朱洪慶，王盼盼，張 萌，陳嘉慧，丁 祥

(西華師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009)

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rDNA-ITS序列分析法與傳統(tǒng)分類法相結(jié)合在真菌鑒定中的應(yīng)用

朱洪慶，王盼盼，張 萌，陳嘉慧，丁 祥

(西華師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009)

采集了四川馬爾康地區(qū)3種真菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征結(jié)合卯曉嵐的《中國大型真菌》圖譜，初步確定其疑似為黃菇、松乳菇、紅菇3個(gè)種。為提高鑒定的準(zhǔn)確性，通過構(gòu)建基因池；用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；將測得的實(shí)驗(yàn)樣品的序列在GeneBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)；并與相似性較高的已知的種，利用DNAMAN、Clustalx1.83和MEGA5.0軟件采用N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹，探尋他們與已知物種的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，三種疑似菌株擴(kuò)增出的目的條帶為500—750bp，J1、J2、J3號(hào)菌株分別與臭黃菇、松乳菇、紅菇的序列相似度最高。 并利用序列的相似性做出了它們各自的進(jìn)化樹。最終得出結(jié)論：J1號(hào)菌株為臭黃菇(Russulafoetens)，J2號(hào)菌株為松乳菇(Lactariusdeliciosus)，J3號(hào)菌株為紅菇(Russula.)。利用rDNA-ITS序列分析法和形態(tài)學(xué)分類法相結(jié)合的方法鑒定菌種，不僅豐富了三種真菌的基因庫，而且也克服了單純的rDNA-ITS序列分析法因受基因庫的完善程度、高度相似性序列的多少以及具體物種ITS區(qū)的可變程度等限制而不能鑒定出所有真菌的缺點(diǎn)，提高了真菌分類鑒定中一些模糊性狀的區(qū)分度。

真菌；鑒定；rDNA；ITS；PCR；測序

傳統(tǒng)的真菌鑒定方法主要通過培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)和顯微特征，或輔以生理、生化、營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來鑒定。全世界的大型真菌種類繁多，如果只利用真菌的形態(tài)學(xué)、生理生化特點(diǎn)等特征來鑒定真菌，不僅需要豐富的真菌鑒定工作經(jīng)驗(yàn)而且需要花費(fèi)較長的時(shí)間，而且對(duì)于某些生長條件特殊、形態(tài)相似的菌株要通過傳統(tǒng)的表型特征鑒定，常會(huì)得出假陽性或假陰性結(jié)果，使鑒別顯得非常困難[1,2]。隨著核酸分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，分子生物學(xué)得到迅速發(fā)展，并且已應(yīng)用到各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域。

真菌基因組中有4種編碼核糖體RNA(rDNA)基因，包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA[3]。而真菌rDNA的18s和28s之間的片段含有真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)[3,4]，主要包括18S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)、5.8 S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)和28 S rDNA，這些序列保守性強(qiáng)，又含有可變區(qū)和高變區(qū)，它們頭尾串聯(lián)成一個(gè)重復(fù)單位，其長度一般為650—750bp，其結(jié)構(gòu)如圖1所示[2]。而ITS4和ITS5兩對(duì)引物通?？梢杂脕碜鳛榇蠖鄶?shù)的擔(dān)子菌和子囊菌的特異性鑒定引物[5-7]。rDNA上的5.8S、18S和28S rDNA存在著廣泛的異種相似性，在進(jìn)化過程中ITS序列所承受的自然選擇壓力一般較小，因此可能會(huì)有更多的變異，也具有更多的可遺傳性狀，成為ITS序列在真菌種類鑒定及其進(jìn)化分析的理論基礎(chǔ)[8-10]。對(duì)編碼rDNA的序列分析可用于未知真菌的鑒定或者對(duì)表型鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。利用PCR 擴(kuò)增真菌核糖體ITS(Internal Transcribed Spacer)基因區(qū)段進(jìn)行真菌鑒定的方法因其快速、簡便而得到迅速地發(fā)展[11]。然而，僅根據(jù)對(duì)編碼rDNA的序列分析來鑒定未知真菌，由于相似序列的數(shù)量繁多，不同種間相似序列的差異很小，有些可達(dá)99%的相似度，對(duì)鑒種的工作增加了難度，如果加之傳統(tǒng)的分類學(xué)方法，可以更好的確定其種屬。

我們?cè)谒拇R爾康地區(qū)采集了3種菌株，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征結(jié)合卯曉嵐的《中國大型真菌》圖譜，初步確定其疑似為黃菇、松乳菇、紅菇3個(gè)種。采用rDNA-ITS序列分析法從分子生物學(xué)角度驗(yàn)證宏觀種屬鑒定的準(zhǔn)確性，并為提高真菌鑒定中一些模糊性狀的區(qū)分度，實(shí)現(xiàn)真菌種屬的準(zhǔn)確鑒定提供理論依據(jù)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真菌樣品于2015年7—8月在四川馬爾康地區(qū)采集，采集過程中記錄其生境、習(xí)性，并保證其菌株的完整性(包括菌蓋、菌環(huán)、菌托及地下部分)，拍照記錄，然后將其干燥后帶回實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存于干燥的地方。

CTAB抽提液[4][Tris-HCl(pH=8.0, 1 mol/L)、CTAB(分析純)、EDTA(pH=8.0, 0.5mol/L)、1.4mol/L NaCl(分析純)]，10 × Taq Reaction Buffer(Mg2+free)，β-巰基乙醇，CIA，dNTP(2.5mM each)，MgCl2(25mM)，Taq DNA Polymerase(2.5U/μL)，異丙醇，70%乙醇，瓊脂糖，50×TAE電泳緩沖液，D2000 Marker，EB染色液，凝膠回收試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

使用儀器筆設(shè)備有恒溫震蕩箱、高壓蒸汽滅菌鍋、水浴鍋、低溫高速離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器。

1.3 傳統(tǒng)分類法鑒定真菌

根據(jù)記錄的三株菌株的生境和形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合卯曉嵐[14]主編的《中國大型真菌》圖譜，初步鑒定出J1、J2、J3的科屬。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.4.1 總DNA提取

選取三種真菌樣品的子實(shí)體各6株，每個(gè)子實(shí)體均將干燥的菌蓋樣品剪碎，然后每種真菌稱取等量的混合樣品放入研缽，用液氮將其研磨充分，將研磨完的粉末狀樣品轉(zhuǎn)入已寫好編號(hào)的EP管，并按照CTAB法提取DNA[11]，提取的DNA產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，放在-20℃冰箱保存以待擴(kuò)增。

1.4.2 PCR擴(kuò)增ITS序列

PCR擴(kuò)增引物[4]：ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC3’- ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’- (均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成)

PCR擴(kuò)增體系(50μL): MagicMix 2.0(25μL)，DNA模板(2μL)，ITS4 (1μL)，ITS5(1μL)，ddH2O(21μL)。

PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性 (94℃ 5min)，變性(94℃ 30s)，復(fù)性(52℃ 30s)，延伸(72℃ 1min)，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。

1.4.3 PCR結(jié)果檢測

取擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物7.0μL并與6×Loading Buffer混勻，在含有10 mg/mL EB的2 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，于1.0 × TAE緩沖液(電壓為80V)中電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)離點(diǎn)樣孔大約距離整個(gè)膠的2/3處時(shí)，停止電泳，將取出的凝膠放在凝膠成像系統(tǒng)中，觀察并拍照。[4]

1.4.4 ITS片段純化、測序

根據(jù)PCR電泳的結(jié)果，將500 —700bp左右的一條目的條帶經(jīng)試劑盒(Universal DNA Purification Kit)進(jìn)行純化，將含有非特異性條帶的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、切膠、收集目的條帶，并用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并將純化后的PCR產(chǎn)物送去英俊測序公司進(jìn)行上下游引物雙向測序，得到測序結(jié)果[11-13]。

1.5 進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測序結(jié)果利用BankIt工具上傳至GeneBank，獲得登錄號(hào)，選擇其中最短的擴(kuò)增序列，以此長度為基本比對(duì)長度，在NCBI數(shù)據(jù)庫尋找登記序列中含有與該三種序列相似度高的片段，通過BLAST工具和DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，截去兩側(cè)擴(kuò)增差異較大的堿基對(duì)，使比對(duì)的序列大小幾乎一致，重新用Clustalx 1.83軟件進(jìn)行完全比對(duì)，利用MEGA5.0軟件采用鄰位相連法(N-J，neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[15，16]。

1.6 傳統(tǒng)分類法與現(xiàn)代分類法相結(jié)合

根據(jù)構(gòu)建的進(jìn)化樹，然后結(jié)合記錄的形態(tài)學(xué)特征，共同確定出這三株菌株的具體種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)分類法的最初鑒定結(jié)果

根據(jù)《中國大型真菌》記錄的三株菌株的生境形態(tài)特征、菌蓋、菌環(huán)、菌褶、菌柄等的顏色形態(tài)特征初步確定它們均為擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目紅菇科的菌株[14]。結(jié)果如圖2所示。臭黃菇的形態(tài)特征為：子實(shí)體中等大，菌蓋土黃至淺黃褐色，表面粘滑，邊緣有小疣組成的明顯的粗條棱；菌蓋扁半球形，菌肉污白色，具腥臭味，菌褶白色至淺黃色，有深色斑痕，菌柄較粗壯，圓柱形，污白色至淡黃色，內(nèi)部松軟至空心。松乳菇的形態(tài)特征為：子實(shí)體較大，菌蓋扁半球形，中央臍狀，伸展后下凹，蝦仁色或深橙色，有較明顯的環(huán)帶；菌肉初期帶白色，菌褶與菌蓋同色，直生，褶間有橫脈，菌柄較粗壯，圓柱形。紅菇的形態(tài)特征為：子實(shí)體中等大，菌蓋扁半球形，后平展至中下凹，紅色，不粘，邊緣無條紋，常有分叉；菌肉菌褶白色，褶間具橫脈。根據(jù)以上結(jié)果，我們初步鑒定實(shí)驗(yàn)樣品J1和J3為紅菇屬，J2為乳菇屬，其中，J1、J2、J3分別是臭黃菇、松乳菇和紅菇。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取J1、J2、J3號(hào)真菌菌株DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其rDNA—ITS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后均能擴(kuò)增出目的條帶(圖3)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小均在500—750 bp之間。

2.3 rDNA-ITS序列測序與比對(duì)結(jié)果

3種真菌的擴(kuò)增測序結(jié)果上傳至GeneBank，獲得其登錄號(hào)，登錄號(hào)情況如下：J1實(shí)驗(yàn)樣品，登錄號(hào)為KX034409，687bp；J2實(shí)驗(yàn)樣品，登錄號(hào)為KX034408，718bp；J3實(shí)驗(yàn)樣品，登錄號(hào)為KX034407，644bp。

將我們實(shí)驗(yàn)樣品獲得的序列與從GeneBank獲取的相似較高序列經(jīng)DNAMAN和Clustalx1.83軟件進(jìn)行比對(duì)分析并用MEGA 5.0構(gòu)建N—J系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4—6)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹并結(jié)合各比對(duì)指標(biāo)來確定距離與相似性均具有較大鑒定意義的比對(duì)序列[16-17]。J1(KX034409)與臭黃菇(Russulafoetens)中KF245487高達(dá)99%的相似度；J2(KX034408)與松乳菇(Lactariusdeliciosus)的DQ116896序列有100%的相似度；J3(KX034407)與紅菇(Russula.)中GU083106可達(dá)99%的序列相似性。

2.4 rDNA—ITS序列分析法與傳統(tǒng)分類法相結(jié)合，最終鑒定結(jié)果

根據(jù)圖4—6可知，J1、J2、J3的rDNA—ITS序列分別與臭黃菇(Russulafoetens)、松乳菇(Lactariusdeliciosus)、紅菇(Russula.)有很高的相似性，進(jìn)一步證實(shí)了傳統(tǒng)分類法中的最初鑒定結(jié)果。

最終，我們根據(jù)《中國大型真菌》記錄的三株菌株的形態(tài)特征，包括生境情況、菌蓋、菌環(huán)、菌褶、菌柄等顏色形態(tài)特征，結(jié)合rDNA-ITS序列分析法，確定J1(KX034409)為臭黃菇(Russulafoetens)，J2(KX034408)為松乳菇(Lactariusdeliciosus)，J3(KX034407)為紅菇(Russula.)。

3 討 論

根據(jù)傳統(tǒng)分類法和分子生物學(xué)方法相結(jié)合的方法，對(duì)在四川馬爾康地區(qū)采到的三種菌株進(jìn)行鑒定，先根據(jù)三種菌株的形態(tài)特征，可初步鑒定為紅菇科的某些種類，然后再依照《中國大型真菌》，斷定它們可能是臭黃菇、松乳菇和紅菇這三種。但由于某些特征有些模糊，并不能直接斷定到這3個(gè)種。利用這3個(gè)種的rDNA-ITS序列分析法，做出它們各自的系統(tǒng)進(jìn)化樹研究，最終能確定這三種菌株分別是臭黃菇(Russulafoetens)，松乳菇(Lactariusdeliciosus)和紅菇(Russula.)。這種傳統(tǒng)分類法和現(xiàn)代分子技術(shù)相結(jié)合的方法，是菌種鑒定的一種十分重要的方法。

采用分子生物學(xué)手段鑒定真菌，最關(guān)鍵的是能否從待測樣品中得到穩(wěn)定、量高、質(zhì)佳的真菌DNA模板。研磨是否充分對(duì)DNA的提取至關(guān)重要，當(dāng)研磨不充分時(shí)，提取的DNA量很少，而且PCR擴(kuò)增出來的產(chǎn)物經(jīng)檢測的條帶很少或者不亮。PCR完成后應(yīng)檢測擴(kuò)增效果，常用電泳的方法進(jìn)行目的序列的檢測，如圖3所示，當(dāng)在500—750bp位置出現(xiàn)單一并且較亮的條帶時(shí)表明擴(kuò)增出目的條帶，若無任何條帶或條帶并未在500—750bp位置表明DNA提取或者擴(kuò)增無效，若在此位置出現(xiàn)的條帶多而亮表明DNA不純[1]。

在進(jìn)行序列比對(duì)分析時(shí)，從核酸序列數(shù)據(jù)庫中BLAST出來的相似序列較多，選擇的相似序列應(yīng)該在500—800bp，雖然較多的相似序列可以為系統(tǒng)學(xué)研究提供更大的參考意義和更多的信息，但另一方面過多的相似序列也會(huì)使菌種鑒定工作更加復(fù)雜困難。而且隨著GeneBank的不斷豐富，不同種間的ITS序列差異越來越小，單靠分子生物學(xué)方法無法鑒定菌種的種屬，此時(shí)就應(yīng)當(dāng)結(jié)合傳統(tǒng)分類學(xué)的方法，根據(jù)它們形態(tài)學(xué)的特征，更準(zhǔn)確的鑒定真菌，同時(shí)還可以使用其它的序列比對(duì)分析工具，比如DNAMAN軟件。這種現(xiàn)代分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)分類法相結(jié)合的鑒定菌種方法是一種更廣泛的鑒定法，具有更大的生物學(xué)意義。

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Application of rDNA-ITS Sequence Analysis and Traditional Classification Method in the Identification of Fungi

ZHU Hongqing,WANG Panpan,ZHANG Meng,CHEN Jiahui,DING Xiang

(a.College of Life Sciences;b.Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation,China West Normal University,Nanchong Sichuan 637009,China)

In this paper,the ITS sequence diversity analysis of the large fungal fruiting body,combined with the traditional morphological identification method,was applied to the identification of large fungi.We collected three kinds of fungi in Sichuan Barkam region and initially identified that they were the suspectedRussulafoetens,LactariusdeliciosusandRussulaspecies,according to its morphological characteristics with the “China macro-fungi” map written by Mao Xiaolan.To improve the identification accuracy,we constructed gene pool;PCR was amplified by specific primers,and the amplified products were sequenced.The sequence of the measured samples was compared by using BLAST in GeneBank,and found the known species with high homology,and the N-J method was used to construct the phylogenetic tree with DNAMAN,Clustalx1.83 and MEGA5.0 software to explore their correlation with the known species.The results showed that amplified purpose bands of three suspected strains were 500—750bp,J1,J2 and J3 strains’ sequence respectively had a high similarity withRussulafoetens,LactariusdeliciosusandRussula,and made their respective phylogenetic tree by the use of sequence similarity.Finally, the conclusion was that the strain J1 wasRussulafoetens,the J2 strain wasLactariusdeliciosus,and the J3 strain wasRussula.The method of species identification which combined the rDNA-ITS sequence analysis with morphological classification,not only enriched the gene pool of three fungal species,but also overcame the shortcomings of the only one rDNA-ITS sequence analysis method that could not identify out all fungi because of the limit,like the improvement degree of gene pool,number of highly homologous sequences and specific species of rDNA-ITS region of variable degree and improved the division of some fuzzy traits in fungi.So the method of identifying strains combined the traditional classification method with the analysis of rDNA-ITS sequence had been widely applied in the identification of large fungi.

fungi;identification;rDNA;ITS;PCR;sequencing

1673-5072(2016)03-0264-06

2016-04-06 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200012)；四川省科技廳基礎(chǔ)應(yīng)用項(xiàng)目(2014SZ0020 )，四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(16CZ0018)

朱洪慶(1990—)，女，四川達(dá)州人，碩士研究生，主要從事真菌多糖免疫活性研究。

丁 祥(1980—)，男，安徽宿州人，博士，教授，主要從事細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究。E-mail:biostart8083@126.com

Q939.5

A

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.03.006