楊志廣，李運林，陳亞紅，郭 雷，張建夫，彭 鵬

(周口師范學院 化學化工學院，河南 周口 466001)

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有機雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針研究進展

楊志廣*，李運林，陳亞紅，郭 雷，張建夫，彭 鵬

(周口師范學院 化學化工學院，河南 周口 466001)

線粒體在細胞的能量代謝中發(fā)揮著關鍵作用，其內(nèi)部環(huán)境的微小變化會影響細胞的正常生命活動。同時線粒體內(nèi)許多活性小分子在細胞的許多生理過程中也起著關鍵作用。因此，可視化監(jiān)測線粒體自身及內(nèi)部微環(huán)境的變化對于生命現(xiàn)象的研究和疾病的診斷與治療具有非常重要的意義。熒光分析法因具有操作簡便、靈敏度高、選擇性好、實時檢測以及損傷小等優(yōu)點而得到了廣泛的研究和應用。雙光子熒光探針技術相對于單光子熒光技術具有長波吸收短波發(fā)射、高度的三維空間選擇性、大的穿透深度、避免熒光漂白和光致毒以及降低組織自發(fā)熒光干擾等特點，在生命科學領域具有廣闊的應用前景。該文介紹了有機雙光子吸收基本原理以及有機雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針的研究現(xiàn)狀，同時對有機線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針今后的發(fā)展趨勢進行了展望。

線粒體；活性小分子；雙光子；熒光探針；檢測；綜述

生命體中存在著各種各樣的活性小分子物種，它們在生命體內(nèi)的種類和濃度不盡相同，其生物學功能也完全不同，而且外界環(huán)境的變化(例如：受到環(huán)境污染或者其它刺激)會直接改變內(nèi)源性物質(zhì)的分布，從而導致疾病的發(fā)生。因此，深入了解這些活性物種的產(chǎn)生、分布及含量的變化等對于調(diào)節(jié)細胞正常的生理功能具有極其重要的科學意義。線粒體是細胞中非常重要的一個動態(tài)細胞器，是細胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，被譽為細胞的“動力工廠”，在細胞的生命活動中扮演著多種重要的角色，如在調(diào)節(jié)細胞氧化還原電位和信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)細胞分化與凋亡、基因表達、細胞內(nèi)多種離子的跨膜轉(zhuǎn)運以及控制細胞周期和生長等方面發(fā)揮著重要作用[1-6]。許多研究表明，線粒體與人的線粒體疾病、心臟功能障礙、動脈硬化、阿爾茨海默病、神經(jīng)細胞死亡、癌癥以及機體衰老等疾病相關[7-11]。另外，線粒體內(nèi)許多活性小分子，活性氧、活性氮、還原態(tài)谷胱甘肽(GSH)等也與許多重大疾病相關，如阿爾茨海默病、帕金森病、神經(jīng)細胞死亡和癌癥等[12-15]。因此，探索能夠及時準確地對線粒體以及線粒體內(nèi)各種功能性物種進行區(qū)域定位與檢測的分析方法對于線粒體生命現(xiàn)象的研究和疾病診斷具有十分重要的生物學意義。

熒光分析法具有簡單易行、靈敏度高、選擇性好、檢出限低、不破壞樣品和易于實現(xiàn)在線檢測等特點，在生物體內(nèi)各種活性物種的檢測方面得到了廣泛應用。近年來，雙光子熒光探針技術在生命科學、醫(yī)學診斷、信息科學等領域中的應用正迅速擴展，這是因為雙光子熒光探針技術相對于單光子熒光探針技術具有更獨特的優(yōu)勢，如近紅外光激發(fā)、對生物樣品穿透深度大、自發(fā)熒光低、光毒性小、對細胞和組織損傷小、漂白區(qū)域小、能夠延長活細胞和組織的觀測時間等[16-18]，為生命科學的研究提供了更為銳利的工具。本文主要介紹了有機雙光子吸收基本原理和雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針的研究現(xiàn)狀，同時對有機線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針未來的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 雙光子吸收基本原理及在生物應用中的優(yōu)勢

單光子吸收是指利用紫外或可見光激發(fā)熒光分子時，只有吸收光子的能量與熒光分子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能帶隙相匹配時才會發(fā)生電子躍遷。雙光子吸收現(xiàn)象由G?ppert-Mayer[16]于1931年首次提出，60年代初激光器出現(xiàn)后，Kaiser等[17]利用紅寶石激光器為激發(fā)光源，首先從實驗上證實了雙光子吸收過程。雙光子吸收是指物質(zhì)分子在脈沖激光等強光的激發(fā)下，在較短的時間內(nèi)，同時或先后吸收兩個相同或者不同頻率的光子，物質(zhì)分子中的電子由基態(tài)通過一個中間虛擬態(tài)(Virtual state)直接吸收兩個光子躍遷至一個較高能態(tài)的過程。雙光子吸收過程完全不同于單光子吸收過程，而是熒光團與激發(fā)光相互作用的過程。與單光子吸收相比，雙光子吸收是非線性吸收過程，屬于三階非線性效應的一種；在雙光子吸收過程中，物質(zhì)分子的吸收強度、電子躍遷幾率與激發(fā)光強度的平方成正比；雙光子吸收發(fā)生在焦點處λ3(λ為激發(fā)波長)的空間范圍內(nèi)，而單光子吸收發(fā)生在整個聚焦光路范圍內(nèi)。因此，雙光子吸收激發(fā)光穿透作用強，瑞利散射小，具有更高的空間分辨率和選擇性；減少了對被測生物標本樣品的光致毒性以及對熒光的光漂白，增加了有效觀測時間；長波吸收短波發(fā)射，波長處于生物光學窗口(700～1 100 nm)范圍內(nèi)，有效避免了紫外-可見光損傷，有利于生物樣品的實時動態(tài)觀測。雙光子技術在信息、材料、生物熒光識別、醫(yī)學熒光診斷等領域正顯示出廣闊的應用前景[18-22]。

2 有機雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針研究現(xiàn)狀

目前用于活細胞線粒體特異性熒光成像的熒光探針主要有兩種，一種是商品化線粒體熒光探針；另一種是具有與線粒體定位功能的親脂性的陽離子基團。商品化線粒體熒光探針主要有兩大類[23]：一類是羅丹明類，如羅丹明123(Rh23)、四甲基羅丹明甲酯(TMRM)以及Invitrogen公司開發(fā)的MitoTracker Orange/Red CM系列等；另一類是菁染料，如MitoTracker Green/Red/Deep Red FM系列。三苯基季磷鹽是一種高效的線粒體定位功能的陽離子基團，具有較強的疏水性，能夠有效穿透疏水性膜，連接在活性小分子熒光團上可實現(xiàn)對細胞中線粒體內(nèi)活性物質(zhì)的檢測和熒光成像[24-25]。研究人員將對細胞內(nèi)活性小分子或金屬離子具有識別作用的熒光基團與具有線粒體靶向作用的親脂性陽離子相連接，可實現(xiàn)對線粒體內(nèi)這些物質(zhì)的檢測與成像。目前報道的大部分有機線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針均為單光子熒光探針，雖然這些探針也能用雙光子進行激發(fā)，但其雙光子吸收截面小，熒光量子產(chǎn)率較低，還存在背景干擾大、光穩(wěn)定性差、毒性大、選擇性差、斯托克斯(Stokes)位移小等缺點。而對于有機雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針的報道則相對較少，對其生物學機制的研究尚不夠深入，其研究也剛剛起步。下文就近年來有機雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針的研究進展作了比較系統(tǒng)的評述 ,并展望了此類探針未來的發(fā)展趨勢。

2.1 有機線粒體小分子熒光探針

線粒體不僅是細胞的能量工廠，而且是細胞生存與死亡的調(diào)控中心、與細胞凋亡、氧自由基產(chǎn)生、心血管病、神經(jīng)性疾病、機體衰老、癌癥等疾病密切相關[26-27]。因此，構(gòu)建性能優(yōu)越，且能全面、準確檢測細胞內(nèi)線粒體的熒光探針對于研究線粒體內(nèi)復雜的生物學過程具有重要的科學意義。Zhang等[28]以氟化硼絡合二吡咯甲川類染料(BODIPY)為母體，開發(fā)了一種不受膜電位干擾的能夠準確定位線粒體的熒光探針1(圖1),實現(xiàn)了活細胞內(nèi)線粒體的單光子熒光成像，是一例非常優(yōu)質(zhì)的線粒體定位染料。Miao等[29]以咔唑為母體環(huán)結(jié)構(gòu)，吡啶陽離子為識別基團，設計合成了1對定位活細胞內(nèi)線粒體的雙光子熒光探針2和3(圖1)。這對探針具有較大的雙光子活性吸收截面和Stokes位移、良好的膜透性、較長的保留時間、較高的光穩(wěn)定性以及優(yōu)異的復染相容性等特性，是一類有較好應用價值的雙光子線粒體熒光探針。Dai等[30]以萘二甲酰亞胺為母體環(huán)結(jié)構(gòu)，三苯基季磷鹽陽離子為識別基團，設計合成了一個雙光子線粒體熒光探針4(圖1)。該探針透膜性好、選擇性好、對線粒體極性敏感，實現(xiàn)了活細胞內(nèi)線粒體的雙光子光子熒光成像，有望發(fā)展成為一種新型的檢測線粒體微環(huán)境變化的雙光子熒光探針。

圖1 探針1～4的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of probes 1～4

2.2 有機線粒體過氧化氫(H2O2)小分子熒光探針

H2O2是生物體內(nèi)主要的活性氧之一，在生物學功能和許多病理生理學過程中發(fā)揮著重要作用。線粒體產(chǎn)生活性氧會形成H2O2和過氧亞硝酸鹽等超氧化物和過氧化物，體內(nèi)適量水平的H2O2有益于生物正常的生理過程，然而體內(nèi)過量的H2O2則會導致細胞氧化性損傷、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、癌癥等疾病[31-33]。因此，適時準確地對細胞線粒體內(nèi)H2O2含量的動態(tài)監(jiān)測對于某些疾病的預防、診斷具有十分重要的意義。Dickinson等[34]首次報道了一種新型的利用雙官能團選擇性檢測活細胞線粒體內(nèi)H2O2的單光子熒光探針5(圖2)。該探針利用H2O2對硼酸酯的選擇性氧化作用和三苯基季磷鹽陽離子對線粒體的靶向作用成功實現(xiàn)了對線粒體內(nèi)H2O2的專一性檢測。共焦熒光成像和流式細胞術實驗表明，該探針可以成像各種哺乳類動物細胞系內(nèi)的線粒體H2O2含量的變化以及帕金森病氧化應激模型引起的H2O2濃度增加效應。

Masanta等[35]也利用H2O2對硼酸酯的選擇性氧化作用和三苯基季磷鹽陽離子對線粒體的靶向作用報道了一個對線粒體內(nèi)H2O2專一性識別的熒光探針6(圖2)，但該探針為雙光子比率熒光探針。當探針與H2O2作用后，該探針的發(fā)射光顏色由藍色變?yōu)辄S色，具有選擇性好、雙光子吸收截面大、毒性低、不受pH值干擾等特點，實現(xiàn)了活細胞和活組織(成像深度達100～180 μm)中線粒體內(nèi)H2O2的雙光子熒光比率成像。

圖2 探針5和6的化學結(jié)構(gòu)式以及與H2O2的作用機理Fig.2 Chemical structures of probes 5 and 6 and their response mechanisms to H2O2

2.3 有機線粒體硫化氫(H2S)小分子熒光探針

圖3 探針7～11的化學結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of probes 7～11

H2S是繼NO和CO之后的第3種氣體信號分子，具有調(diào)節(jié)細胞生長、傳遞調(diào)控神經(jīng)信號、保護心血管系統(tǒng)、抑制發(fā)炎以及抗氧化等多種生理作用，其含量水平發(fā)生異常還與阿爾茲海默氏癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化等多種疾病密切相關[36-38]。 因此，發(fā)展快速、準確檢測生物體內(nèi)H2S濃度變化的熒光探針對于生命科學、分析科學和醫(yī)學具有重要意義。Wang等[39]以菁染料為熒光團，利用H2S對硝基的還原性質(zhì)，開發(fā)出一種利用硝基功能團檢測H2S的近紅外熒光探針7(圖3)。在水溶液和活細胞中均得到了積極的近紅外熒光信號響應，實現(xiàn)了活細胞內(nèi)H2S濃度變化的實時熒光成像，可望應用于生物體系中H2S的原位分析。Mao等[40]以萘為熒光團，疊氮基為識別基團，報道了一種新型的檢測活細胞內(nèi)H2S的雙光子熒光探針8(圖3)，可實現(xiàn)活細胞內(nèi)H2S的雙光子熒光成像，在生物體系中具有潛在的應用價值。探針7和8只是檢測細胞內(nèi)H2S的單、雙光子熒光探針，而沒有涉及到線粒體內(nèi)H2S的檢測。Chen等[41]設計合成了一種由混合熒光團(部花箐和香豆素結(jié)構(gòu))組成的檢測線粒體內(nèi)H2S的單光子比率熒光探針9(圖3)。該探針在中性pH值條件下，實現(xiàn)了對H2S的快速、專一性響應，同時該探針水溶性好、透膜性好，可實現(xiàn)對活細胞中線粒體內(nèi)H2S的單光子熒光成像。Liu等[42]以1,8-萘二甲酰亞胺為熒光團，4-疊氮基苯-氨基甲酸酯為識別位點，設計合成了兩個比率型的識別H2S的單、雙光子探針10和11(圖3)。兩個探針均具有選擇性好、檢出限低、毒性低、穩(wěn)定性好、pH值干擾小等特點，實現(xiàn)了活細胞中H2S的單、雙光子熒光成像。細胞成像實驗證明，探針11是一個新型的專一識別線粒體內(nèi)H2S的雙光子熒光探針，在生物學領域具有廣泛的應用價值。

圖4 探針12的化學結(jié)構(gòu)式以及與的反應機理Fig.

2.5 有機線粒體金屬離子小分子熒光探針

生物體內(nèi)存在著各種各樣的金屬離子，它們對生命過程起著至關重要的作用，如Ca2+，Mg2+，Zn2+和Pb2+等在細胞的生長生存、功能調(diào)節(jié)、電子傳遞以及體內(nèi)生物活性酶的催化等方面均扮演著重要角色[46-47]。另外，人體細胞中金屬離子含量過高或過低都將導致人體生理功能發(fā)生紊亂，從而引發(fā)各種疾病，甚至致癌和致畸[48-50]。因此，實時定點監(jiān)測金屬離子在生命科學、環(huán)境科學和醫(yī)學研究領域有著極為重要的意義。Shindo等[51]基于羅丹明開發(fā)了一個能夠檢測線粒體內(nèi)Mg2+濃度變化的單光子熒光探針13(圖5)。在生理條件下，該探針的熒光性質(zhì)伴隨線粒體內(nèi)Mg2+濃度的變化而變化，且能夠檢測線粒體膜Mg2+的運輸變化，實現(xiàn)了線粒體內(nèi)Mg2+的熒光成像。Masanta等[52]結(jié)合Zn2+螯合基團和三苯基季磷鹽陽離子合成了測定線粒體內(nèi)Zn2+含量的雙光子探針14(圖5)。該探針與Zn2+作用后，雙光子熒光強度增強7倍，雙光子活性吸收截面達75 GM，其選擇性好、靈敏度高、不受pH值干擾，實現(xiàn)了大鼠海馬切片100～200 μm深處線粒體內(nèi)Zn2+的雙光子熒光成像。Baek等[53]設計合成了一個與探針14結(jié)構(gòu)相似的用于測定線粒體內(nèi)Zn2+含量的雙光子探針15(圖5)。該探針與Zn2+作用后，雙光子熒光強度增強70倍，雙光子活性吸收截面達155 GM，具有吸收截面大、選擇性好、靈敏度高、對pH值不敏感等特點，同樣實現(xiàn)了大鼠海馬切片100～200 μm深處線粒體內(nèi)Zn2+的雙光子熒光成像。

圖5 探針13～15的化學結(jié)構(gòu)式Fig.5 Chemical structures of probes 13～15

2.6 有機線粒體次氯酸(HClO)小分子熒光探針

次氯酸根(ClO-)是生物體內(nèi)重要的活性氧組分之一，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理作用,其水平過量或發(fā)生紊亂，會引發(fā)動脈硬化、關節(jié)炎、心血管疾病、肺部損傷以及某些癌癥等一系列疾病[54-57]。因此，研究開發(fā)新型、高效的ClO-熒光探針對于研究ClO-的生理功能具有重要的生物學意義。Hou等[58]基于三苯基季磷鹽和吡啶鹽雙陽離子，合成了兩個比色檢測線粒體內(nèi)次氯酸鹽的單光子熒光探針16和17(圖6)。兩個探針具有水溶性好、響應時間快、檢測靈敏度及選擇性高、透膜性好等特征，實現(xiàn)了活細胞和活體老鼠中線粒體內(nèi)次氯酸鹽的熒光成像，有望作為分子工具在化學和生物上得到廣泛應用。Yuan等[59]報道了一個新型的識別線粒體內(nèi)HClO的雙光子探針18(圖6)。該探針的靈敏度高、選擇性好、響應時間快、膜透性好，具有較強的線粒體定位能力，可實現(xiàn)活細胞中線粒體內(nèi)HClO的雙光子熒光成像，為進一步闡明亞細胞中HClO的分布以及研究亞細胞或組織中HClO潛在的生物功能提供了有力的工具。

圖6 探針16～18的化學結(jié)構(gòu)式Fig.6 Chemical structures of probes 16-18

2.7 有機線粒體巰基小分子熒光探針

生物體內(nèi)存在著多種重要的巰基小分子，如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)以及還原型谷胱甘肽(GSH)等均在細胞生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。它們結(jié)構(gòu)相似，生理功能各異，且不可或缺，機體內(nèi)這些巰基小分子水平的異常，往往誘發(fā)多種疾病，如生長緩慢、水腫、心血管疾病、老年癡呆癥、組織癌變等[60-63]。目前檢測線粒體內(nèi)Cys，Hcy和GSH的熒光探針鮮見報道，因此，開發(fā)高選擇性地識別線粒體內(nèi)Cys，Hcy和GSH的熒光探針，并實現(xiàn)其在活細胞中的雙光子熒光成像對于研究巰基小分子的產(chǎn)生、分布及水平波動有著重要的科學意義。Lim等[64]利用巰基和二硫鍵發(fā)生作用，報道了一個比率型的識別線粒體內(nèi)巰基小分子的雙光子探針19(圖7)。在巰基存在的情況下，該探針的發(fā)射光由藍色變?yōu)辄S色，且毒性低、選擇性好、膜透性好、對pH值不靈敏、雙光子吸收截面大，可實現(xiàn)活細胞和活組織中線粒體內(nèi)巰基小分子的雙光子熒光成像。但專一性識別線粒體內(nèi)巰基分子的雙光子熒光探針還未見報道。

圖7 探針19的化學結(jié)構(gòu)式以及與GSH的反應機理Fig.7 Chemical structure of probe 19 and its reaction mechanism to GSH

圖8 探針20的化學結(jié)構(gòu)式Fig.8 Chemical structure of probe 20

圖9 探針21的化學結(jié)構(gòu)式Fig.9 Chemical structure of probe 21

2.8 有機線粒體粘度小分子熒光探針

生物細胞內(nèi)不同區(qū)域的粘度值也存在很大差別，細胞粘度值的變化會引起細胞內(nèi)很多生理疾病或機體生理功能的改變。研究表明，細胞內(nèi)粘度的變化可以改變線粒體膜的流動性，線粒體粘度的增加可能會導致許多疾病，如阿爾茨海默病、糖尿病、帕金森病、癌癥等[65-67]。因此，準確檢測細胞內(nèi)微環(huán)境粘度含量的變化具有非常重要的意義。Liu等[68]基于菁染料分子內(nèi)自旋會受到粘度的影響，成功設計合成了一種雙光子線粒體內(nèi)比色粘度熒光探針20(圖8)。該探針可以檢測線粒體內(nèi)粘度(粘度值范圍在1～950 cp)的變化，從而實現(xiàn)活細胞和活組織(成像深度達60～130 μm)線粒體內(nèi)粘度的雙光子熒光成像。

2.9 有機線粒體pH值小分子熒光探針

細胞內(nèi)pH值在多種細胞活動中起著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，pH值異常變化與人體多種疾病相關，如癌癥、腎衰竭、肺病、老年癡呆癥等[69-71]。因此，實時動態(tài)監(jiān)測細胞內(nèi)pH值的變化對于研究細胞生理和病理過程具有重要意義。Wu等[72]基于香豆素吡啶鹽陽離子合成了一種實時檢測活細胞線粒體內(nèi)pH值變化的熒光探針21(圖9)。該探針水溶性好，具有優(yōu)異的pH值敏感特性和抗干擾能力，與商用線粒體示蹤器相比，對活細胞線粒體具有較高的專一定位能力以及良好的生物相容性。共焦成像實驗證實，該探針可以實時監(jiān)控線粒體酸度、細胞凋亡和應激反應時的pH值變化。但該探針為單光子線粒體pH值熒光探針，有關雙光子線粒體內(nèi)pH值熒光探針尚未見報道。

2.10 其它線粒體內(nèi)活性小分子的熒光探針

除了上述報道的檢測活細胞中線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針外，還包括諸如線粒體表面探針[73]、線粒體NO探針[74]、線粒體膜電位探針[75]等其它線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針。另外，除了利用熒光分析法檢測線粒體內(nèi)活性小分子外，還包括磷光分析法[74]、納米粒子類[76]、配合物類[77]等其它類型的分析方法。

3 總結(jié)與展望

目前雖已報道了許多有機線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針，但關于有機雙光子線粒體內(nèi)活性小分子的熒光探針仍相對較少。因此，有機線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針仍存在著以下亟待解決的問題：①目前報道的大部分線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針的活性吸收截面較小，Stokes 位移較小，量子產(chǎn)率不高。因此，尋找具有大雙光子活性吸收截面、大Stokes位移、高熒光量子產(chǎn)率和識別響應的線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針具有重要的科學價值和研究意義。②短波長光易受到生物體系自發(fā)熒光和散射光的干擾，紅光具有光毒性低、光損傷小、背景熒光干擾小、樣品穿透性強、檢測靈敏度高和便于觀測等優(yōu)點。因此，設計、合成紅光和近紅外光發(fā)射的線粒體內(nèi)活性小分子雙光子熒光探針將會非常必要。③發(fā)展毒性很低甚至無毒，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞特別是活細胞成像的雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針已顯得尤為重要。④比率型熒光探針能夠消除探針的濃度差異及外界的干擾因素，從而提高方法的選擇性、靈敏度和動態(tài)響應范圍。因此，發(fā)展比率型雙光子線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針將是未來研究的重要方向。⑤ 加大線粒體探針種類研究以滿足線粒體內(nèi)部復雜環(huán)境檢測的要求，同時對探針分子的識別機理有待于深入研究和探討?？傊S著人們對線粒體內(nèi)活性小分子熒光探針研究的不斷深入，發(fā)展具有高靈敏度、水溶性好、生物相容性好、光穩(wěn)定性好、毒性低，能夠快速成像線粒體內(nèi)活性小分子的雙光子熒光探針將是今后的主要方向。

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Research Progress in Organic Two-photon Fluorescent Probes for Active Small Molecules in Mitochondria

YANG Zhi-guang*,LI Yun-lin,CHEN Ya-hong,GUO Lei,ZHANG Jian-fu,PENG Peng

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466001,China)

Mitochondria plays a key role in energy metabolism of cells,and the small changes of internal environment in mitochondria will affect the normal cell life activities.In the meanwhile,many active small molecules in mitochondria also play a key role in many physiological process.Therefore,visual monitoring of mitochondrial itself and its changes of the internal micro environment are of great importance for the research of biological phenomenon，disease diagnosis and treatment.Fluorescence method has been extensively used due to its advantages of simple operation,high sensitivity and selectivity,real-time detection and little damage to organisms.The two-photon fluorescent probe technique has shown a much broader application prospect in the field of life sciences compared to the one-photon fluorescent probe technique as it has many advantages,such as absorbing light of longer wavelength with lower energy but emitting shorter wavelength，high three-dimensional spatial selectivity，large penetration depth，avoidance of photodamage and photobleaching and lower tissue auto-fluorescence.The basic principle of organic two-photon absorption and the research status of organic two-photon fluorescent probes for active small molecules in mitochondria were introduced,as well as the trends of organic fluorescent probes for active small molecules in mitochondria in the future were prospected.Key words：mitochondria;active small molecules;two-photon;fluorescent probes;detection；review

2015-10-15；

2015-12-13

河南省高等學校重點科研項目計劃資助(15A430055)；周口師范學院校本項目資助(ZKNUB115201)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.023

O622；TP212.2

A

1004-4957(2016)05-0627-08

*通訊作者：楊志廣，博士，講師，研究方向：有機功能材料及無機納米材料，Tel：18238475979，E-mail：yangzhiguang2006420@126.com