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(1.南華大學附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬南華醫(yī)院脊柱外科)

·基礎醫(yī)學·

二甲雙胍聯(lián)合異羥肟酸對骨肉瘤細胞增殖凋亡的影響

申瑩瑩1，蘇小桃2，歐軍2，何俊2*

(1.南華大學附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬南華醫(yī)院脊柱外科)

目的研究二甲雙胍(Met)聯(lián)合異羥肟酸(SAHA)應用對人骨肉瘤細胞MG-63增殖和凋亡的影響。

方法MTS法分別檢測二甲雙胍、SAHA和二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細胞生長的抑制作用；平板克隆實驗檢測二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細胞克隆形成能力的影響；流式細胞儀檢測二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細胞凋亡的影響；Western Blot檢測聯(lián)合用藥后細胞周期和凋亡相關蛋白的變化。結果二甲雙胍和SAHA分別對MG-63細胞生長有抑制作用，二甲雙胍聯(lián)合SAHA應用對MG-63細胞生長的抑制作用更加顯著；二甲雙胍聯(lián)合SAHA應用與單藥相比能夠明顯降低MG-63細胞克隆形成率，并且促進細胞凋亡；聯(lián)合用藥后P27，P21，Cyclin D1，Mcl-1，XIAP，Bim，Cytochrome C蛋白發(fā)生明顯改變。結論二甲雙胍聯(lián)合SAHA應用與單藥相比能夠顯著抑制人骨肉瘤MG-63細胞的增殖，促進其凋亡，可見兩藥聯(lián)用對腫瘤細胞的殺傷具有協(xié)同性。

二甲雙胍； 異羥肟酸； 骨肉瘤； 細胞增殖； 細胞凋亡

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年[1]，因此，長期的化療影響應予以重視，目前迫切需要一些沒有或僅有較少累積毒性的治療藥物給骨肉瘤患者帶來福音。二甲雙胍(Metformin,Met)在臨床中用來降低2型糖尿病患者的血糖水平，然而近幾年因其潛在的抗腫瘤作用而引起了人們的極大注意[2-3]，其抗腫瘤效應被認為與其降血糖作用無關[4-5]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor，HDACi)是一類新型抗腫瘤藥物，對多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤具有顯著抗腫瘤作用，而異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)則是其中一種非常有效的HDACi[6]。本研究的目的是評估二甲雙胍和SAHA在體外對人骨肉瘤細胞株的增殖和凋亡的影響，并評估其協(xié)同抗腫瘤作用，初步探討其聯(lián)合作用的機制，旨在為這種新型聯(lián)合化療模型的臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料人骨肉瘤細胞株MG63購于中國科學院上海細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Gibco公司，二甲雙胍、SAHA、姬姆薩染液購于Sigma-Aldrich公司，MTS購于Promega公司，Annexin V/PI試劑盒購于凱基生物公司，Western Blot一抗均購于santa cruz公司，二抗購于Pierce Biotechnology。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MG63細胞用RPMI1640+10%胎牛血清，培養(yǎng)液含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，于37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，實驗所用的細胞均處于對數生長期。

1.2.2 MTS法測定細胞增殖 對數生長期細胞接種于96孔板，每孔2×103個細胞。設空白組(僅加培養(yǎng)液)、對照組和藥物系列組(單藥或同時聯(lián)合)，每組設3個重復孔，每孔容積為100 μL。需等細胞培養(yǎng)24 h足夠貼壁后才能進行加藥處理，于處理72 h后終止培養(yǎng)。在終止培養(yǎng)前4 h，加MTS每20 μL/孔。用酶標儀讀取 490 nm 處吸光度值(A值)。按下列公式計算細胞活力(Cell Viability)，細胞活力=(藥物處理組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。實驗重復3次。繪制Cell Viability vs 藥物濃度曲線。

1.2.3 克隆形成實驗 500個細胞種在6 cm培養(yǎng)皿中，貼壁后不同藥物處理，一周后培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆，培養(yǎng)終止。棄掉培養(yǎng)液，用PBS小心洗兩次。20 %甲醇5 mL固定15 min，棄去固定液，加適量姬姆薩染色40 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用克隆計數儀自動計數。

1.2.4 Annexin V/PI雙標記法流式細胞術測定細胞凋亡 細胞用不同藥物處理48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞(上清中的細胞也要收集)；用PBS洗滌細胞二次(2 000 rpm離心5 min)收集(1～5)×105細胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應5～15 min；在1 h內進行流式細胞儀的觀察和檢測。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示正常細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，取右上象限和右下象限的總和(即Annexin V陽性細胞群)計為凋亡細胞。

1.2.5 Western Blot 用細胞裂解液裂解細胞，提取其總蛋白或胞漿蛋白，在聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將蛋白轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗4 ℃孵育過夜；TBST漂洗后與二抗反應，室溫孵育1 h；TBST 漂洗，10 min/次，洗滌3次；加入發(fā)光液后顯影、定影、拍照。

1.3統(tǒng)計學處理用GraphPad Prism 5.0軟件對數據進行分析和t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1二甲雙胍和SAHA單藥使用對MG-63細胞增殖的抑制二甲雙胍和SAHA單藥處理72 h后，不同的藥物濃度對MG-63細胞增殖的抑制作用見圖1。實驗結果顯示，MG-63的細胞活力隨著藥物濃度的逐漸增加而降低(二甲雙胍IC50=7.5 mmol/L,SAHA IC50=0.3 μmol/L)。單獨使用二甲雙胍或SAHA對骨肉瘤細胞MG-63的增殖均有抑制作用。

圖1 二甲雙胍和SAHA單藥對MG63細胞增殖的影響

2.2二甲雙胍聯(lián)合SAHA使用對MG-63細胞增殖的影響從實驗結果可以看到，單獨使用二甲雙胍或SAHA對細胞增殖起到了一定的抑制作用，但是當使用1 mmol/L的二甲雙胍分別于 0.1 和 0.2 μmol/L的SAHA同時聯(lián)用時，細胞的增殖明顯受到了抑制，遠遠大于單藥使用。聯(lián)合用藥組對細胞增殖的抑制作用與SAHA單藥組相比差異具有統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2 二甲雙胍和SAHA聯(lián)合對MG63細胞增殖的影響 1:control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:SAHA 0.2 μmol/L;5:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L;6:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.2 μmol/L.與SAHA 0.1 μmol/L組比較，a:P<0.05;與SAHA 0.2 μmol/L組比較，b:P<0.001

2.3二甲雙胍聯(lián)合SAHA使用對MG-63細胞克隆形成的影響腫瘤細胞的單細胞克隆形成能力不僅體現(xiàn)了腫瘤細胞群體依賴性，而且還反映細胞的長期增殖能力。實驗結果顯示，與單藥使用相比，兩藥聯(lián)合使用后細胞克隆形成率明顯下降，差異有顯著性，見圖3。二甲雙胍聯(lián)合SAHA(同時)與單藥相比能夠有效地抑制骨肉瘤細胞MG-63的克隆形成。

2.4二甲雙胍聯(lián)合SAHA使用對MG-63細胞凋亡的影響促進腫瘤細胞的凋亡是藥物治療腫瘤的另一個重要切入點。藥物處理細胞48 h后，進行細胞凋亡的檢測。流式細胞分析結果顯示，單獨使用1 mmol/L二甲雙胍能夠使得MG-63細胞的凋亡率達到15.24%，單獨使用0.1 μmol/L或0.2 μmol/L SAHA能夠使得MG-63細胞的凋亡率分別達到25.32%和38.80%。當使用1 mmol/L二甲雙胍分別聯(lián)合0.1 μmol/L和0.2 μmol/L SAHA處理細胞后，細胞凋亡率顯著增加，分別為46.17%和60.42%，與單藥使用相比差異具有統(tǒng)計學意義，見圖4。二甲雙胍和SAHA單獨使用可以促進腫瘤細胞的凋亡，但是兩藥同時聯(lián)用其促凋亡的能力更加明顯。

圖3 二甲雙胍和SAHA聯(lián)合對MG63細胞克隆形成的影響 1:Control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:SAHA 0.2 μmol/L;5:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L;6:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.2 μmol/L.與SAHA 0.1 μmol/L組比較,a:P<0.001;與SAHA 0.2 μmol/L組比較,b:P<0.001

2.5二甲雙胍聯(lián)合SAHA對MG-63細胞的凋亡和周期相關蛋白的改變在藥物處理細胞48 h后，分別用digitonin buffer提取胞漿蛋白以及用RIPA提取細胞全蛋白進行Western Blot實驗。相對于單純使用二甲雙胍或者SAHA，兩藥同時聯(lián)用時PARP切割更明顯，代表細胞凋亡明顯增加。線粒體是細胞內源性凋亡啟動以及調控的主要細胞器，而Cytochrome c (Cyto C)的釋放則是細胞早期凋亡的標志物，單藥處理時都只有輕微誘導Cytochrome c的釋放，而在共同作用的情況下，Cytochrome c的釋放量明顯增加。見圖5。結果從分子水平上表明，SAHA與二甲雙胍聯(lián)用具有協(xié)同激活MG63細胞內源性凋亡途徑的作用。除了凋亡標志性蛋白的檢測外，通過Western Blot實驗還驗證了兩藥物對細胞凋亡相關蛋白表達的影響。在降低抑凋亡蛋白Mcl-1與XIAP上，兩藥有明顯的協(xié)同作用。在促進促凋亡蛋白Bim的表達上，兩藥也有一定的協(xié)同作用。見圖5。

細胞周期蛋白可通過調控細胞周期從而影響細胞的增殖，為了弄清楚兩藥聯(lián)用抑制MG63細胞增殖的機制，還檢測了細胞周期相關蛋白P27，P21，Cyclin D1的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合后P27，P21上調明顯，而Cyclin D1下調明顯，見圖5，說明細胞周期進程在聯(lián)合用藥后可能受到了阻滯。

3 討 論

二甲雙胍被廣泛用于Ⅱ型糖尿病的治療，它不僅能長期使用，而且還具有少毒性和相對便宜的優(yōu)點。近幾年的研究顯示，二甲雙胍可以抑制多種腫瘤細胞的增殖[2-3]，且二甲雙胍可通過激活磷酸腺苷蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)信號通路抑制多種腫瘤細胞的生長[7-8]而不依賴于其降血糖作用。組蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)是一類在表觀遺傳學層面調控細胞基因表達的酶，當HDAC在一些腫瘤中過表達時，它與致癌因素是密切相關的[9-10]，而HDAC抑制劑SAHA可以在微摩爾濃度水平誘導多種腫瘤細胞的凋亡和抑制腫瘤細胞的增殖[11-12]。

圖4 二甲雙胍和SAHA聯(lián)合對MG63細胞凋亡的影響 A:凋亡代表圖；B:三次結果統(tǒng)計圖.1:Control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:SAHA 0.2 μmol/L;5:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L;6:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.2 μmol/L.與SAHA 0.1 μmol/L組比較，a:P<0.01;與SAHA 0.2 μmol/L組比較，b:P<0.001

圖5 MG63細胞的凋亡和周期相關蛋白的改變 1:Control;2:二甲雙胍 1 mmol/L;3:SAHA 0.1 μmol/L;4:二甲雙胍1 mmol/L + SAHA 0.1 μmol/L

相對于單個藥物治療的方式，兩藥聯(lián)用具有用藥劑量小，毒副作用低的優(yōu)勢，并能克服單藥耐藥性。因此，本研究不僅觀察了二甲雙胍和SAHA單藥對骨肉瘤細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響，也探索性的研究了二甲雙胍與SAHA同時聯(lián)合抑制腫瘤的作用。從研究結果可以看出，單獨使用二甲雙胍和SAHA都可在一定程度上抑制骨肉瘤細胞的增殖、促進其凋亡，但是在同時聯(lián)合兩種藥物之后，這種抗腫瘤效應更加明顯。這不僅為二甲雙胍和SAHA的抗癌效應增加了新的基礎研究證據，而且還有望在臨床治療中建立一種新型的毒副作用小、療效好的聯(lián)合化療模型。

在初步探討聯(lián)合用藥作用機制時，檢測了細胞凋亡和周期相關的一些重要蛋白，結果發(fā)現(xiàn)Mcl-1，XIAP，Bim，Cyto C等凋亡相關蛋白和P27，P21，Cyclin D1等周期相關蛋白在聯(lián)合用藥時變化明顯。由于相對于單個靶分子藥物治療的方式，兩藥聯(lián)用具有多靶點的優(yōu)勢，所以推測兩藥聯(lián)用可能是通過影響眾多的信號通路蛋白的表達來達到抑制細胞增殖，促進細胞凋亡的作用。即二甲雙胍與SAHA具有協(xié)同作用是因為兩藥物的聯(lián)用能同時阻斷多種信號通路而導致的，兩藥共同作用時，細胞凋亡的閾值降低了，達到了協(xié)同的效果，但是具體藥物的最重要靶點是什么，靶點與靶點之間如何相互作用達到協(xié)同作用的，仍需繼續(xù)深入探討。目前研究認為二甲雙胍的抗腫瘤作用可能與活化AMPK途徑抑制腫瘤生長相關[7,8]。AMPK參與體內多種信號傳導通路，包括mTOR通路、p53/p21途徑、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路及脂肪酸和蛋白代謝相關通路的調控，從而阻斷細胞內蛋白合成，引起細胞生長停滯，促進細胞凋亡的發(fā)生。因此，二甲雙胍有可能通過激活AMPK途徑，導致癌細胞得不到足夠的細胞信號來分裂而直接發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。故SAHA與二甲雙胍聯(lián)合作用的機制有可能是通過對AMPK途徑的共同激活，不過這一點尚需進一步深入研究。此外，由于本研究中二甲雙胍和SAHA的用藥濃度都很低，在IC50以下，故此時產生的聯(lián)合作用可能有細胞毒作用無關。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)二甲雙胍與SAHA治療骨肉瘤具有協(xié)同治療效果，并對可能的機制做了初步的探討，為日后此治療方法應用于臨床治療提供了前期的研究證據。

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EffectofCombiningMetforminandSuberoylanilideHydroxamicAcidontheProliferationandApoptosisofOsteosarcomaCells

SHEN Yingying,SU Xiaotao,OU Jun,et al

(InstituteofClinicalMedicine,FirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,

Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of combining metformin and suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells.MethodsMG-63 cells were treated with metformin and SAHA for 72 h.The proliferation of MG-63 was tested by MTS assay.The capability of colony formation of MG-63 was assessed by clonogenicity assay.The cell apoptosis was detected by flow cytometry.The cell cycle and apoptosis associated proteins were assessed by Western Blot.ResultsMetformin or SAHA could inhibit the proliferation of MG-63 cells,respectively,and the cell proliferation was inhibited more obviously after combination of theses two drugs.Moreover,combination of two drugs could inhibit colony formation and promote cell apoptosis more significantly.P27,P21,Cyclin D1,Mcl-1,XIAP,Bim,Cytochrome C were significantly changed after the combination therapy.ConclusionCombination of metformin and SAHA could inhibit proliferation and colony formation and promote apoptosis more effectively in MG-63 cells.

metformin; suberoylanilide hydroxamic acid; osteosarcoma; proliferation; apoptosis

R738.1

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.003

2015-10-24；

2015-12-28

國家自然科學基金(81502276)．

*通訊作者，E-mail:henry200333@126.com．

蔣湘蓮)