， ， ， ，，，云生

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南 衡陽 421001，2.長沙醫(yī)學(xué)院臨床系;3.湖南省衡陽市第八中學(xué)生物教研室;4.湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

肌酐水解酶基因工程菌的構(gòu)建及功能研究

楊波1，蔣芬1，朱艷1，楊成2，向鐵勇3，段紹斌4，蔣云生4

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南 衡陽 421001，2.長沙醫(yī)學(xué)院臨床系;3.湖南省衡陽市第八中學(xué)生物教研室;4.湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科)

目的構(gòu)建肌酐水解酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌中，研究其蛋白的表達及活性。方法根據(jù)Genbank上肌酐水解酶基因序列(D45424.1)，進行生物合成，得到肌酐水解酶基因片段C，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增后，與質(zhì)粒GV296連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒GV296-C，轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建成基因工程菌GV296-C/BL21(DE3)。進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分析后，測定培養(yǎng)液肌酐濃度變化。結(jié)果成功構(gòu)建重組質(zhì)粒GV296-C，電泳顯示目的片段約為0.783Kb，測序結(jié)果與D45424.1基因序列一致。重組質(zhì)粒GV296-C轉(zhuǎn)染至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)SDS-PAGE分析酶蛋白的分子量約為29KD。結(jié)論成功構(gòu)建工程菌GV296-C/BL21(DE3)，誘導(dǎo)后高效表達肌酐水解酶，具有水解肌酐活性。

肌酐水解酶； 基因工程菌； 肌酐； 慢性腎功能衰竭

慢性腎功能衰竭是各種腎臟疾病的最終結(jié)局。除原發(fā)癥狀外，其主要表現(xiàn)均有代謝產(chǎn)物蓄積，水及電解質(zhì)酸堿平衡紊亂。慢性腎衰竭一旦發(fā)生后，患者腎功能的惡化與原有基礎(chǔ)疾病活動有關(guān)。但有時即便原發(fā)病停止活動，腎功能仍會繼續(xù)進行下降。其主要原因是尿毒素不僅使腎功能損傷加劇，而且引起全身各個器官都會受損。血中過高濃度的毒素滲入胃腸道，從而引起腸道內(nèi)微生態(tài)的改變，出現(xiàn)細菌數(shù)量及菌種的改變[1]。大量增殖的腸道細菌對尿毒素(如肌酐、尿素)進行分解代謝，作為細菌生長的能量來源。肌酐在腸道細菌作用下，可降解成多種產(chǎn)物。在細菌肌酐水解酶催化下生成肌酸，后者在肌酸水解酶催化下，水解為肌氨酸。把以上兩種酶的基因融合轉(zhuǎn)入腸道益生菌細菌中，再將這含有這兩種酶的基因菌種制成生物制劑，注入腎衰患者的消化道內(nèi)，使?jié)B入腸道中的肌酐降解為肌氨酸，肌氨酸不但無毒，而且是營養(yǎng)物質(zhì)，從而達到降低慢性腎衰患者血肌酐，同時改善患者營養(yǎng)。

本研究組已經(jīng)成功將肌酸水解酶轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并且獲得高效表達[2]?，F(xiàn)擬構(gòu)建肌酐水解酶基因表達工程菌，以大腸桿菌為宿主菌，使其能產(chǎn)生肌酐水解酶，降解肌酐為肌酸，為后期進一步建立將肌酐降解成為肌氨酸的肌酐水解酶及肌酸酶融合表達的枯草芽孢桿菌基因工程菌打下基礎(chǔ)。通過將轉(zhuǎn)入以上兩種酶的基因工程菌注入慢性腎衰患者腸道，在患者腸道內(nèi)發(fā)揮肌酐降解作用及改善營養(yǎng)，為延緩腎功能衰竭治療提供新的思路及治療手段。

1 材料與方法

1.1實驗材料大腸桿菌E.coliBL21(DE3) 、DH5a(E.coliDH5a)均由南華大學(xué)微生物實驗室提供。質(zhì)粒PET28a(+)(GV296)，購于上海吉凱生物有限公司。Thermo購于T4 DNA Ligase；DNA限制性內(nèi)切酶購于BioLabs； 2×Taq MasterMix購于康為世紀；高純度質(zhì)粒小提試劑盒，和DNA凝膠回收試劑盒均為天根產(chǎn)品。上海生工生物股份有限公司合成引物。

1.2實驗方法

1.2.1 構(gòu)建肌酐水解酶目的基因片段 按照GenBank數(shù)據(jù)庫提供的肌酐水解酶(惡臭假單胞菌1978)D45424.1基因序列，交上海吉凱生物有限公司生物合成，得到肌酐水解酶基因模板C。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction PCR)擴增 按照肌酐水解酶(D45424.1)的基因序列設(shè)計引物，在上游引物中加入酶切位點BamHI，在下游引物中加入酶切位點XhoI。以下是設(shè)計的引物：

上游：AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAGCAAGAGTGTTTTTG

下游：TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGTGGGCGGGAACTCC

反應(yīng)體系(25 μL)：模板a，1 μL；上游引物，0.5 μL；下游引物，0.5 μL；2×Taq MasterMix,12.5 μL；dd H2O,10.5 μL；總體積為25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30個循環(huán)，72 ℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，4 ℃保存。

1.2.3 肌酐水解酶基因重組質(zhì)粒GV296-C的構(gòu)建

用BamHI、XhoI對PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒GV296進行雙酶切。DNA凝膠回收試劑盒回收DNA片段。回收純化的GV296酶切片段、肌酐水解酶DNA片段C，按照5∶1加樣。進行連接反應(yīng)。T4連接酶反應(yīng)體系(20 μL)：肌酐水解酶DNA片段5 μL；質(zhì)粒GV296酶切回收產(chǎn)物1 μL；T4連接酶1 μL，10×連接Buffer2 μL； dd H2O11 μL。22 ℃反應(yīng)10 min；65 ℃滅活10 min。重組質(zhì)粒GV296-C轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞。

1.2.4 重組質(zhì)粒的挑選及鑒定 使用菌落PCR、雙酶切、DNA測序等方法，對重組質(zhì)粒GV296-C轉(zhuǎn)化子進行篩選陽性克隆菌。初步用菌落PCR篩選陽性克隆，重組質(zhì)粒抽提后，進行雙酶切及DNA測序進一步確定。挑取單菌落，分別挑取1個單菌落于1 mL卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基離心管×8管，37 ℃，220 rpm 振蕩2 h。PCR及測序引物以通用引物T7 Promoter Primer。以下是設(shè)計的引物：

T7正向引物：TAATACGACTCACTATAGGG

T7反向引物:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG

反應(yīng)體系(12.5 μL)：菌液1.5 μL；T7正向引物、T7反向引物均為0.25 μL；dd H2O,4.25 μL；2×Taq MasterMix,6.25 μL；總?cè)莘e為12.5 μL。反應(yīng)參數(shù)如下：94 ℃，10 min；94 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30個循環(huán)，72 ℃，5 min。反應(yīng)完后，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以初步篩選陽性克隆。

取PCR陽性克隆菌液10 μL，接種于卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基。37 ℃，220 rmp振蕩培養(yǎng)過夜(約12 h)。抽提質(zhì)粒后，進行雙酶切。將菌落PCR、酶切均顯示為陽性的重組質(zhì)粒GV296-C轉(zhuǎn)化子的菌液,送至上海生工生物有限公司進行測序。

1.2.5 重組質(zhì)粒GV296-C的鑒定和誘導(dǎo)表達 測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子GV296-C，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，進行轉(zhuǎn)化及菌液PCR，構(gòu)建表達工程菌GV296-C/BL21(DE3)。根據(jù)測序比對正確的肌酐水解酶的序列設(shè)計引物，在上下游引物中分別添加HindIII、 XbaI酶切位點。引物如下：

上游：GCTCTAGA-cggaagtccgtctggc

下游：CCCAAGCTT-gaattcgacatagctgaaacttcc

PCR反應(yīng)完成后，產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳，以篩選陽性克隆菌。對PCR鑒定陽性的表達工程菌GV296-C/BL21(DE3)，使用IPTG誘導(dǎo)其蛋白的表達。超聲波粉碎細菌后，采用非連續(xù)變性電泳。

1.2.6 表達工程菌分解肌酐的體外實驗 挑取重組菌GV296-C/BL21(DE3)的單菌落，接種于2 mL卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基，溫度37 ℃，220 rpm 揺菌培養(yǎng)；次日按1∶100轉(zhuǎn)種于5 mL卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基，溫度30 ℃，220 rpm培養(yǎng)2 h；在無菌條件下加入IPTG至終濃度1 mM，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，收集菌體，生理鹽水洗滌后，再用生理鹽水重懸菌體，用麥氏比濁法調(diào)整懸菌液約1.5×108cfu/mL；取懸菌液200 μL加入含肌酐的800 μL LB培養(yǎng)基中。取大腸桿菌DE3(菌濃度同上)懸菌液200 μL，加入含肌酐的LB培養(yǎng)基800 μL，設(shè)為對照組。溫度37 ℃，220 rpm培養(yǎng)24小時，13 000 rpm，離心2 min，取上清液，送生化分析儀檢測肌酐濃度。取生理鹽水200 μL加入上述培養(yǎng)基中，設(shè)為陰對照組，培養(yǎng)24小時后，同上離心取上清液測肌酐濃度。設(shè)5個樣本每組。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增的肌酐水解酶目的基因按照肌酐水解酶D45424.1的基因序列進行生物合成，得到模板C，進行PCR擴增，得到約823bp的DNA片段，大小與預(yù)期一致，見圖1。

圖1 肌酐水解酶基因PCR產(chǎn)物電泳圖 1：PCR擴增產(chǎn)物，2：Maker

2.2 PCR鑒定重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒GV296-C轉(zhuǎn)染入a感受態(tài)大腸桿菌DH5，挑取轉(zhuǎn)化子1～8號，進行菌液PCR，產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。5～12泳道為1～8號轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定，得到約1 068 bp的DNA片段，與肌酐水解酶的基因大小相符，具體見圖2。將PCR鑒定陽性的產(chǎn)物送測序，顯示肌酐水解酶的基因片段與D45424.1的基因序列一致,測序結(jié)果見圖3。

圖2 重組質(zhì)粒GV296-C的菌落PCR鑒定

2.3工程菌GV296-C/BL21(DE3)表達的SDS-PAGE分析表達工程菌GV296-C/BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用于SDS-PAGE上樣，凝膠成像照相。分析泳道3、5，可見有目的蛋白表達，分子量約為29 KD，大小與預(yù)期相一致，見圖4。

圖4 重組肌酐水解酶及其純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.4工程菌肌酐水解酶活性測定結(jié)果取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的表達工程菌GV296-C/BL21(DE3)，菌液與肌酐溶液作用24小時后，與對陰性照組相比，表達工程菌組上清液肌酐濃度顯著下降(P<0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義，DE3組與陰對照組比較，P>0.05無顯著性差異；見表1。

表1各種細菌對肌酐的作用比較(n=5)

分組陰性對照組大腸桿菌DE3組表達工程菌組肌酐(μmol/L)1019．73±47．98952．64±51．48b512．35±43．95a

F=176.92,a:與陰對照組、DH5a組比較，P<0.01；b:與陰對照組比較，P>0.05

圖3 肌酐水解酶基因片段的測序圖

3 討 論

慢性腎衰當(dāng)人體血肌酐濃度達到530.46～ 707.28 μmol/L時,肌酐滲入腸腔的量顯著增加,為腸道細菌提供了充足的能源。導(dǎo)致腸道內(nèi)微生態(tài)發(fā)生改變，細菌過度生長。肌酐被細菌降解為多種產(chǎn)物，如尿酸、甲基胍等。動物實驗顯示注射甲基胍的鼠腎小球濾過率、腎血流量均顯著下降。給慢性腎衰的狗腹腔內(nèi)注射甲基胍,可導(dǎo)致代謝增高、貧血、血小板減少，中央和周圍神經(jīng)病變、心律不齊、心肌變性、痛癢癥,嘔吐、食欲下降、流涎增多和腹瀉。甲基胍腎毒性機制目前認為是甲基胍在氧作用下產(chǎn)生氧自由基，激活體內(nèi)(特別是腎細胞)的氧化應(yīng)激。實驗顯示肌酐降解為甲基胍后，其毒性進一步增強。

實驗顯示在高濃度肌酐誘導(dǎo)下，細菌能產(chǎn)生更多的肌酐降解酶。煙草節(jié)桿菌發(fā)酵產(chǎn)肌酐酶，誘導(dǎo)后，酶活性顯著增加[3]。多種細菌具有肌酐降解酶[4，5]。Seifter JL發(fā)現(xiàn)尿道感染細菌中也肌酐水解酶，并且降解肌酐[6]。肌酐在腸道細菌作用下降解成多種產(chǎn)物，其中1-甲脲乙醇酸酐、甲基胍等其毒性進一步增強[7]。Ranganathan[8]提出慢性腎衰腸道細菌療法,其方法是將能分解尿毒素的細菌(對人體低毒的)攝入消化道內(nèi),分解滲入腸道內(nèi)的尿毒素,以降低血中尿毒素濃度,減輕尿毒癥癥狀。

肌酐在肌酐水解酶的作用下，水解成肌酸；肌酸在肌酸水解酶催化下進一步降解為肌氨酸和尿素。目前對肌酐水解酶研究較多，主要是把該酶用于酶法檢驗肌酐[9]。本實驗室以前已經(jīng)成功構(gòu)肌酸水解酶基因重組工程菌，本次實驗構(gòu)建含肌酐水解酶的基因大腸桿菌，表達肌酐水解酶，旨在下一步將這兩種酶的基因融合，轉(zhuǎn)入腸道益生菌，使肌酐降解肌酸后，進一步降解為肌氨酸。

目前研究較為系統(tǒng)的是能產(chǎn)肌酐水解酶的惡臭假單胞菌，其基因序列中含有一個780 bp的開放閱讀框、由259個氨基酸殘基組成、分子量為28 437 Da，根據(jù)Genbank中惡臭假單胞菌PS-7(D45424.1)基因序列構(gòu)建肌酐水解酶目的基因模板，PCR擴增得到肌酐水解酶目的基因片段，測序鑒定擴增片段的基因與D45424.1基因序列完全一致。通過測序比對得到肌酐水解酶的基因片段，經(jīng)酶切后也證實與肌酐水解酶的基因片段一致。顯示目的基因克隆成功。在表達實驗結(jié)果中，顯示工程菌能產(chǎn)生肌酐水解酶，并且能分解酐，具有酶活性。

腸道細菌療法其關(guān)鍵是選擇高效低毒菌，通常選擇腸道益生菌。因為外來菌進入消化道后，可能導(dǎo)致宿主腸道微生態(tài)紊亂，產(chǎn)生新的菌群失調(diào)；同時還可能攜帶了某些耐抗菌素的載體質(zhì)粒，這些質(zhì)?？赡軙D(zhuǎn)化到其他腸道菌種中，導(dǎo)致產(chǎn)生新的耐抗生素菌群，有可能導(dǎo)致原本免疫力低下的尿毒癥患者出現(xiàn)嚴重的感染性疾病。因此考慮下一步采用益生菌做為基因工程菌的宿主菌，如乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌，有望為慢性腎衰腸道細菌治療解決安全性問題。枯草芽孢桿菌比乳酸桿菌有更強的生存能力，在孢子狀態(tài)下穩(wěn)定性好，耐擠壓，能耐氧化；60 ℃高溫下能長期生存，在120 ℃溫度下可存活20分鐘；在胃酸環(huán)境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的堿性環(huán)境，具有良好的耐酸堿特性，活菌可100%直達大小腸?？莶菅挎邨U菌以孢子狀態(tài)進入消化道后，由休眠狀態(tài)迅速復(fù)蘇，在短期內(nèi)繁殖成含菌量高的優(yōu)勢種群，大量消耗掉腸道內(nèi)氧氣，并產(chǎn)生細菌素、過氧化氫，建立新的微生態(tài)平衡，促進腸道益生菌的繁殖，抑制有害微生物(大腸桿菌、沙門氏桿菌)的生長，從而預(yù)防腹瀉、痢疾等腸胃道疾病。在快速增殖過程中，產(chǎn)生大量多種維生素、氨基酸、有機酸、蛋白酶(特別是堿性蛋白酶)、脂肪酶、糖化酶、淀粉酶[10-11]。近二十年以來，人們逐漸致力研究枯草芽孢桿菌的生物學(xué)和基因組學(xué)特性，并且運用基因工程的方法，對其遺傳物質(zhì)進行改造，構(gòu)建了一系列基因表達載體[12-13]。程新等把肌酐水解酶基因轉(zhuǎn)入乳酸桿菌[14]。枯草芽孢桿菌可能比乳酸桿菌更有優(yōu)勢。本實驗成功構(gòu)建肌酐水解酶的重組質(zhì)粒菌，將為下一階段構(gòu)建含有肌酐水解酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌奠定基礎(chǔ)，基因菌攝入慢性腎衰患者腸道后，在腸道內(nèi)發(fā)揮生化作用。使作為毒素的肌酐，在降解為肌酸后，進一步轉(zhuǎn)化可作為為營養(yǎng)物質(zhì)的肌氨酸，為慢性腎功能衰竭的治療，延緩病情的進展提供新的治療方法及思路。

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TheConstructionoftheCreatininaseGeneEngineeringBacteriaandFunctionStudy

YANG Bo,JIANG Fen,ZHU Yan,et al
(DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo construct recombinant plasmids of Creatininase,cloning into E.coli,and study its expression and enzyme activity.MethodsAccording to the gene sequence of creatininase in Genbank(D45424.1),it was biosynthesized to get the gene fragment of creatininase C,after the PCR amplified,and then was connected with GV296 to construct the recombinant plasmid GV296-C,and transformed to E.coli BL21(DE3) to construct gene engineering strain GV296-C/BL21 (DE3).After SDS-PAGE,the concentration of creatinine in the culture fluid was determined.ResultsThe recombinant plasmid GV296-C was constructed successfully,enzyme fragment was about 0.783Kb as electrophoresed shown.The sequencing result was consistent with gene order(D45424.1).The reconstructed plasmid GV296-C were transformed into E.col BL21(DE3) competent cells.The protein of molecular weight was approximately 29KD by SDS-PAGE.ConclusionsThe engineering strain GV296-C/BL21 (DE3) is constructed successfully,and the expression of the creatininase is induced to be efficient,which has the enzymes activity.

creatininase； gene engineering bacteria； creatinine； chronic renal failure

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.004

2016-04-25；

2016-06-29

湖南省自然科學(xué)基金項目(No：13JJ3082).

R692.5

A

秦旭平)