方海紅,朱益雷，魏惠珍,金浩鑫,殷文靜,饒 毅*

(1.江西科技師范大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330013；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330006；3.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006)

?

離子液體作流動相添加劑高效液相色譜法分離莨菪類生物堿

方海紅1,2,朱益雷2,3，魏惠珍3,金浩鑫3,殷文靜2,饒 毅2*

(1.江西科技師范大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330013；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330006；3.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006)

建立了以離子液體1-辛基-甲基咪唑六氟磷酸鹽(OminPF6)為高效液相色譜流動相添加劑分離莨菪類生物堿的方法，探討了離子液體的保留模型及機理。采用高效液相色譜法，考察了檢測波長、有機相種類和比例、離子液體的種類、pH值和濃度、緩沖鹽體系等因素對莨菪類生物堿色譜行為的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)離子液體作為流動相添加劑時，可明顯改善此類生物堿的分離效果，減少色譜峰的拖尾，提高分離效率。研究顯示，OminPF6濃度與容量因子的變化符合溶質(zhì)計量置換保留模型(SDM-R)，且保留過程以競爭吸附為主。

離子液體；高效液相色譜法；莨菪類生物堿；色譜行為；保留機理

莨菪類生物堿主要來源于顛茄和天仙子等茄科植物，包括消旋山莨菪堿(Raceanisodamine，RADM1,2)、東莨菪堿(Scopolamine，SCOP)和阿托品(Atropine，ATP)等。莨菪類藥物主要作為M膽堿能受體阻滯劑，臨床一般用于感染性休克、有機磷脂類農(nóng)藥中毒、眩暈癥、胃腸絞痛等。隨著該類藥物在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，對莨菪類化合物的分離測定研究有著重要的實際意義。4種化合物的結(jié)構(gòu)式見圖1(消旋山莨菪堿由于6位上羥基空間位置關(guān)系有2種同分異構(gòu)體RADM1和RADM2)。

圖1 消旋山莨菪堿(RADM)、東莨菪堿(SCOP)和阿托品(ATP)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig.1 Chemical structures of raceanisodamine(RADM)，scopolamine(SCOP) and atropine(ATP)

目前，文獻(xiàn)報道測定莨菪類生物堿的方法有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法以及比色法等[1-3]。然而，目前采用高效液相法分離此類生物堿大多只限于其中1～2種成分，同時分離這4種化合物較難得到理想的效果。近年來，將離子液體(RTILs)作為流動相添加劑用于反相液相色譜的研究日益增多并取得了一定成果[4-12]。目前以咪唑類離子液體的應(yīng)用最廣泛[13-14]。本實驗將咪唑類離子液體作為高效液相色譜流動相添加劑，考察了分離條件對4種莨菪堿類生物堿色譜行為的影響，根據(jù)溶質(zhì)計量置換保留模型(SDM-R)以及相關(guān)的色譜參數(shù)，初步探討了分離機理，為此類生物堿的分離測定提供了新的思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695 型高效液相色譜儀(Waters 公司)；Milli-Q 超純水儀(Milipore 公司) ；AUW2200 十萬分之一天平(島津公司) ；AB104-N萬分之一天平(梅特勒-托利多公司) ；KQ3200 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司) ；PB-10 pH計(Sartorius公司)。

乙腈(色譜純，美國 Fisher 公司)；甲醇、磷酸、磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈉、三乙胺(TEA)，均為分析純；離子液體CnminPF4(n=2,4,6,8，純度不低于 99%)，1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽(EmimCl，純度不低于99%)，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(EmimBF4，純度不低于99%)，均購于蘭州中科凱特科工貿(mào)有限公司；消旋山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對照品購于中國藥品生物制品檢定所。

1.2 溶液的配制

取適量消旋山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對照品，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得3種對照品儲備液，各取5 mL至100 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，搖勻得混合液。將混合液保存于冰箱，使用前放置至室溫后過0.45 μm 濾膜。

1.3 色譜條件

色譜柱:菲羅門C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-30 mmol/L磷酸鈉溶液(15∶85)，磷酸調(diào)至pH 7.0，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，檢測波長210 nm，柱溫為室溫。

另向緩沖液中加入1.0 mmol/L的離子液體(OminPF6)為添加劑。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長及有機相的選擇

通過光譜全波長掃描發(fā)現(xiàn)，本文研究的4種生物堿在210 nm處有較大的紫外吸收，由于常用的有機相甲醇和乙腈在210 nm附近也有吸收，因此分別考察了相同有機相比例下甲醇和乙腈對基線的干擾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用乙腈作流動相時，基線相比甲醇噪音更小，靈敏度明顯高于甲醇，因此選擇乙腈作為有機相在210 nm波長處對生物堿進(jìn)行分離測定。

2.2 離子液體種類的選擇

2.3 離子液體OminPF6溶液pH值的影響

在其他色譜條件相同的情況下，考察了離子液體 OminPF6溶液的pH值分別為3.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0時對莨菪類生物堿分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值小于6.0時，RADM和SCOP的峰形較差，會產(chǎn)生峰的裂解，這可能和生物堿以及離子液體的解離常數(shù)(pKa)有關(guān)[16]。當(dāng)pH值為7.0，8.0，9.0時能獲得較好的峰形，然而隨著pH值的增大，保留時間明顯增大，且堿性條件易損傷色譜柱[16]。當(dāng)pH值為7.0時，4種生物堿的保留時間在5～20 min范圍內(nèi)，且分離度良好，故確定pH值為7.0。

2.4 離子液體OminPF6濃度的影響

考察了離子液體OminPF6的濃度(0.8～5.0 mmol/L)對各組分分離的影響，結(jié)果見表1(αD,k,N,R分別表示離子液體濃度、容量因子、理論塔板數(shù)、分離度)。

表1 不同離子液體濃度時分離莨菪類生物堿組分的色譜參數(shù)

Table 1 Chromatographic parameters of four tropane alkaloids with different concentrations of ionic liquids

αD(mmol·L-1)RADM1kNR12RADM2kNR23SCOPkNR34ATPkN086064255402730499013921292111681198193910511165994312402717487813681258932411111914104063059038334047024025132412218962110318811097340584272241369636931306119076431078181711036505793015430689362112111176616196917649588

由表1可見，從各組分的選擇性來看，隨著離子液體濃度的增加，RADM2與SCOP之間的分離度以及SCOP與ATP之間的分離度呈減小趨勢，而由于消旋體之間結(jié)構(gòu)差異較小，RADM1與RADM2的分離度略微增加。各組分的理論塔板數(shù)大致呈先增大后減小的趨勢，且以濃度為0.8～1.6 mmol/L時，各組分的理論塔板數(shù)相對較高。此外，當(dāng)離子液體達(dá)到一定濃度時，隨著離子液體濃度的增加，4種生物堿的保留時間呈減小趨勢，主要原因是其電離產(chǎn)生的咪唑陽離子會和生物堿上的極性基團(tuán)競爭固定相的硅羥基，導(dǎo)致保留降低。

根據(jù)溶質(zhì)計量置換保留模型(SDM-R)，考察了離子液體濃度對數(shù)與容量因子對數(shù)之間的關(guān)系，探討了離子液體作用機理。其中SDM-R的簡化數(shù)學(xué)表達(dá)式為[17]:lgk′=lgI-ZlgαD，式中，k′表示容量因子，αD表示置換劑的活度(將離子液體設(shè)為置換劑時，即用離子液體濃度表示)，lgI和Z均為常數(shù)。

實驗結(jié)果表明，lgk′～lgαD的線性關(guān)系良好，4種組分保留值的對數(shù)與離子液體濃度對數(shù)均呈線性關(guān)系，RADM1，RADM2,SCOP和ATP的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.947 8，0.947 8，0.968 6，0.941 4。由此可見，該離子液體在分離莨菪類生物堿時，存在一定溶劑化作用，并且參與組分與固定相的競爭吸附[9]。

2.5 緩沖鹽的選擇

分別考察了4種不同緩沖鹽(磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈉)對莨菪類生物堿的影響。緩沖鹽加入量為30 mmol/L，醋酸鈉用冰醋酸調(diào)至pH 7.0，其他緩沖鹽用磷酸和氫氧化鈉調(diào)至pH 7.0。結(jié)果表明，當(dāng)采用醋酸鹽體系時，基線不穩(wěn)定，噪音較大，嚴(yán)重影響分離效果，這與醋酸鈉本身在210 nm處有較大吸收有關(guān)。其他3種緩沖鹽均能得到較好的分離效果，而加入鈉鹽時的靈敏度略優(yōu)于鉀鹽，這可能與鈉離子和鉀離子本身的離子強度有關(guān)，鉀離子的離子半徑大于鈉離子，半徑越大的陽離子色譜峰基線噪音越大。因此，本實驗選擇磷酸鈉作為最佳緩沖鹽。

圖2 4種生物堿的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of four tropane alkaloids acetonitrile-30 mmol/L phosphate buffer(15∶85,pH 7.0)；1.RADM1,2.RADM2,3.SCOP,4.ATP

3 結(jié) 論

本文首次以離子液體1-辛基-甲基咪唑六氟磷酸鹽(OminPF6)為反向高效液相色譜流動相添加劑，建立了消旋山莨菪堿、東莨菪堿與阿托品等莨菪類生物堿的分離分析方法，并考察了各種影響因素，建立了相關(guān)的色譜分離模型，初步探討了其分離機理。實驗結(jié)果表明，以離子液體作為流動相添加劑時，4種生物堿的色譜峰形得到了較好改善，保留時間減小，分離效率提高。并且在分離過程中離子液體濃度與容量因子在SDM-R模型中線性擬合較好，其主要作為置換劑，與被分離組分的作用以競爭吸附為主。

[1] Zhu M,Hu M S.Chin.J.Mod.Appl.Pharm.(祝明，胡梅素.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志 )，2001,18(1):51-53.

[2] Zhang L P,Liu M,Shou Y Y,Zhou L Y.StraitPharm.J.(張麗萍，劉萌，壽鑰鶯，周麗燕.海峽藥學(xué))，2005,17(2):76-77.

[3] Xu J Y,Zhu P C,Zhou G Y,Chen G C.Nat.Prod.Res.Dev.(許璟瑛,朱鵬程,周國英,陳桂琛.天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2010,22(8):90-92.

[4] Dong Y J，Yu H，Huang X，Wang J F.J.Instrum.Anal.(董影杰，于泓，黃旭，王婧菲.分析測試學(xué)報)，2011，30(3):302-306.

[5] Bian M，Yang Y，Zhou H.J.Instrum.Anal.( 邊敏，楊勇，周昊.分析測試學(xué)報)，2013,32(2):174-178.

[6] Wang J F，Yu H，Bu W.J.Instrum.Anal.(王婧菲，于泓，卜文.分析測試學(xué)報)，2014,33(5):533-538.

[7] Ruiz-Angel M J,Carda-Broch S,Berthod A.J.Chromatogr.A，2006，1119(1/2):202-208.

[9] Bian M,Zhang Z J,Yin H.J.Pharm.Biomed．,2012,58:163-167.

[10] He L J,Zhang W Z,Zhao L,Liu X,Jiang S X.J.Chromatogr.A,2003，1007(1/2):39-45.

[11] Petruczynik A.J.Chromatogr.Sci.,2012,50:287-293.

[12] Li S N,Tian M L,Row K H.Int.J.Mol.Sci.,2010,11：2229-2240.

[13] Gao W，Yu H，Zhou S.Chin.J.Chromatogr．(高微，于泓，周爽．色譜)，2010，28(1):14-22.

[14] Huang Y,Yao S,Hang S.J.Chromatogr.Sci.,2013,51:739-752.

[15] Hashem H,Jira T.J.Chromatogr.A,2006，1133:69-75.

[16] Snyder L R.PracticalHPLCMethodDevelopment.2nd ed.Zhang Y K,transl.Beijing:Hua Wen Press(L.R.森德爾.實用高效液相色譜法的建立.2版.張玉奎,譯.北京:華文出版社)，2001.

[17] Geng X D,Regnier F E.J.Chromatogr.,1984,296:15-30.

Separation of Tropane Alkaloids by HPLC with Ionic Liquid as Mobile Phase Additive

FANG Hai-hong1,2，ZHU Yi-lei2,3，WEI Hui-zhen3，JIN Hao-xin3，YIN Wen-jing2，RAO Yi2*

(1.School of Pharmacy，Jiangxi Science & Technology Normal University,Nanchang 330013，China；2.School of Pharmacy，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006，China；3.National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation in Chinese Herbal Medicine,Nanchang 330006,China)

A novel analytical method was developed for the separation of tropane alkaloids by high performance liquid chromatography(HPLC) using ionic liquid(OminPF6) as mobile phase additive.The retention model and mechanism for the ionic liquid were also illustrated.The effect factors,including wavelength of detection,type and proportion of organic phase,pH value,type and concentration of ionic liquid and buffer salt system on retention behavior of components were investigated.The results showed that,the ionic liquid as mobile phase additive could significantly improve the separation effect on tropane alkaloids,and also increase the symmetry of peak and the relative separation.The results also showed that the relationship between capacity factor and concentrations of ionic liquid preferably complied with the stoichiometric displacement model for retention(SDM-R)，and the retention process of alkaloids was mainly based on competitive adsorption function.

ionic liquid； high performance liquid chromatography(HPLC)；tropane alkaloids；retention behavior；retention mechanism

2015-11-04；

2015-11-18

江西省科技廳青年科學(xué)基金項目(20132BAB215024)；江西省研究生創(chuàng)新專項資金項目(YC2015-S348)；江西中醫(yī)藥大學(xué)校級碩士研究生創(chuàng)新專項資金項目(JZYC15S2)；江西省教育廳科研項目(GJJ13580);江西科技師范大學(xué)科研項目(2013XJZD004)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.021

O657.72;TQ460.72

A

1004-4957(2016)05-0614-04

*通訊作者：饒 毅，教授，研究方向:中藥分析，Tel:0791-7119609,E-mail:fxs_ry021228@126.com