張星和+張珊珊
【摘要】用正交實(shí)驗(yàn)法討論從橘皮中提取多糖的最佳實(shí)驗(yàn)條件,探討了不同提取時(shí)間、酶解溫度、pH和料液比(酶用量)等條件對(duì)提取得率的影響,結(jié)果表明,在酶解時(shí)間75min,料液比1:60g/mL,酶解溫度45℃,pH為5.0時(shí)多糖的提取率最高。
【關(guān)鍵詞】酶法;橘皮;正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
多糖又叫多聚糖(polysaceharides,Ps),是由多個(gè)相同或不相同的單糖以糖苷鍵相連而成的極性復(fù)雜大分子,分子量為數(shù)萬,數(shù)十萬到數(shù)百萬,甚至有的達(dá)上千萬。多糖有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗心肌缺血、抑制腫瘤、抗癌及降低血糖等生物活性。目前多糖的提取有熱水提醇沉法、水浸提法、酶解提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法等。結(jié)合試驗(yàn)室條件,試驗(yàn)采用纖維素酶法對(duì)橘皮中的多糖進(jìn)行提取,并以多糖得率為指標(biāo)通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳提取工藝。
一、材料與方法
1、材料與設(shè)備
橘子購(gòu)于保山集市,購(gòu)回后將橘皮取下,洗凈,切小,將其置于陽(yáng)光充足的地方曬干;纖維素酶(BR,30U/mg,上海博奧生物科技有限公司);其他試劑均為分析純。
HH-S26s數(shù)顯恒溫水浴鍋;GUO HUA 800低數(shù)離心機(jī);JH-14-07 A-14-07-161型可見分光光度計(jì);DFT-200型手提式高速萬能粉碎機(jī);DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。
2、多糖含量的測(cè)定
目前,多糖的測(cè)定方法主要有蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法,本實(shí)驗(yàn)采用第二種方法,以干燥至恒重的葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。
3、橘皮多糖的制備
準(zhǔn)確稱取過60目篩的橘皮若干于圓底燒瓶中,加少量蒸餾水浸泡24h,加入一定量的酶溶液并調(diào)pH值,放入恒溫水浴鍋中酶解一段時(shí)間后取出,離心得上清液。再將剩余沉淀重復(fù)酶解兩次,合并上清液。放入90℃的水浴鍋中滅活10min,冷卻。用80%乙醇沉淀,離心得粗多糖,待顯色后于490nm出測(cè)定吸光度A。
4、粗多糖提取率計(jì)算
多糖得率(%)=(多糖含量/原料重量)*100%
5、酶法提取的正交實(shí)驗(yàn)
影響多糖提取率的因素很多,如酶的添加量,反應(yīng)時(shí)間,反應(yīng)溫度及其pH值。針對(duì)這些因素,采用四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)確定橘皮多糖酶解法提取的最佳條件,具體參數(shù)見表1。
表1:因素水平表
二、結(jié)果與討論
1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
由實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(x),吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
圖1:葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.5021x+0.0163,R2=0.994,線性關(guān)系良好。
2、酶法提取條件的優(yōu)化
取樣品每份0.500g,按照L9(34)分9組實(shí)驗(yàn),得到的數(shù)據(jù)如表2所示。
表2:正交表和實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果
由直觀分析可知,RC>RA>RB>RD,四個(gè)影響多糖提取率的因素主次順序,分別是C>A>B>D,即酶的添加量>酶解溫度>pH>酶解時(shí)間,最佳參數(shù)為A2B2C3D2,即以料液比1:60,在pH為5.0的緩沖溶液中,回流提取75min,提取溫度定為45℃,反復(fù)提取三次,多糖提取率最高。按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果橘皮多糖的提取率為27.10%,較最高5號(hào)樣26.94%略高。
三、結(jié)論
本文采用纖維素酶解新方法提取橘皮多糖,該工藝通過酶水解破壞植物細(xì)胞壁的作用,可以使細(xì)胞內(nèi)的多糖物質(zhì)充分溶出,從而顯著提高了橘皮多糖提取率。
為進(jìn)一步優(yōu)化酶解法提取多糖實(shí)驗(yàn)條件,本實(shí)驗(yàn)用L9(34)正交表考察了酶添加量(液料比)、酶解溫度酶解時(shí)間以及pH4個(gè)因素對(duì)提取率的影響。在最佳條件下,纖維素酶法提取橘皮多糖的提取率為27.10%。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 丁 ?銳. 桑葉多糖的提取工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,39(35):21650-21652.
[2] 趙 ?宇, 彭曉霞. 多糖類化合物提取工藝研究[J]. 醫(yī)藥衛(wèi)生, 2006,35(2):223-224.
[3] 劉曉涵. 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測(cè)定枸杞子中多糖含量的比較[J]. 食品科技, 2009,34(9):270-272.
[4] 楊賢慶, 劉名求, 戚 ?勃, 等. 龍須菜中含量測(cè)定方法的比較研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013(22):54-57.