王佳 謝健 陳岳明 高力舒 張海生

●論 著

羅布麻葉總黃酮提取物對(duì)抑郁模型大鼠抗抑郁作用的研究

王佳 謝健 陳岳明 高力舒 張海生

目的 探討羅布麻葉（AVL）總黃酮提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性抑郁大鼠的抗抑郁作用。方法 將105只大鼠隨機(jī)分為7組，每組15只。正常對(duì)照組：僅給予0.9%氯化鈉溶液；抑郁模型組：抑郁造模開(kāi)始時(shí)給予0.9%氯化鈉溶液；抑郁大鼠AVL總黃酮提取物低、高劑量預(yù)防組（40mg/kg、80mg/kg）：抑郁造模前1周灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，直至造模結(jié)束；抑郁大鼠AVL總黃酮提取物低、高劑量治療組（40mg/kg、80mg/kg）：于抑郁造模后1周灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，直至造模結(jié)束；抑郁大鼠氟西汀治療組（20mg/kg）：抑郁造模后1周予灌胃給藥，直至造模結(jié)束。采用慢性不可預(yù)知性輕度應(yīng)激（CUMS）方法建立抑郁模型。觀察應(yīng)激前后各組大鼠礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程的差異；液質(zhì)聯(lián)檢分析各組大鼠在應(yīng)激前后腦內(nèi)海馬及前額葉皮層單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，包括去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羥色胺（5-HT）水平的變化。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，抑郁模型組大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程均明顯減少（均P＜0.01）；與抑郁模型組比較，氟西汀組垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程均明顯增加（均P＜0.01）；AVL總黃酮提取物預(yù)防和治療各組，與抑郁模型組相比，垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程均有增加，尤以高劑量預(yù)防組增加最為明顯（P＜0.01）。與正常對(duì)照組相比，抑郁模型組在大鼠海馬組織及前額葉皮層均有DA、NE、5-HT水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；氟西汀組與抑郁模型組比較，海馬組織DA、5-HT水平明顯增高（P＜0.01），前額葉皮層DA、NE、5-HT水平均增高（均P＜0.05或0.01）；AVL總黃酮提取物高劑量預(yù)防組與抑郁模型組比較，海馬組織5-HT水平增高（均P＜0.01），前額葉皮層DA、NE、5-HT水平均增高（均P＜0.05）。結(jié)論 AVL總黃酮提取物具有抗大鼠抑郁作用，有劑量-效應(yīng)關(guān)系，高劑量預(yù)防組抗抑郁效應(yīng)與氟西汀治療組相似，可能通過(guò)提高大鼠海馬組織5-HT及前額葉皮層NE、DA、5-HT水平達(dá)到抗抑郁作用。

羅布麻葉總黃酮 抑郁 單胺遞質(zhì)

抑郁癥發(fā)病機(jī)制仍不清楚，抗抑郁癥治療的西藥主要通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)突觸間隙單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度，平衡單胺類(lèi)神經(jīng)的功能而發(fā)揮治療效應(yīng)，但是在治療中存在反應(yīng)延遲及有效率低的問(wèn)題，且不良反應(yīng)多、價(jià)格昂貴、患者對(duì)西藥服藥依從性差等弊端。中藥治療抑郁癥具有多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)，成為近年研究熱點(diǎn)。羅布麻葉（Apocynum venetum leaves，AVL）為夾竹桃科茶葉花屬植物羅布的葉，其作茶飲及藥用有悠久的歷史，具有清熱利水、平肝安神的功能，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗抑郁活性[1]。然而，目前對(duì)于其抗抑郁作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用慢性不可預(yù)知性輕度應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）的方法建立大鼠抑郁模型，以抗抑郁藥氟西汀為對(duì)照組，比較不同劑量AVL總黃酮提取物對(duì)抑郁模型大鼠行為學(xué)及對(duì)腦內(nèi)單胺類(lèi)物質(zhì)表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 成年Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠[SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003，湖南斯萊克景達(dá)有限公司]105只，體重190～210g。食物與水充足供給，自由攝取，飼養(yǎng)室溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度維持在50%，晝夜節(jié)律為12h（光照時(shí)間7:00～19:00）。本研究對(duì)動(dòng)物所有的實(shí)驗(yàn)操作均遵守中國(guó)國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。鹽酸氟西汀分散片（禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)J20120001，規(guī)格：20mg/片）；AVL總黃酮提取物（陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：LBM130213），干粉劑，黃酮含量在95%以上。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 105只大鼠隨機(jī)分為7組，每組15只。正常對(duì)照組（A組）：不給予任何刺激，僅給予0.9%氯化鈉溶液；抑郁模型組（B組）：抑郁造模開(kāi)始時(shí)給予0.9%氯化鈉溶液；抑郁大鼠AVL總黃酮提取物低、高劑量預(yù)防組（40mg/kg、80mg/kg）（C、D組）：抑郁造模前1周灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，直至造模結(jié)束；抑郁大鼠AVL總黃酮提取物低、高劑量治療組（40mg/kg、80mg/ kg）（E、F組）：于抑郁造模后1周灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，直至造模結(jié)束；抑郁大鼠氟西汀治療組（20mg/kg）（G組）：抑郁造模后1周予灌胃給藥，直至造模結(jié)束。

1.2.2 抑郁大鼠模型 參照Willner等[2]方法，以CUMS建立抑郁動(dòng)物模型。B、C、D、E、F、G各組大鼠在4周內(nèi)接受各種溫和應(yīng)激，包括：晝夜顛倒24h、電激（控制電壓至45V，每隔50s刺激1次，每次刺激10s，共30次）、禁食24h、禁水24h、熱刺激（45℃環(huán)境刺激10min）、傾斜30°過(guò)夜。每天只給予1種刺激因子，且每種刺激因子累計(jì)使用2～3次。為避免大鼠產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，每種刺激因子隨機(jī)給予，使大鼠不能事先預(yù)料何種刺激的發(fā)生。

1.2.3 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)前剔除自發(fā)活動(dòng)能力差異較大的大鼠，每組選取10只。應(yīng)激開(kāi)始前1d和應(yīng)激結(jié)束后（即第4周）各進(jìn)行1次曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。室內(nèi)隔音，將大鼠放入44cm×44cm×47cm曠場(chǎng)箱的中心，測(cè)定5min水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分。大鼠總運(yùn)動(dòng)距離更能客觀、直接地反應(yīng)動(dòng)物的興奮程度[3]，因此以大鼠總運(yùn)動(dòng)距離作為水平活動(dòng)得分，以?xún)汕爸x地直立的次數(shù)為垂直活動(dòng)得分。

1.2.4 組織樣品的處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死，冰上取腦，取前額葉皮層及海馬組織50mg，加入2倍重量的蒸餾水，在勻漿器中勻漿5min獲得均一的組織勻漿液。取組織勻漿液100μl，分別加入含內(nèi)標(biāo)尼莫地平（40ng/ml）的乙腈溶液0.3ml，渦旋混合2min，離心13 000r/min，10min，取上清液置另一試管中，在減壓離心濃縮儀中揮干溶劑，殘?jiān)尤?00μl流動(dòng)相復(fù)溶，離心13 000r/ min，10min，取上清液10μl進(jìn)行分析，檢測(cè)各組大鼠前額葉皮層及海馬組織的去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羥色胺（5-HT）水平。

1.2.5 檢測(cè)儀器及色譜條件 采用Agilent 1260+AB Sciex 4000+液質(zhì)聯(lián)用儀。色譜條件：色譜柱型號(hào)：ZORBAX Extend C18（2.1×100mm，3.5m，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相：乙腈-水-甲酸（75∶25∶0.1，v/v/v）；流速：0.3ml/ min；色譜柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源（Turbo Ionspray）；離子源噴射電壓為5 500V；溫度為550℃；離子源氣體1（GAS1）壓力為50psi；離子源氣體2（GAS2）壓力為50psi；氣簾氣體（CUR）壓力為30psi；電離模式：電噴霧電離，ES+；去簇電壓（DP）分別為33 eV（NA）、68 eV（DA）、67eV（5-HT）和72eV（內(nèi)標(biāo)尼莫地平）；碰撞電壓（CE）分別為9eV（NA），13eV（DA），15eV（5-HT）和13eV（尼莫地平）；掃描方式為選擇離子監(jiān)測(cè)（MRM），用于定量分析的離子為m/z 169.8→151.7（NA），m/z 154.1→136.9（DA），m/z 177.0→159.8（5-HT），m/z 419.5→343.2（IS）掃描時(shí)間為200ms。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠應(yīng)激前后曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程的比較 與A組相比，B組大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；AVL總黃酮提取物干預(yù)后，C、D、E、F各組垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程均高于B組，并且隨著給藥劑量增加，各自主活動(dòng)增加更為明顯，E組垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），尤以D組增加最為明顯（P＜0.01）；G組與B組比較，垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠應(yīng)激前后礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)及水平運(yùn)動(dòng)總路程的比較

2.2 各組大鼠腦組織內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的結(jié)果 與A組相比，B組在大鼠海馬及前額葉皮層DA、NE、5-HT水平均有下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與B組比較，D組大鼠海馬組織5-HT水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），前額葉皮層DA、NE、5-HT水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；G組海馬組織DA、5-HT水平均高于B組（均P＜0.01），前額葉皮層DA、NE、5-HT水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），詳見(jiàn)表2、3。

表2 各組大鼠海馬組織單胺類(lèi)遞質(zhì)水平的比較（ng/g）

表3 各組大鼠前額皮層單胺類(lèi)遞質(zhì)水平的比較（ng/g）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制假說(shuō)尚無(wú)定論，目前存在多種假說(shuō)，而單胺假說(shuō)是迄今為止研究最多、也是研究最深入的。該假說(shuō)認(rèn)為抑郁癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是神經(jīng)細(xì)胞突觸間隙的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA的減少與缺乏，經(jīng)抗抑郁藥物治療后，可以升高大鼠腦內(nèi)該類(lèi)物質(zhì)水平從而達(dá)到治療抑郁癥的目的[4]。因此對(duì)抑郁動(dòng)物腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定，成為了篩選抗抑郁藥物的重要指標(biāo)。鄭梅竹等[5]研究表明，AVL總黃酮提取物有與氟西汀相似的抗抑郁作用，AVL總黃酮提取物能使抑郁大鼠海馬組織DA和NE水平明顯上升，而5-HT水平無(wú)明顯變化；同時(shí)給予AVL總黃酮提取物與DA受體（D1、D2受體）阻滯劑或NE受體（α1、α2、αβ受體）阻斷劑后能產(chǎn)生抑郁樣行為，明顯延長(zhǎng)懸尾小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，由此提出AVL總黃酮提取物抗抑郁作用與DA及NE受體系統(tǒng)有關(guān)[6-7]。

Papakostas等[8]曾行薈萃分析研究表明選擇性5-羥色胺去甲腎上腺素再攝取抑制劑（SNRIs）對(duì)抑郁癥的治療反應(yīng)優(yōu)于選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs）。而目前亦認(rèn)為具有多種藥效活性的抗抑郁藥物會(huì)產(chǎn)生更廣譜的療效。氟西汀是一種SSRI，但與其它SSRIs不同，能有效緩解“正性情感降低”癥狀，如喪失愉快感、喪失興趣、精力不足、過(guò)度睡眠、注意力不集中等，這種激活作用，可能與其5-HT2C拮抗作用有關(guān)，可致NE和DA釋放脫抑制，前額葉皮層NE和DA釋放增加[9]。本研究顯示，AVL總黃酮提取物有抗抑郁作用，尤其高劑量預(yù)防給藥，其抗抑郁效應(yīng)與氟西汀相似。此外，本研究結(jié)果顯示，AVL總黃酮提取物除了增高海馬組織的5-HT水平，還能升高前額葉皮層的DA、NE、5-HT水平，推測(cè)其與氟西汀相似的激活作用，作為三重神經(jīng)遞質(zhì)作用的抗抑郁藥物能全面改善抑郁癥狀。研究結(jié)果與鄭梅竹報(bào)道中的差異，可能與樣本量及腦組織部位是否精確選取有關(guān)。

綜上所述，AVL總黃酮提取物具有抗抑郁作用，能全面改善抑郁癥狀，可用于抑郁癥的二級(jí)預(yù)防，降低發(fā)病或復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

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Antidepressant effect of flavonoids extracted from Apocynum venetum leaves in rat model of depression

WANG Jia,XIE Jian,CHEN Yueming,et al.Department of Clinical Psychology,Hangzhou First People's Hospital，Hangzhou 310006,China

Objective To study the antidepressant effect and underlying mechanism of flavonoids extracted from Apocynum venetum leaves(AVL-extracts)in rat depression model． Methods The rat depression model was induced by the method of chronic unpredictable mild stress(CUMS).The open field test was used to evaluate the antidepressant effect of AVL-extracts.The rats were randomly divided into seven groups:control group,depression model group,low dose AVL-extracts prevention group (40mg/kg),high dose AVL-extract prevention group (80mg/kg),low dose AVL-extract treatment group (40mg/kg),high dose AVL-extract treatment group(80mg/kg)and fluoxetine treatment group.LC-MS/MS method was used to assay the levels of monoamine neurotransmitters,including norepinephrine (NE)，serotonin (5-HT)and dopamine (DA)in the hippocampus and the prefrontal cortex of rats. Results The open filed activities decreased significantly in the depression model group including horizontal movements and vertical movements with comparison to the normal group (P＜0.01).The autonomic activitiesincreased significantly after preventive administration of high dose AVL-extracts (P＜0.01).The antidepressant effect of AVL-extracts was similar to that of fluoxetine in increasing the autonomic activities.The levels of NE，DA and 5-HT in the brain of depressive rats were significantly lower than those in control group，whereas the levels of those in AVL-extract administration groups were higher than those in depressive group(P＜0.05).The effect was more significant in the high dose AVL-extract prevention group,and in which the level of 5-HT in the hippocampus and the levels of DA,NE and 5-HT in the prefrontal cortex were significantly increased(P＜0.01,P＜0.05,respectively)．These changes were also observed in fluoxetine administration group. Conclusion The study suggests that AVL-extracts have antidepressant effects on rat depres-sion model,which is associated with the reverse of monoamine neurotransmitters levels in rat brain tissue.

Apocynum venetum Depression Monoamine neurotransmitters

2015-07-01）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012c33005）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012ZQ020）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院心理科（王佳、謝健、高力舒、張海生），檢驗(yàn)科（陳岳明）

謝健，E-mail：srxjian@163.com