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(1.南華大學(xué)腫瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.海南省婦幼保健院婦產(chǎn)科；3.懷化市第一人民醫(yī)院腫瘤科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

穩(wěn)定高表達(dá)RORα基因的人胃癌MGC803細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

趙曉紅1,2#，向姝霖1,3#，劉芳1，夏紅1，曾希1，蘇波1，凌暉1，蘇琦1*

(1.南華大學(xué)腫瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.海南省婦幼保健院婦產(chǎn)科；3.懷化市第一人民醫(yī)院腫瘤科)

目的構(gòu)建維甲酸相關(guān)孤核受體α(RORα)基因的真核表達(dá)載體，并建立穩(wěn)定高表達(dá)RORα的人胃癌MGC803細(xì)胞，為研究RORα的功能奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)RORα基因的cDNA全序列，設(shè)計(jì)一對(duì)帶有限制性酶切位點(diǎn)的引物。從人胃癌MGC803細(xì)胞中提取mRNA作為模板合成RORα cDNA第一鏈，并用上述引物擴(kuò)增目的基因全序列，然后經(jīng)雙酶切插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；用氨芐青霉素篩選pcDNA3.1(+)-RORα的陽(yáng)性菌株，雙酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定。用經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-RORα轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞，G418篩選獲得RORα/MGC803細(xì)胞株；Real-time PCR和Western blot檢測(cè)該細(xì)胞株RORα的表達(dá)情況。結(jié)果經(jīng)雙酶切鑒定，構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RORα包含有大約1 640 bp的插入片段，與預(yù)期大小一致；表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序鑒定，其插入片段堿基序列與RORα基因的cDNA序列完全一致。用構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RORα轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后，篩選到可穩(wěn)定傳代的RORα/MGC803細(xì)胞株。Real-time PCR與Western blot檢測(cè)顯示，RORα/MGC803細(xì)胞RORα mRNA和蛋白表達(dá)增高。結(jié)論成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表達(dá)RORα基因的RORα/MGC803細(xì)胞。

維甲酸相關(guān)孤核受體α； 真核表達(dá)； 轉(zhuǎn)染； 人胃癌MGC803細(xì)胞

維甲酸相關(guān)孤核受體α(Retinoid acid receptor related Orphan Receptor α,RORα)是核受體超家族成員之一，廣泛分布于機(jī)體各組織，可調(diào)節(jié)多種組織細(xì)胞的發(fā)育和/或分化、生物代謝、機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持及高級(jí)神經(jīng)功能等[1-2]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)RORα在結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、白血病等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，可能是腫瘤抑制基因和治療靶點(diǎn)[3]。本文作者發(fā)現(xiàn)RORα在胃癌中低表達(dá)，與胃癌的發(fā)生和分化程度有關(guān)[4]。本研究通過(guò)建立穩(wěn)定高表達(dá)RORα基因的人胃癌MGC803細(xì)胞，為進(jìn)一步研究RORα在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、菌株和質(zhì)粒人胃癌MGC803細(xì)胞(山東師范大學(xué)培育的人胃低分化粘液腺癌細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自大連寶生物公司；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2主要試劑Taq DNA Polymerase、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA Ligand merase、T4 Polynucleotide Kinase等購(gòu)自大連寶生物公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Reverse transcription system購(gòu)自Promega公司；PCR Master Mix (2X) 購(gòu)自Fermentas公司；膠回收及質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司產(chǎn)品；RORα與β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、G418和PRIM1640均購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3引物合成根據(jù)GenBank中人RORα基因的cDNA序列(NM_134261.2)設(shè)計(jì)帶有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)的上、下游引物(F:5′-TAG GAT CCA CCA TGG AGT CAG CTC CG；R:5′-TCG GAA TTC TTA CCC ATC AAT TTG C)，并設(shè)計(jì)Real-time PCR檢測(cè)引物(RORα-F：5′-TCT TTC CCT ACT GTT CGT TC，RORα-R：5′-CTC AAG TAT TGG CAG GTT TC；GAPDH-F：5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC G，GAPDH-R：5′-CGG AAG ATG GTG ATG GGA TT)，然后交由上海生工合成。

1.4目的基因的獲取按照試劑盒說(shuō)明書提取人胃癌MGC803細(xì)胞總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析提取情況，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。然后用逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得目的基因RORα，并用1%瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收試劑盒純化。

1.5真核表達(dá)載體的構(gòu)建將純化的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切過(guò)夜，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收試劑盒純化目的基因和空載體；最后將純化的目的基因RORα和pcDNA3.1(+)以摩爾比約3∶1的比例連接過(guò)夜。

1.6重組質(zhì)粒的擴(kuò)增和鑒定用RORα和pcDNA3.1(+)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。然后抽提質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切驗(yàn)證表達(dá)載體構(gòu)建情況，并將陽(yáng)性重組子送交上海生工測(cè)序鑒定目的基因堿基序列。

1.7 MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選擴(kuò)增并抽提經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-RORα，然后用Lipofectamine 2000輔助轉(zhuǎn)染人胃癌MGC803細(xì)胞，并同時(shí)做空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h，將細(xì)胞作1∶10稀釋后傳代，在含400 μg/mL G418的RPMI1640中培養(yǎng)2周，篩選陽(yáng)性克隆。挑取單個(gè)克隆，繼續(xù)抗性篩選2周，其陽(yáng)性克隆的后續(xù)培養(yǎng)始終在200 μg/mL G418下進(jìn)行。經(jīng)連續(xù)傳代10次，收集細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.8高表達(dá)RORα的MGC803細(xì)胞株的鑒定Real-time PCR：分別收集未轉(zhuǎn)染、空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染和表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RORα轉(zhuǎn)染的人胃癌MGC803細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，然后用Real-time PCR測(cè)定各組細(xì)胞RORα mRNA的表達(dá)情況。反應(yīng)體系：cDNA、RORα-sense、RORα-antisense各1 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，dd H2O 7 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min一個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量的計(jì)算：以β-actin為內(nèi)參，將樣本的基因表達(dá)水平與之比較，從而得到樣品間基因表達(dá)差異的相關(guān)信息。計(jì)算公式：相對(duì)mRNA表達(dá)=2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值-β-actin Ct值。

Western blot：收集未轉(zhuǎn)染、空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1(+)-RORα轉(zhuǎn)染的MGC803細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加RORα抗體或β-actin抗體，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。分析各組細(xì)胞RORα蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 MGC803細(xì)胞總RNA的提取見圖1所示，MGC803細(xì)胞總RNA的18S和28S條帶清晰，A260/A280比值大于1.93，說(shuō)明總RNA質(zhì)量良好，符合下一步實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 MGC803細(xì)胞總RNA電泳圖 M:DL2000 DNA Marker;1～2:MGC803細(xì)胞

2.2 RORα基因全長(zhǎng)編碼序列的獲得采用RT-PCR技術(shù)，以MGC803細(xì)胞總RNA為模板，擴(kuò)增RORα的全長(zhǎng)cDNA序列。瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產(chǎn)物為單一清晰的DNA條帶，片段大小約1 640 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。

2.3 pcDNA3.1-RORα真核表達(dá)載體的鑒定RORα基因全長(zhǎng)cDNA序列片段與真核表達(dá)載體 pcDNA3.1連接，獲得pcDNA3.1-RORα真核表達(dá)載體。從轉(zhuǎn)化成功的克隆中隨機(jī)選取2個(gè)克隆，抽提質(zhì)粒，然后用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，結(jié)果pcDNA3.1-RORα載體和酶切產(chǎn)物均為與預(yù)期片段大小相符、清晰的DNA條帶，說(shuō)明RORα全長(zhǎng)cDNA已經(jīng)成功連接到pcDNA3.1載體上(圖3)。

圖2 RORα基因全長(zhǎng)cDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果 M:DL2000 marker;1～4:RORα基因全長(zhǎng)cDNA序列PCR擴(kuò)增條帶

圖3 重組pcDNA3.1-RORα真核表達(dá)載體雙酶切鑒定 M:marker;1:pcDNA3.1-RORα質(zhì)粒;2～3:pcDNA3.1-RORα雙酶切質(zhì)粒。

將經(jīng)雙酶切鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序，結(jié)果如圖4所示，插入序列與RORα基因的cDNA堿基序列(NM_134261.2)完全一致，說(shuō)明插入序列為RORα全長(zhǎng)cDNA序列。

2.4高表達(dá)RORα的MGC803細(xì)胞株的鑒定Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，空載體轉(zhuǎn)染組MGC803細(xì)胞中RORα mRNA和蛋白表達(dá)均與未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯差異(P>0.05)；而真核表達(dá)載體pcDNA3.1-RORα穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組MGC803細(xì)胞中RORα mRNA和RORα蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，表明建立的RORα/MGC803細(xì)胞株能穩(wěn)定高表達(dá)RORα基因(表1和圖5～7)。

3 討 論

RORα定位于染色體15q21-q22，全長(zhǎng)大小約730 kb，包含15個(gè)外顯子，可編碼四種基因產(chǎn)物RORα1-4，其中RORα1是最主要的亞型，分布廣泛，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)。RORα1-4分別由523，556，548，468個(gè)氨基酸殘基組成，該四種亞型僅氨基端結(jié)構(gòu)域的組成不同。氨基端結(jié)構(gòu)域與DBD鋅指模序1共同決定RORα亞型與RORE的結(jié)合力、對(duì)靶基因啟動(dòng)子識(shí)別的特異性以及轉(zhuǎn)錄活性[1-3]。RORα可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)直接調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與多項(xiàng)重要的病理與生理過(guò)程[5]。

圖4 重組pcDNA3.1-RORα真核表達(dá)載體測(cè)序圖 A:正向測(cè)序，箭頭指示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);B:反向測(cè)序，箭頭指示轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)

表1RORαReal-TimePCR數(shù)據(jù)

樣本RORαCt值GAPDHCt值△Ct值2-△△Ct值平均值標(biāo)準(zhǔn)差MGC803細(xì)胞23.5512.840.161.114958723.5312.80.141.099077723.4812.32-0.290.81872111.0109191630.1360591pcDNA3.1/MGC803細(xì)胞24.0513.30.121.08458423.8013.250.321.246111323.6513.250.471.38793651.2395439270.1239302RORα/MGC803細(xì)胞23.2914.742.325.009143523.2714.361.963.90278823.1714.281.983.95537424.289101880.5095987

圖5 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 A:RORα擴(kuò)增曲線;B:RORα溶解曲線;C:GAPDH擴(kuò)增曲線;D:GAPDH溶解曲線

圖6 Real-time PCR檢測(cè)各種MGC803細(xì)胞中RORα mRNA表達(dá) 1:MGC803細(xì)胞;2:pcDNA3.1/MGC803細(xì)胞;3:RORα/MGC803細(xì)胞

圖7 Western blot檢測(cè)各種MGC803細(xì)胞RORα蛋白表達(dá) 1:MGC803;2:pcDNA3.1/MGC803;3～5:RORα/MGC803

目前，RORα與腫瘤的關(guān)系引起人們高度關(guān)注。Du等[3]報(bào)告，RORα在乳腺癌較正常乳腺組織表達(dá)下調(diào)和/或活性下降，而恢復(fù)RORα表達(dá)可體內(nèi)外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲等惡性表型，通過(guò)經(jīng)典與非經(jīng)典的核受體途徑調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲，提示RORα可能是乳腺癌的抑制基因和治療靶點(diǎn)。研究顯示，脂質(zhì)代謝紊亂是結(jié)腸癌發(fā)生危險(xiǎn)因子，RORα可調(diào)控一些腫瘤脂質(zhì)代謝基因。脂肪細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與遷移和雞胚胎絨毛膜尿囊膜血管發(fā)生，并且，RORα及其靶基因表達(dá)降低，同時(shí)，RORα及其靶基因在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低，而RORα活化可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與遷移以及血管發(fā)生。表明RORα與結(jié)腸組織和結(jié)腸癌的局部脂質(zhì)代謝有直接關(guān)系，RORα低表達(dá)可能是結(jié)腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)信號(hào)[6]。RORα通過(guò)絲氨酸35殘基磷酸化，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合β-catenin，抑制Wnt/β-catenin通路靶基因cyclin D1、c-myc、Axin，從而調(diào)控細(xì)胞增殖與腫瘤進(jìn)展。并且，RORα可依賴PGE2/PKCα途徑磷酸化減弱結(jié)腸癌細(xì)胞Wnt靶基因表達(dá)。表明RORα是腫瘤細(xì)胞增殖精密調(diào)控的中心的關(guān)鍵調(diào)控因子，可能是抗腫瘤治療有希望的靶點(diǎn)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，RORα與肝癌發(fā)生有關(guān)，起著抑癌基因的作用。RORα在肝癌組織表達(dá)較臨近非腫瘤組織明顯下調(diào)，與血清AFP、病理分級(jí)、腫瘤復(fù)發(fā)、血管侵襲和預(yù)后密切相關(guān)，表明RORα可能是預(yù)后新的標(biāo)志。限制肝癌細(xì)胞谷氨酰胺補(bǔ)充可明顯增加RORα表達(dá)，上調(diào)谷氨酰胺缺陷肝癌細(xì)胞RORα導(dǎo)致活性氧增加與NADP+/NADPH 比值降低。RORα高表達(dá)可減少肝癌細(xì)胞需氧糖酵解和下調(diào)生物合成途徑，上調(diào)p21，抑制PDK2表達(dá)和磷酸化[9-11]。RORα在鱗癌組織與細(xì)胞中明顯低表達(dá)，角化細(xì)胞RORα表達(dá)水平增加可提高與分化相關(guān)的蛋白以及類脂屏障形成有關(guān)基因[12]。

近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)RORα具有穩(wěn)定p53蛋白表達(dá)的作用。因此，采用合成的RORα 激動(dòng)劑SR1078處理腫瘤細(xì)胞可穩(wěn)定p53蛋白表達(dá)與誘導(dǎo)凋亡。提示合成RORα 激動(dòng)劑可能有效治療腫瘤[13]。最近，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)DADS處理MGC803細(xì)胞后24個(gè)與細(xì)胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞免疫、增殖抑制等相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，其中，RORα蛋白表達(dá)上調(diào)[14]。這些研究為研發(fā)促進(jìn)RORα表達(dá)的有效藥物開拓新的途徑。

前期研究已經(jīng)證實(shí)，RORα蛋白表達(dá)在胃癌組織明顯低于正常胃黏膜和癌旁胃黏膜，且癌旁胃黏膜低于正常胃黏膜，高分化腺癌中RORα蛋白表達(dá)明顯高于中分化、低分化腺癌，提示RORα蛋白表達(dá)下調(diào)與胃癌的發(fā)生發(fā)展和分化相關(guān)[4]。但是，RORα與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移以及發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究首先構(gòu)建RORα全長(zhǎng)cDNA序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-RORα，并用真核表達(dá)載體pcDNA3.1-RORα轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后，Real-time PCR和Western blot鑒定顯示，已成功獲得穩(wěn)定高表達(dá)RORα/MGC803細(xì)胞，為進(jìn)一步研究RORα的功能奠定了基礎(chǔ)。

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ConstructionandIdentificationofMGC803CellTransfactedbyRORαGene

ZHAO Xiaohong,XIANG Shulin,LIU Fang,et al

(CancerResearchInstitute,CenterforGastricCancerResearchofHunanProvince,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyofHunanProvincialUniversities,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression vector inserted by RORα gene,and establish human gastric cancer MGC803 cell lines that express higher level RORα gene to lay the foundation for investigating the function of RORα.MethodsBased on the complete cDNA sequence of RORα isoform,to design a pair of primers with restriction sites.To extract the total mRNA from human gastric cancer MGC803 cells as a template for synthesize first strand cDNA of RORα,and amplify the complete sequences of target gene by the above primers.Then,after double enzyme digestion,the amplified sequences was inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) for transforming into E.coli DH5α.The positive strains containing pcDNA3.1(+)-RORα were screened by ampicillin,and were identified by restriction analysis and sequencing.MGC803 cells was transfected by the identified recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-RORα,and was screened by G418 for obtaining stable passage RORα/MGC803 cell lines.RORα expression of the cell lines was certified by Real-time PCR and Western blot.ResultsBy restriction analysis,the constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα contains about 1640bp insert fragment,which is consistent with the expected size.By sequencing,the insert fragment’s base sequence of the expression vector was exactly the same cDNA sequence of RORα1 gene.To transfect MGC803 cells by the constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα,we obtained stable passage RORα/MGC803 cell lines that express higher level RORα mRNA and protein.ConclusionWe successfully constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-RORα and RORα/MGC803 cell lines which express higher level RORα gene.

RORα; eukaryotic expression; transfection; human gastric cancer MGC803 cells

R735.2

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.002

2015-09-22；

2015-12-01

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81374013,81102854)，湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金(09K074)，湖南省衛(wèi)計(jì)委科研課題 (B2015-182).

*通訊作者，E-mail:suqi1945@163.com.

#:并列第一作者.

蔣湘蓮)