秦玉璘 許洪濤 張璐璐 張金宇 姜遠英 曹永兵

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433)

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·論著·

轉錄因子Pho4參與白念珠菌藥物敏感性的調控

秦玉璘 許洪濤 張璐璐 張金宇 姜遠英 曹永兵

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，上海 200433)

目的 通過對缺失相應轉錄因子基因的白念珠菌進行抗真菌藥物敏感性的篩選，考察轉錄因子對白念珠菌耐藥性的影響及調控機制。方法 通過微量液基稀釋法、點板實驗 (Spot Assay)檢測實驗菌株對抗真菌藥物的敏感性。采用實時定量PCR (RT-PCR)的方法檢測白念珠菌耐藥性相關MDR1，CDR1以及ERG11的表達，并通過檢測菌株對羅丹明6G的外排能力進一步檢測菌株對抗真菌藥物的外排能力。結果 最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration,MIC)測定和Spot Assay實驗結果表明，與親本菌相比，PHO4基因缺失菌對氟康唑、咪康唑的敏感性顯著升高。雖然耐藥相關基因的表達增加，但對羅丹明6G的外排能力降低，抗氧化應激能力下降。結論 轉錄因子Pho4的缺失可能通過降低白念珠菌的抗氧化應激能力，減弱對藥物的外排作用而導致對唑類藥物敏感，但其具體的調控機制有待進一步研究。

白念珠菌；轉錄因子；藥物敏感性；藥物外排

[Chin J Mycol，2016，11(2):65-69]

白念珠菌作為一種條件致病真菌，在正常人體內可以長期、無害地共生，并與其他菌群保持平衡，機體自身的免疫力足以抵御白念珠菌的侵襲。當機體免疫力下降時，對白念珠菌的抵抗能力隨之下降，引發(fā)從皮膚黏膜表層到危及生命的系統(tǒng)性真菌感染。近年來，隨著癌癥放化療增加，獲得性免疫缺陷綜合征患者不斷增多，器官移植及外植性器械的廣泛應用使得免疫缺陷患者劇增，白念珠菌的感染率和死亡率不斷升高。臨床上用于治療念珠菌病的抗真菌藥物種類有限，其中氟康唑由于具有較高的生物利用度和較低的毒性，在臨床應用最為廣泛。然而，在長期的臨床治療中，白念珠菌逐漸對氟康唑產生耐藥性，大大降低了臨床治療的效果[1]。目前，在抗真菌藥物的研究中，探索真菌耐藥的機制對解決真菌耐藥問題、發(fā)現抗真菌藥物的新靶點具有重要意義。

白念珠菌在長期的演變中，逐步形成了多種唑類藥物耐藥機制，包括：①藥物作用靶酶突變，降低了對藥物的親和力，例如，編碼羊毛甾醇14α-去甲基化酶的基因ERG11的表達量增加使真菌細胞生長不受抑制。②藥物外排泵的過表達，包括易化擴散載體超家族 (major facilitator superfamily，MFS)及ABC轉運蛋白 (ATP-binding cassette transporters)兩大類[2]。③白念珠菌生物被膜的形成。④應激反應誘導耐藥基因表達。⑤轉錄因子參與調控耐藥基因的表達。隨著基因水平研究的深入發(fā)展，臨床上在對氟康唑耐受的菌株中發(fā)現普遍鋅簇轉錄因子突變的現象，這些轉錄因子包括：Mrr1[3],Tac1[3-4],Upc2[5]。除鋅簇轉錄因子外，有研究顯示白念珠菌堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子Cap1通過激活耐藥基因MDR1使白念珠菌出現耐藥表型[6]。轉錄因子Ndt80通過控制藥物外排泵CDR1的表達來調控白念珠菌對唑類藥物的耐受性[7]。轉錄因子參與調控白念珠菌耐藥性的相關研究對于從基因調控方面探索白念珠菌耐藥機制具有重要意義，為解決真菌耐藥問題提供了新思路。

本文通過篩選16株白念珠菌不同轉錄因子缺失菌，研究可能影響白念珠菌耐藥性的轉錄因子及未知的調控通路。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌 (Candidaalbicans)國際通用菌株ATCCMYA-2876 (SC5314)由美國華盛頓喬治敦大學 (Department of Microbiology and Immunology,Georgetown University,Washington,U.S.A.)William A.Fonzi教授惠贈。SN250及16株白念珠菌轉錄因子敲除菌由中國科學院上海生命科學院巴斯德所陳昌斌教授惠贈，菌株列表及敲除的轉錄因子見表1。

主要試劑 氟康唑注射液 (Fluconazole,FLC)購自Pfizer，咪康唑 (Miconazole,MCZ)購自Sigma；真菌RNAout試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，PrimeScriptTMRT Master Mix,2×SYBR Premix ExTaq均購自Takara；羅丹明6G (Rhodamine 6G)購自生工生物；藥物母液配置：氟康唑為注射劑，濃度為2 mg/mL，直接取用；咪康唑使用二甲亞砜 (dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解，配置成6.4 mg/mL儲備液，分裝后于-20℃長期貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 RT-PCR實驗中使用的引物序列

注：F.forward,R.reverse

培養(yǎng)基 RPMI 1640培養(yǎng)液：RPMI 1640 (Gibco BRL公司)10 g，NaHCO32 g，嗎啡啉丙磺酸 (morpholine propanesulfonic acid,MOPS,Sigma)34.5 g，加三蒸水900 mL溶解，用1 mol/L NaOH凋pH至7.0，定容至1 000 mL，過濾除菌，4℃保存。YPD培養(yǎng)液 (固體和液體)：蛋白胨20 g，酵母浸膏10 g，葡萄糖200 g，加三蒸水定容至1 000 mL，固體加2%瓊脂，高壓滅菌后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器 7500型熒光定量PCR儀 (ABI)，Multiskan MK3型酶標儀 (Thermo Scientific)，HZ-2111K-B型恒溫振蕩器 (太倉市華利達實驗設備有限公司)，Heraeus Fresco 21微量離心機 (Thermo Scientific)。

1.2 方法

抗白念珠菌藥物體外抑菌活性測定 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會 (CLSI)制定的M27-A方案。采用微量液基稀釋法測定實驗菌株的MIC80，取96孔板，將FLC注射液用RPMI 1640液體培養(yǎng)基倍比稀釋，藥物作用的最高濃度為64 μg/mL，最低濃度為0.125 μg/mL，每孔體積為100 μL，100 μL RPMI 1640液體培養(yǎng)基作為空白對照，100 μL菌液作為陽性對照，藥物作用的菌液濃度為1×103～5×103cells/mL。35℃孵育24 h，48 h測定實驗結果，MIC80為與陽性對照孔相比，菌株生長80%被抑制時對應的最低藥物濃度。實驗平行操作2～3次。

Spot Assay實驗測定藥物體外抑菌活性 配制含藥的YPD平板，氟康唑濃度為16 μg/mL、8 μg/mL和4 μg/mL，咪康唑濃度為8 μg/mL、4 μg/mL和2 μg/mL。挑取單克隆菌落于1 mL YPD液體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱，200 r/min振蕩培養(yǎng)，活化16 h。YPD調整菌液濃度為2×106cells/mL、2×105cells/mL、2×104cells/mL、2×103cells/mL和2×102cells/mL 5個濃度梯度，每種菌株，每個濃度梯度取5 μL點板。

羅丹明6G檢測藥物外排 于1 mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200 r/min振蕩活化菌株使其處于對數生長期。3 000 g離心5 min，用PBS洗3次后重懸，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，使細胞內的能量被耗盡。10 μmol/L羅丹明6G 30℃，200 r/min孵育細胞，1 h。用PBS洗去胞外的羅丹明6G，并調整菌濃度為5×107cells/mL，加入葡萄糖使終濃度達到2 mmol/L，分別在15 min，30 min，45 min，60 min，90 min取1 mL菌液，離心，取上清100 μL，測定熒光強度。

RT-PCR考察耐藥相關基因的轉錄水平 使用真菌RNAout試劑盒抽提菌株RNA并測定濃度和純度后按照Takara PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA，反應條件為：37℃ 15 min；85℃ 5 s；4℃冷卻。實時定量Real Time RT-PCR按SYBR Premix Ex Taq RR420A說明書中的體系 (20 μL)進行PCR反應，反應條件為：預變性98℃ 30 s；PCR反應95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；熔解曲線分析95℃ 30 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。實驗中使用的引物見表1。

使用ABI 7500 SDS軟件系統(tǒng)對實驗結果進行分析，RT-PCR實驗結果得到相應基因的Ct (threshold cycle)值。以actin作為內參，并以其Ct值校正目的基因的Ct值，得到ΔCt值。用Ratio值 (實驗組與對照組相比)表示基因表達差異，Ratio值=2(-ΔΔCt)。

生長曲線 于1 mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200 r/min振蕩活化菌株使其處于對數生長期。適當稀釋菌液，以YPD培養(yǎng)液調整菌液濃度，使OD630值為0.1。于5 mL上述菌液中加入H2O2，使其終濃度為16 μg/mL。30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12和24 h取樣100 μL，測定OD630值，以OD630值記錄菌株生長變化情況。

統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 5軟件對全部數據進行分析，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 藥物敏感性實驗

通過微量液基稀釋法初步檢測16株轉錄因子缺失菌對臨床常用抗真菌藥物氟康唑的敏感性。PHO4缺失菌在表2中用編號CC007表示，初步的藥敏實驗結果顯示，PHO4缺失菌與親本菌SN250相比，對氟康唑的敏感性顯著升高，24 h測得MIC80為0.25 μg/mL，48 h時測得MIC80為0.5 μg/mL。其余15株轉錄因子基因敲除菌的氟康唑藥敏篩選結果列在表3中。

表2 16株基因缺失菌缺失的轉錄因子名稱

表3 16株白念珠菌轉錄因子基因缺失菌對氟康唑的敏感性

Tab.3 The susceptibility of 16 TF deletionCandidaalbicansstrains to fluconazole

菌株MIC80(μg/mL)24h48h菌株MIC80(μg/mL)24h48hSC53140．50．5CC008>64>64SN2501616CC009>64>64CC001816CC010>64>64CC0021616CC011>64>64CC0031616CC01222CC00444CC013>64>64CC005416CC014>64>64CC0061616CC01516>64CC0070．250．5CC016>64>64

2.2 Spot Assay實驗

點板實驗考察PHO4基因缺失菌對氟康唑和咪康唑的敏感性，發(fā)現在YPD固體培養(yǎng)基上，pho4-/-對氟康唑和咪康唑均敏感，隨著氟康唑的濃度增加，敏感性增加，對16 μg/mL的氟康唑最敏感。然而，pho4-/-對咪康唑的敏感性明顯高于氟康唑，4 μg/mL和8 μg/mL咪康唑對pho4-/-均有明顯的抑制作用 (見圖1)。

2.3 羅丹明6G外排實驗

加入葡萄糖供能后60 min，隨著時間的延長，親本菌和突變株對羅丹明6G的外轉運增加。從加入葡萄糖15 min開始到90 min，PHO4敲除菌對羅丹明6G的外轉運能力低于親本菌SN250，PHO4敲除菌中藥物外排泵活性低于SN250 (見圖2)。

2.4 親本菌SN250和PHO4敲除菌中耐藥相關基因的表達水平

RT-PCR實驗結果顯示：PHO4缺失菌中多藥耐藥基因MDR1，CDR1的轉錄水平均高于親本菌SN250。唑類藥物的作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶的編碼基因ERG11在親本菌SN250及突變株中的轉錄水平無明顯差異 (見圖3)。

2.5 H2O2對菌株生長的影響

生長曲線實驗表明，16 μg/mL H2O2對PHO4基因缺失菌的生長有明顯的抑制作用，PHO4基因的缺失降低了白念珠菌對H2O2的耐受能力 (見圖4)。

圖1 點板實驗考察菌株在不同濃度氟康唑和咪康唑作用下的生長差異 圖2 考察SN250和pho4-/-對羅丹明6G的外排能力 圖3 SN250和pho4-/-中CDR1,MDR1和ERG11的表達 圖4 生長曲線結果:a.不加藥對照組,b.16 μg/mL過氧化氫實驗組

3 討 論

目前，臨床上廣泛應用的抗真菌藥物的耐藥現象日漸嚴重。白念珠菌產生耐藥現象的原因復雜，耐藥機制與多種因素有關。近年來，關于轉錄因子參與耐藥相關基因表達的調控逐漸深入，從分子水平給出了解決真菌耐藥問題的新途徑。

轉錄因子Pho4對白念珠菌在缺乏磷酸鹽的環(huán)境中生長是必須的，PHO4突變株在磷酸鹽缺乏的條件下發(fā)生廣泛的菌絲生長和顯著的毒力增加[8]。另有研究結果顯示，轉錄因子Pho4介導菌株對亞砷酸鹽的反應，但并未有該轉錄因子參與耐藥相關調節(jié)的報道。本研究應用經典的微量液基稀釋法對16株轉錄因子基因缺失菌的藥物敏感性進行了初步篩選，發(fā)現PHO4基因缺失菌對氟康唑的敏感性有明顯升高，揭示其可能參與了白念珠菌耐藥性的調控。Spot assay實驗在固體YPD培養(yǎng)基中檢測突變株對氟康唑，咪康唑的敏感性，發(fā)現缺失PHO4的白念珠菌對咪康唑的敏感性高于氟康唑。氟康唑和咪康唑作為臨床常用的抗白念珠菌感染藥物，均通過影響真菌細胞膜重要成分麥角甾醇的生物合成，即抑制ERG11編碼的羊毛甾醇14α-去甲基化酶發(fā)揮藥理作用。為進一步探究PHO4參與調控耐藥的分子機制，通過RT-PCR實驗考察了ERG11的轉錄水平，并未發(fā)現PHO4缺失后顯著影響ERG11的表達。而羅丹明外排實驗顯示，與親本菌SN250相比，PHO4缺失菌對羅丹明6G的外排能力減弱，與其對唑類藥物的敏感性增加結果一致，但PHO4缺失菌中MDR1和CDR1的轉錄水平反而有增加。

為什么多藥耐藥基因表達增加，但藥物外排能力卻下降？為進一步探索其機制，本研究進一步考察了缺失菌的抗應激能力。

通過考察菌株在含H2O2培養(yǎng)基中的生長曲線，比較PHO4缺失菌與親本菌的敏感性，結果顯示PHO4缺失菌對H2O2的敏感性顯著增加，表明其抵抗氧化應激的能力下降。過氧化氫、金屬和非金屬鹽、溫度變化、滲透壓、營養(yǎng)物質缺乏、藥物作用等都是刺激白念珠菌產生應激反應的因素，而應激反應能力的改變也是藥物敏感性改變的原因之一[9-10]。已有的研究結果揭示缺失轉錄因子Pho4的白念珠菌對亞砷酸鹽和砷酸鹽敏感，與白念珠菌中HOG通路的激活狀態(tài)有關，該通路的激活參與調控砷酸鹽脫毒相關基因的轉錄水平。HOG通路是白念珠菌應對外界壓力，產生應激反應的主要通路[11-12]。缺失轉錄因子Pho4導致白念珠菌對砷酸鹽敏感，HOG通路受到抑制，Pho4的表達量增多則會促進Hog1的磷酸化，激活HOG通路[13]。因此推測，PHO4缺失菌對唑類藥物的敏感性增加也可能與其HOG通路被抑制，使其抗應激能力下降，導致藥物外排能力減弱有關。白念珠菌對藥物敏感性的調節(jié)涉及多種機制，對于Pho4參與耐藥調控的機制還有待于進一步研究。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Transcription factor Pho4 is involved in the regulation of drug susceptibility ofCandidaalbicans

QIN Yu-lin,XU Hong-tao,ZHANG Lu-lu,ZHANG Jin-yu,JIANG Yuan-ying,CAO Yong-bing

(CenterforNewDrugResearch,CollegeofPharmacy,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To study the influence ofCandidaalbicanstranscription factors (TFs) on drug susceptibility and the relevant regulating mechanisms,a screening of a TF deletion mutant library had been conducted.Methods The broth microdilution method and spot assay were used to determine the susceptibility of TF deletion strains.The expression of multidrug resistance genesMDR1,CDR1 andERG11 were examined by real-time PCR,and the analysis of rhodamine 6G efflux was performed to evaluate the efflux pump activity.Results The measurement of drug minimal inhibitory concentration and spot assay indicated an increase of susceptibility to fluconazole and miconazole inPHO4 deleted mutant compared to the parental strain.Although the mutant had a higher expression of the drug resistance genes,the amount of rhodamine 6G efflux and the oxidative stress resistance of it were lower than the parental strain.Conclusion Deletion ofPHO4 inC.albicansmight cause a decrease in oxidative stress resistance and drug efflux ability,finally result in hypersusceptibility to antifungal drugs.

Candidaalbicans;transcription factor;drug susceptibility;drug efflux

國家自然科學基金 (812735560)，國家重點基礎研究973計劃 (2013CB531600)

秦玉璘，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:1257305289@qq.com

曹永兵，E-mail:ybcao@vip.sina.com；姜遠英，E-mail:13761571578@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0065-05

2016-02-27