舌下腺組織，以及正常對(duì)照的腮腺組織，比較不同組織中PTEN mRNA、PTEN蛋白的表達(dá)差異；比較復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組和正常腮腺組織中PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)差異。

2 結(jié) 果

2.1正常腺體組織、腮腺多形性腺瘤與舌下腺組織中PTEN mRNA表達(dá)比較腺瘤組織、瘤旁0.5 cm組織、瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織中PTEN mRNA表達(dá)均低于正常腺體組織(P<0.05)；腺瘤組織、瘤旁0.5 cm組織、瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織中PTEN mRNA表達(dá)均低于舌下腺組織(P<0.05)；瘤旁2 cm組織中PTEN mRNA表達(dá)與正常腺體組織和舌下腺組織無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1正常腺體組織、腮腺多形性腺瘤與舌下腺組織中PTENmRNA表達(dá)比較

組別例數(shù)PTENmRNA表達(dá)(相對(duì)密度值)正常腺體組織200．947±0．061腺瘤組織250．556±0．053ab瘤旁0．5cm組織250．598±0．057ab瘤旁1cm組織250．621±0．051ab瘤旁1．5cm組織250．785±0．049ab瘤旁2cm組織250．802±0．055舌下腺組織250．916±0．072

與正常腺體組織比較，a：P<0.05；與舌下腺組織比較b：P<0.05

2.2正常腺體組織、腮腺多形性腺瘤與舌下腺組織中PTEN蛋白表達(dá)比較腺瘤組織(56.0%)和瘤旁0.5 cm組織(64.0%)中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均低于正常腺體組織(100.0%)和舌下腺組織(96.0%)(P<0.05)；瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織、瘤旁2 cm組織中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與正常腺體組織和舌下腺組織無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2正常腺體組織、腮腺多形性腺瘤與舌下腺組織中PTEN蛋白表達(dá)比較

組別例數(shù)陰性陽(yáng)性陽(yáng)性率(%)正常腺體組織20020100．0腺瘤組織25111456．0ab瘤旁0．5cm組織2591664．0ab瘤旁1cm組織2542184．0瘤旁1．5cm組織2532288．0瘤旁2cm組織2512496．0舌下腺組織2512496．0

與正常腺體組織比較，a：P<0.05；與舌下腺組織比較b：P<0.05

圖1 免疫組織化學(xué)測(cè)定PTEN蛋白 A:多形性腺瘤組織；B:瘤旁組織；C:舌下腺組織；D:正常腺體組織

2.3復(fù)發(fā)組腮腺多形性腺瘤組織與未復(fù)發(fā)組和正常腺體組織的PTEN mRNA表達(dá)比較復(fù)發(fā)組腺瘤組織中PTEN mRNA表達(dá)(0.413±0.052)均低于正常腺體組織(0.947±0.061)和未復(fù)發(fā)組腺瘤組織(0.639±0.058)(P<0.05)。

表3復(fù)發(fā)組腮腺多形性腺瘤組織與未復(fù)發(fā)組和正常腺體組織的PTENmRNA表達(dá)比較

組別例數(shù)PTENmRNA表達(dá)(相對(duì)密度值)正常腺體組織200．947±0．061未復(fù)發(fā)組腺瘤組織140．639±0．058a復(fù)發(fā)組腺瘤組織110．413±0．052ab

與正常腺體組織比較，a：P<0.05；與未復(fù)發(fā)組腺瘤組織；b：P<0.05

3 討 論

PTEN作為一種人類基因，其主要位于人染色體10q23片段同源丟失區(qū)上[8]。該基因由八個(gè)內(nèi)含子和九個(gè)外顯子組成，其生理結(jié)構(gòu)可分為一個(gè)脂質(zhì)結(jié)合C2區(qū)、一個(gè)由五十個(gè)氨基酸組成的羧基端域和一個(gè)氨基端磷酸酶域[9]。PTEN生理功能主要通過(guò)氨基端產(chǎn)生，能夠介導(dǎo)和參與調(diào)控人體多種信息傳導(dǎo)途徑，并影響細(xì)胞凋亡[10]。此外，該基因的羧基端區(qū)屬于基因性癌變易發(fā)、高發(fā)區(qū),因此，抗癌領(lǐng)域常選擇該區(qū)作為腫瘤病變檢測(cè)的主要靶區(qū)之一。

通過(guò)參閱資料可知，PTEN突變或基因片段病理性缺失能夠誘發(fā)多種癌癥這是因?yàn)镻TEN能夠調(diào)控人體細(xì)胞周期[11]，對(duì)P21、P27和P51等細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子產(chǎn)生特異性影響，顯著調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖；PTEN還能促使PIP3脫磷酸化，造成受PI3K調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)傳輸通路被阻斷，維持正常細(xì)胞生長(zhǎng)周期；而PTEN缺失可致PIP3過(guò)表達(dá)，誘發(fā)其下游各類信號(hào)分子活性增強(qiáng)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)促使細(xì)胞病變轉(zhuǎn)化，此外PTEN顯著增高，直接造成細(xì)胞阻滯于G1期，無(wú)法向S期進(jìn)階，增強(qiáng)細(xì)胞病變可能性[12]。文獻(xiàn)稱，PTEN,缺失或失活能夠誘發(fā)腮腺多形性腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展，而其表達(dá)水平和腮腺多形性腫瘤生長(zhǎng)及預(yù)后具有密切關(guān)系[13]。

在本文中，我們通過(guò)分別檢測(cè)腮腺多形性腺瘤和正常腮腺組織內(nèi)PTEN mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示腺瘤組織、瘤旁0.5 cm組織、瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織內(nèi)PTEN mRNA表達(dá)均低于正常腺體組織(P<0.05)；而腺瘤組織、瘤旁0.5 cm組織、瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織中PTEN mRNA表達(dá)均低于舌下腺組織(P<0.05)；瘤旁2 cm組織中PTEN mRNA表達(dá)與正常腺體組織和舌下腺組織無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這表明PTEN表達(dá)增高可能是誘發(fā)腮腺多形性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素，且該基因表達(dá)水平還能評(píng)估癌變組織惡性程度，可能影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及向遠(yuǎn)處侵潤(rùn)、遷移，腫瘤組織惡性和分化程度越高，其表達(dá)水平越高。在研究中，我們通過(guò)對(duì)腮腺多形性腺瘤和正常腮腺組織內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)測(cè)定，結(jié)果顯示腺瘤組織和瘤旁0.5 cm組織內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均低于正常腺體組織及舌下腺組織，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；瘤旁1 cm組織、瘤旁1.5 cm組織、瘤旁2 cm組織中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與正常腺體組織和舌下腺組織無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這表明PTEN由于腮腺多形性腺瘤而造成其蛋白陽(yáng)性表達(dá)率上升，而瘤旁1 cm腺體組織蛋白表達(dá)率接近于腮腺組織，這表明惡性程度越高，PTEN蛋白表達(dá)越低。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)舌下腺組織PTEN基因和蛋白和正常正常腮腺組織相近，這是因?yàn)樵摻M織標(biāo)本來(lái)自舌下腺導(dǎo)管堵塞、涎液漪留形成囊腫，其雖屬于炎性病變組織，但無(wú)基因異變，因此其PTEN基因和蛋白均無(wú)異變。

PTEN基因及蛋白表達(dá)和腮腺多形性腺瘤預(yù)后具有相關(guān)性，可通過(guò)檢測(cè)PTEN對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估、判斷[14]。在本研究中，復(fù)發(fā)組腺瘤組織中PTEN mRNA表達(dá)、PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性均低于正常腺體組織和未復(fù)發(fā)組腺瘤組織(P<0.05)，這表明PTEN不僅和腮腺多形性腺瘤發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，同時(shí)也能決定其遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)，我們認(rèn)為若采取措施增強(qiáng)PTEN表達(dá)，能夠有效抑制腮腺多形性腺瘤生長(zhǎng)，并顯著降低患者遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)。

綜上所述，PTEN低表達(dá)和腮腺多形性腺瘤生長(zhǎng)及發(fā)展具有相關(guān)性，并能決定其復(fù)發(fā)，能夠影響患者預(yù)后。

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TheRelationshipBetweenPTENGeneExpressionandtheDevelopmentofParotidGlandPolymorphicAdenoma

LIU Zhiming， ZHANG Hong，HUANG Li，et al
(StomatologyCenter,RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060China)

ObjectiveTo analyze the relationship between PTEN gene expression and the development of parotid gland polymorphic adenoma.Methods25 cases of parotid gland polymorphic adenoma were selected in our hospital’s department of Stomatology,and 20 cases of normal parotid gland were selected as control group,pleomorphic adenoma of parotid adenoma tissues,0.5 cm～2 cm of tumor adjacent tissues,sublingual gland,and normal salivary gland tissue were collected,to compare the expressions of PTEN mRNA and PTEN protein in different tissues;and the expression of PTEN mRNA and PTEN protein in the recurrent group,the non-recurrence group and the normal parotid gland were compared.Results

The PTEN mRNA expression of adenoma tissues,0.5 cm of tumor adjacent tissue,1 cm of tumor adjacent tissue,1.5 cm of tumor adjacent tissue was significantly lower than that of normal glandular tissue and sublingual gland tissue.The PTEN protein expression positive rate of adenoma (56%) and 0.5 cm of tumor adjacent tissue(64%) was significantly lower than that of normal glandular tissue (100%) and sublingual gland (96%);The expression of PTEN mRNA in the recurrent group (0.413±0.052) was significantly lower than that in normal tissues (0.947±0.061) and the non-recurrent group (0.639±0.058);The positive expression rate of PTEN protein in recurrent group (27.3%) was significantly lower than that of normal gland tissues (100%) and non-recurrence group (71.4%) (allP<0.05).ConclusionThe expression of PTEN in the tissues of parotid gland was lower than that of normal parotid gland and sublingual gland tissues,and in recurrent group was lower than that in normal groupand non-recurrence group.

parotid gland polymorphic adenoma; PTEN mRNA; PTEN protein; recurrence

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.014

2016-01-22；

2016-04-20

R781.7

A

秦旭平)