金曉盛 許先榮 李國平 金前 陳海娥 邵美琴

促紅細(xì)胞生成素后處理減輕大鼠再灌注損傷肺細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制

金曉盛 許先榮 李國平 金前 陳海娥 邵美琴

目的 探討促紅細(xì)胞生成素后處理在減輕肺缺血/再灌注損傷（LIRI）大鼠肺細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。方法 健康雄性成年SD大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，每組8只，即假手術(shù)對(duì)照組（C組）、缺血/再灌注(IR)組、促紅細(xì)胞生成素（EPO）組、EPO+溶劑對(duì)照組（PPCES溶液）（P組）和EPO+SP600125（SP組），通過阻斷左肺門制作動(dòng)物模型并予相應(yīng)處理。原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)肺細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）；RT-PCR法、免疫組化法測(cè)定肺組織Bcl-2、Bax基因和蛋白的表達(dá)；光鏡下觀察肺組織的病理變化及測(cè)定肺泡損傷數(shù)（IQA）。結(jié)果 與C組比較,IR組肺組織IQA顯著升高，AI顯著升高，Bcl-2基因和蛋白表達(dá)明顯下降，Bax基因和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax的比值降低（均P＜0.05），肺組織形態(tài)學(xué)發(fā)生異常改變；與IR組比較，EPO組、P組、SP組的IQA顯著降低，AI顯著降低，Bcl-2基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax基因和蛋白和表達(dá)下降，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05），肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)異常改變有所減輕；與EPO組比較，SP組的IQA降低，AI顯著降低，Bcl-2基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax基因和蛋白表達(dá)下降，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05），SP組的肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)損傷較EPO組減輕。結(jié)論 EPO后處理能減輕LIRI，其機(jī)制可能通過抑制JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，上調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，使肺組織細(xì)胞凋亡減少，改善其結(jié)構(gòu)。

促紅細(xì)胞生成素 后處理 再灌注損傷 肺 細(xì)胞凋亡

近年來，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的迅猛發(fā)展，肺動(dòng)脈袖狀切除、肺移植、體外循環(huán)手術(shù)、肺溶栓治療等新的醫(yī)療技術(shù)不斷地建立，但肺缺血/再灌注損傷（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）仍是早期高發(fā)病率、高病死率的主要原因，也是手術(shù)失敗的重要原因之一。C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal Kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族的重要成員，其介導(dǎo)體內(nèi)多種內(nèi)源性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在某些因子、紫外線、DNA損傷因子等刺激作用下可被強(qiáng)烈激活[1]。已有大量研究表明，JNK在心、肝缺血/再灌注（ischemia reperfusion，IR）中被激活，引起組織損傷和細(xì)胞凋亡。促紅細(xì)胞生成素（EPO）是一種腎臟分泌的酸性糖蛋白類激素，可選擇性地刺激骨髓中造血干細(xì)胞增生分化，促進(jìn)成熟紅細(xì)胞的生成。研究證實(shí)EPO對(duì)心、肝、腎、小腸、腦等臟器的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）提供組織保護(hù)作用[2]。本實(shí)驗(yàn)意在探討EPO后處理對(duì)肺IR是否有保護(hù)作用，以期為臨床減輕LIRI提供理論基礎(chǔ)，改善肺切除及肺移植等患者的預(yù)后。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性成年SD大鼠40只，體重200～250g；由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（2010-0150），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并同意實(shí)施。Trizol購自美國invitrogen公司，PCR Mix購自天根生化科技（北京）有限公司，原位凋亡細(xì)胞檢測(cè)TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司，cDNA試劑盒購自美國Fermentas公司，Bax、Bcl-2鼠多克隆抗體購自美國Santa cruz公司，即用型SABC過氧化物酶試劑盒購自武漢博士德公司，EPO購自沈陽三生制藥股份有限公司，SP600125購自美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制作 按隨機(jī)數(shù)字表法將40只實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組，每組8只。（1）假手術(shù)對(duì)照組（Control，C組）：左肺門游離后留置阻斷帶,觀察2.5h；（2）IR組：阻斷左肺門30min后開放再灌注2h；（3）EPO組：左肺門于缺血后在再灌注開始時(shí)予以尾靜脈注射外源性EPO 3 000U/kg，其余處理同I/R組；（4）EPO+溶劑對(duì)照組（PPCES溶液，即30%聚乙二醇+20%聚丙烯乙二醇+15%聚氧乙烯蓖麻油+5%乙醇+30%0.9%氯化鈉溶液）（P組）：缺血前給予7.5ml/kg體重的PPCES溶液，余同EPO組；（5）EPO+SP600125組（SP組）：SP600125為JNK的特異性抑制劑，缺血前尾靜脈注射10mg/kg SP600125溶液（10mg SP600125溶于7.5mlPPCES溶液），余同EPO組。

1.3 動(dòng)物模型復(fù)制 按照已發(fā)表文獻(xiàn)復(fù)制大鼠原位肺IR模型[3]。40只實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔內(nèi)注射5%水合氯醛（0.7ml/100g），麻醉后行氣管切開插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)，行機(jī)械通氣。取頸前正中切口，暴露分離出右側(cè)頸動(dòng)脈和氣管。沿左胸骨暴露胸腔及左肺門，穿過阻斷帶，當(dāng)靜息5min后，在呼氣末用阻斷線阻斷左肺門，于30min后開放，然后予以再灌注120min。

1.4 光學(xué)顯微鏡下病理形態(tài)學(xué)觀察 從40只大鼠左肺中分別取1.5cm×1.5cm×1.5cm的肺組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，24h后脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度約5μm，HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.5 肺泡損傷數(shù)測(cè)定 在200倍視野的光鏡下連續(xù)觀察20個(gè)視野，計(jì)算損傷肺泡數(shù)占計(jì)數(shù)肺泡總數(shù)百分比（按Murata方法[4]：肺泡內(nèi)含紅細(xì)胞和白細(xì)胞超過2個(gè)以上的損傷肺泡數(shù)占總計(jì)肺泡數(shù)的百分比），即肺泡損傷數(shù)比值（IQA），作為肺泡損傷的定量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.6 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法測(cè)定肺組織細(xì)胞凋亡依據(jù)文獻(xiàn)[5]，采用Roche公司提供的試劑盒說明書所述方法進(jìn)行操作。凋亡細(xì)胞核經(jīng)DAB染色呈棕褐色，未凋亡細(xì)胞胞核復(fù)染后呈藍(lán)紫色。計(jì)算5個(gè)高倍視野（×400）下的凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。每張片子至少觀察500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每100個(gè)細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞，即凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.7 免疫組織化學(xué)（SABC法）的方法測(cè)定肺組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平 按照試劑盒所提供的說明書和文獻(xiàn)[6]中所述步驟進(jìn)行操作。標(biāo)本上呈棕褐色顯色的部分為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)。采用美國IPP6.0彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽性部位及背景的光密度（optical density，OD）值，以陽性部位的光密度值減背景的光密度值代表陽性部位的OD值。

1.8 RT-PCR法檢測(cè)肺組織Bcl-2、Bax基因的表達(dá)Trizol法提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA的過程參照試劑說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體積25μl：模板cDNA1μl，上下游引物各1μl，PCRmix12.5μl，加雙蒸水至25μl。反應(yīng)條件：94℃變性3min，然后以94℃30s，退火B(yǎng)cl-2為61.6℃30s，Bax為55℃30s，延伸72℃1min，循環(huán)次數(shù)：Bcl-2為33次，Bax為30次，最后72℃5min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCT產(chǎn)物，溴乙錠顯色，用凝膠成像分析儀紫外燈進(jìn)行攝像分析，灰度掃瞄，用gelpro analyze分析軟件分析電泳圖，用內(nèi)參β-actin的灰度值校正計(jì)算Bcl-2或Bax基因的相對(duì)含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均采用表示；多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性者多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet′s t檢驗(yàn)。雙變量的相關(guān)性分析采用Bivariate過程的Pearson相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下肺組織形態(tài)學(xué)的變化 C組：肺間質(zhì)及肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，未見明顯炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤。IR組：肺間質(zhì)增寬水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)可見較多紅細(xì)胞滲出，偶可見肺部實(shí)性變，損傷明顯。EPO組、P組：與IR組比較，肺組織細(xì)胞損傷明顯減輕，肺間質(zhì)水腫減輕，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞滲出減少，炎癥細(xì)胞聚集減少。SP組：肺組織細(xì)胞損傷較EPO組減輕，肺間質(zhì)水腫減輕，少量炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤。詳見圖1。

圖1 各組大鼠左肺組織光鏡下形態(tài)學(xué)改變（HE染色，×100）

2.2 5組大鼠肺組織IQA、AI和Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax 蛋白及基因的比較 見表1。

表1 5組大鼠肺組織IQA、AI和Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax蛋白及基因的比較（n=8）

由表1可見，與C組比較，IR組IQA顯著升高（P＜0.05）；與IR組相比，EPO組、P組、SP組的IQA顯著降低（均P＜0.05）；與EPO組比較，SP組的IQA顯著降低（P＜0.05）。

圖2 TUNEL法示各組肺組織細(xì)胞凋亡情況（DAB染色，×400）

IR組AI顯著高于C組（P＜0.05），EPO組、P組、SP組AI顯著低于IR組（均P＜0.05），SP組的AI值顯著低于EPO組（P＜0.05）（圖2）。與C組比較，IR組Bcl-2基因及蛋白表達(dá)明顯下降，Bax明顯上調(diào)，同時(shí)Bcl-2/ Bax的比值降低（均P＜0.05）；與IR組相比，EPO組、P組、SP組Bcl-2基因及蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bax表達(dá)減弱，Bcl-2/Bax的比值增高（均P＜0.05）；與EPO組比較，SP組Bcl-2基因及蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax下降，同時(shí)Bcl-2/Bax的比值升高（均P＜0.05）（圖3-4）。

圖3 免疫組化法示各組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平（DAB染色，×200）

圖4 免疫組化法示各組織Bax蛋白表達(dá)水平（DAB染色，×200）

2.3 相關(guān)性分析 肺組織細(xì)胞AI與IQA呈正相關(guān)（r= 0.968，P＜0.01），與Bcl-2/Bax蛋白比值呈負(fù)相關(guān)（r= -0.869，P＜0.01），與Bcl-2/Bax基因比值呈負(fù)相關(guān)（r= -0.745，P＜0.01）。

3 討論

細(xì)胞凋亡又被稱為程序化細(xì)胞死亡，是細(xì)胞接受某種信號(hào)后或受到某些因素刺激后的一種主動(dòng)的，由一些凋亡相關(guān)基因相互作用的細(xì)胞死亡過程。近年來，國內(nèi)外學(xué)者的大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡參與了LIRI[7]。本實(shí)驗(yàn)中，IR組AI較C組明顯升高，IQA較C組升高，肺組織損傷較C組嚴(yán)重，這些充分證明細(xì)胞凋亡可能是肺IR的機(jī)制。

Ng等[7]報(bào)道，觸發(fā)細(xì)胞凋亡的途徑主要有死亡受體途徑（外源性途徑）和線粒體-細(xì)胞色素C（cytochrome c，Cyt-c）途徑（內(nèi)源性途徑）。其中外源性途徑通過特定的受體-配體相互作用，比如Fas/Fas-L、血管緊張素Ⅱ和TNF/受體，導(dǎo)致一系列的細(xì)胞內(nèi)凋亡級(jí)聯(lián)激活主要是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）；內(nèi)源性途徑主要是通過Bcl-2家族基因中的促凋亡基因Bax作用于線粒體膜表面，使其通透性改變，Cyt-c和凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）釋放，凋亡小體形成，激活caspases家族，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡與否主要是細(xì)胞內(nèi)的促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2相互作用，Bcl-2占優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞存活，Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)細(xì)胞走向凋亡[8-9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：肺IR時(shí)，Bcl-2基因及蛋白表達(dá)下降，Bax基因及蛋白表達(dá)均升高，且Bcl-2/Bax比值下降；AI與Bcl-2/Bax基因及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]；而肺EPO組中，Bcl-2基因及蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax基因及蛋白表達(dá)下降，AI減少，光鏡下顯示肺組織結(jié)構(gòu)損傷減輕，IQA值降低，結(jié)果表明了肺EPO后處理可減輕肺IR的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡。

隨著近年來對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的日益加深，MAPKs家族對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用受到日益重視。MAPKs家族是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。更多的研究表明MAPKs家族在肺IR及其所致的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了不可忽視的作用[11-12]。JNK是MAPKs家族重要的成員，已有研究表明其參與了多種組織器官的IR損傷[13]。SP600125為JNK特異性抑制劑，在心臟IR時(shí)應(yīng)用SP600125可以減輕IR引起的組織損傷和細(xì)胞凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用EPO和SP600125后，肺組織AI值降低，抗凋亡基因Bcl-2占優(yōu)勢(shì)，肺組織損傷和凋亡細(xì)胞數(shù)減少，即SP600125增強(qiáng)了EPO對(duì)肺IR的保護(hù)作用。這充分說明了EPO很可能是通過抑制JNK來對(duì)肺IR進(jìn)行保護(hù)的。

綜上所述，EPO后處理對(duì)IR引起的肺損傷具有保護(hù)作用，可能與其抑制JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，上調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值來抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[1]Hommes D W,Peppelenbosch M P,van Deventer S J.Mitogenactivated protein(MAP)kinase signal transduction pathways and novelanti-inflammatory targets[J].Gut,2003,52(1):144-151.

[2]徐鑫梅,梁國標(biāo),易清平,等.低劑量促紅細(xì)胞生成素減輕急性腎損傷后的慢性纖維化病變[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2013,30(3):579-580.

[3]李奎,白育庭.單次與多次缺血后處理對(duì)肺缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床外科雜志,2008,16(5):341-343.

[4]Murata T,Nakazawa H,Mori I,et al.Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis [J].Am Rev Respir Dis,1992,146(4):1048-1053.

[5]邱曉曉,宋張娟,王萬鐵,等.三七總皂苷對(duì)肺缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡及c-Jun氨基末端激酶的影響[J].生理學(xué)報(bào),2010,34(6):135-141.

[6]洪加林,鄭艷蓉,王萬鐵,等.細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路對(duì)大鼠再灌注損傷肺細(xì)胞凋亡的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)雜志,2009,14(10): 1137-1141.

[7]Ng C S,Wan S,Yim A P.Pulmonary ischaemia-reperfusion injury: role ofapoptosis[J].Eur Respir J,2005,25(2):356-363.

[8]魯建軍,翁慧雯,馬俊,等.缺血后處理對(duì)供體犬肺組織細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2013,34(1):53-58.

[9]Vairano M,Russo C D,Pozzoli G,et al.Erythropoietin exerts anti-apoptotic effects on rat microglial cells in vitro[J].Eur J Neurosci,2002,16(3):584-590.

[10]王彤,劉存志,劉玉珍,等.Bcl-2/Bax基因調(diào)控機(jī)體細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志,2008,28(16):1658-1660.

[11]Zhang X,Bedard E L,Potter R,et al.Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription afterischemia-reperfusion lung injury[J].Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 2002,283(4):L815-L829.

[12]王文,任玲,王建楠.MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2010,5(15):260-261.

[13]趙珊,馬迎春,劉亞坤,等.姜黃素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK通路過度活化減輕小鼠肺缺血再灌注損傷[J].中國病理生理雜志,2013,29 (2):308-313.

[14]王偉濤,曹勝利,方紅波,等.SP600125對(duì)腦死亡大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2015,32(4):805-807.

Erythropoietin postconditioning attenuates pneumocyte apoptosis after lung ischemia/reperfusion in rats

JIN Xiaosheng,XU Xianrong, LI Guoping,et al. Department of Respiratory Medicine,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China

Objective To investigate the effects oferythropoietin (EPO)postconditioning on pneumocyte apoptosis in lung ischemia/reperfusion injury(LIRI)of rats and its mechanisms. Methods Adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups(n=8 in each group):control group(C),Lung ischemia/reperfusion group(IR),EPO+IR group(EPO),EPO+solvent control group(P),EPO+SP600125 group(SP).At the end of experiments the animals were sacrificed and lung samples were collected.The apoptosis index(AI)of pneumocytes was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end abeling(TUNEL)method;the expressions of Bcl-2 and Bax mRNA and proteins were measured by RT-PCR and quantitative immunohistochemistry,respectively.The pathologicalchanges of lung tissue were observed under light microscope and the index ofquantitative assessment(IQA)ofhistologicallung injury was counted. Results Compared with C group,IQA and AIin IR group were increased,the expression ofBcl-2 was decreased,the expression ofBax was increased and Bcl-2/Bax was decreased(P＜0.05);there were abnormal morphological changes under the light microscope.Compared with IR group,IQA and AI were decreased in EPO,P and SP groups,the expression of Bcl-2 was increased,Bax was decreased and Bcl-2/Bax was increased (P＜0.05);the morphological changes markedly reversed in EPO,P and SP groups.There were no significant differences in all indexes between P and EPO groups(P＞0.05).Compared with EPO group,IQA and AI of SP group were decreased,the expression of Bcl-2 was increased,Bax was decreased and Bcl-2/Bax was increased(P＜0.05);the abnormal morphological changes in SP group were milder than those in EPO group. Conclusion Erythropoietin postconditioning may attenuate pneumocyte apoptosis in lung ischemic/reperfusion injury by inhibiting activation of JNK signal transduction pathway,andup-regulating Bcl-2 expression and down-regulating Bax expression.

Erythropoietin Postconditioning Reperfusion injury Lung Apoptosis

2015-09-14）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2012-XK-A28）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20120001）

310012 杭州，浙江省立同德醫(yī)院呼吸內(nèi)科（金曉盛、許先榮、李國平、金前）；溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所（陳海娥）；溫州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科（邵美琴）

金曉盛，E-mail：jxs19791109@163.com