王金鳳，胡 鵬，牛虹博，陳良標

(1.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306；2.上海海洋大學省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306)

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低溫脅迫對魚類PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的影響

王金鳳1,2，胡 鵬1,2，牛虹博1,2，陳良標1,2

(1.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306；2.上海海洋大學省部共建水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306)

為探討PI3K/AKT/GSK-3β信號通路在魚類低溫脅迫中的分子機制，利用3種抗寒能力不同的魚類：斑馬魚(Daniorerio)、羅非魚(Oreochromisniloticus)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)，對其進行低溫脅迫(8℃)，監(jiān)測這3種魚魚鰓中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中蛋白表達情況。結果表明：1)在相同低溫脅迫下，3種魚運動能力為：草魚 > 斑馬魚 > 羅非魚；2) Western blot結果表明：在羅非魚中，低溫抑制了p-PTEN蛋白的表達；誘導了AKT、p-AKT(Ser 473)和p-GSK-3β(Ser 9)蛋白的表達。在斑馬魚和草魚中，低溫都抑制了AKT和p-AKT(Ser 473)蛋白的表達；誘導了p-GSK-3β(Ser 9)蛋白的表達。盡管低溫一致性誘導p-GSK-3β(Ser 9)在3種魚中的表達，但其呈現(xiàn)不同的變化倍數：羅非魚中p-GSK-3β蛋白的上升倍數顯著高于其他兩種魚。低溫誘導了PI3K/AKT/GSK-3β信號通路，在不同低溫耐受能力的魚中呈現(xiàn)出不同的表達模式，這些物種特異性的表達模式可能會影響魚類低溫下不同的耐受能力。

低溫脅迫；魚；AKT；GSK-3β；信號通路

在魚類的生存條件中，水溫占有重要位置，溫度是限制魚類地域分布的一個重要因素[1]。 魚類在它們適宜的溫度范圍內生存，一旦水溫低于其適宜范圍的時候，低溫脅迫會引起低溫壓力造成魚全身的生理應激反應，會擾亂機體正常的生理活動，甚至會導致死亡[2-4]。魚類是全世界分布最為廣泛的脊椎動物之一，不同棲息溫度的魚類，具有不同的低溫耐受能力[5]。而不同魚種之間的低溫耐受能力之間存在哪些差異，這將為文章研究魚類低溫適應的分子機制提供方向。

磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide-3-kinase,PI3K)在細胞生長、存活、代謝調控等細胞的生理活動中發(fā)揮了重要的作用[6]。PI3K能催化質膜上的磷酸肌醇(PI)而生成二級信使PI-3,4,5-triphosphate (PIP3)。PIP3能招募細胞內信號蛋白(phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1)和AKT到膜上，促使PDK1磷酸化AKT蛋白來激活AKT。AKT的活性是受到其上面兩個氨基酸位點的磷酸化的控制：第308位的絡氨酸(308 Tyr)和第473位的絲氨酸(473 Ser)。AKT能夠磷酸化GSK-3β[7]第9位的Ser(9 Ser)而抑制GSK-3β的活性，導致核內cyclin D1蛋白積累，進而抑制細胞凋亡[8]。另一方面，PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)蛋白可以使PIP3去磷酸化，變成PI(4,5)P2(3)，來抑制PI3K/AKT通路[9]。

近年來，隨著二代測序技術的發(fā)展，在基因組層面解析魚類低溫脅迫下轉錄組變化，研究者們鑒定出了大量與低溫脅迫相關的候選基因和信號通路。尤其是在鳉魚(Austrofunduluslimnaeus)[10]、斑馬魚[11-12]和南極魚(Dissostichusmawsoni)[13]的轉錄組分析中，研究者們發(fā)現(xiàn)參與到細胞周期的調控基因，其表達量受到強烈的誘導，這些結果都表明低溫壓力會嚴重影響魚類細胞周期的變化。目前，PI3K/AKT/GSK-3β信號通路主要是通過基因干預方法敲除或小分子藥物抑制PI3K、AKT及相關基因，阻斷其對下游多種抗凋亡效應分子的活化，促進細胞凋亡[21]，但在低溫脅迫下對魚類的細胞存活及細胞周期調控中的作用，目前國內外還尚未有研究報道，結合實驗室前期研究，筆者推測PI3K/AKT/GSK-3β信號通路在魚類低溫脅迫中發(fā)揮一定的作用。

通過對具有不同低溫適應能力的魚類進行比較來解析在低溫適應中發(fā)揮重要作用的信號通路已經成為一種有效的手段[13]。隨著越來越多魚類基因組的發(fā)布，一些魚類成為水生生物在遺傳學和分子生物學上的研究熱點，例如：斑馬魚[14]、羅非魚[15]和草魚[16]。斑馬魚作為一種被廣泛研究的模式熱帶魚，其溫度適應范圍比羅非魚大，能在一定時間內忍受9℃的低溫[17]；羅非魚是一種具有較高經濟價值的重要的養(yǎng)殖熱帶魚類，很難在低于10℃的水溫下生存[18]；草魚適應能力很強，在0℃～38℃的溫度范圍內都能生存。在本研究中，我們利用這3種抗寒能力不同的魚類：斑馬魚、羅非魚和草魚。通過實驗室統(tǒng)一養(yǎng)殖，對這3種魚進行相同的低溫脅迫(8℃)，來監(jiān)測在相同低溫壓力下，3種魚魚鰓中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路中蛋白表達情況，為研究魚類低溫適應相關的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 魚種

野生型羅非魚來自中國山東青島羅非魚良種場；野生型斑馬魚來自中科院北京遺傳與發(fā)育生物學研究所，都在實驗室條件下人工飼養(yǎng)和繁殖。野生型草魚來自上海海洋大學李家樂研究員實驗室。斑馬魚和羅非魚最適應生長溫度為28℃，草魚最適生長溫度范圍為20℃～30℃之間。為消除初始溫度的不同而引起的誤差，實驗室統(tǒng)一飼喂在28℃至少2個月以上，均取6個月齡的魚用于實驗研究。

1.2 降溫策略及采樣

降溫策略參照文獻[12]。大致如下：水溫在12 h內從28℃勻速降到18℃，在18℃適應12 h后，在12 h內繼續(xù)勻速降到8℃。一旦羅非魚失去平衡(時間點約在36 h)，立即收集組織，同時收集斑馬魚和草魚的鰓組織用于后續(xù)分析。并取28℃魚鰓樣品作對照，每個實驗點進行3次重復。

1.3 主要試劑和儀器

RIPA Buffer蛋白裂解液、cocktail和PMSF蛋白酶抑制劑來自Sigma公司；30%丙烯酰胺購于Solarbio公司；TEMED為生工公司產品；β-actin單抗與羊抗兔IgG-HRP均購于杭州華安生物技術有限公司；Phospho-AKT Pathway Antibody Sampler Kit購于CST公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL顯影液購于Thermo公司；4x SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購于Takara公司；常規(guī)試劑均為國產分析純試劑。

主要儀器：凝膠成像系統(tǒng)(Amersham Imager 600)來自GE公司；垂直電泳儀Power PAC HC 來自Bio-Rad公司；離心機和移液器均為Eppendorf公司產品；-86℃冰箱為Thermo 公司產品；-20℃和4℃冰箱為中國海爾公司產品。

1.4 魚鰓蛋白的提取

由于斑馬魚個體較小，考慮到需要足夠的蛋白用于實驗研究，筆者混合了3條斑馬魚魚鰓組織同一個溫度下的樣本，并置于含蛋白裂解液(PMSF+cocktail)的勻漿器中進行裂解，實驗進行3次生物學重復；同時將斷頭后的羅非魚和草魚提取出的鰓組織置于含有液氮的研缽中進行研磨至粉末，置于冰上用蛋白裂解液進行裂解，一個樣本來自于一條魚，實驗進行3次生物學重復。最后，將裂解好的樣品在4℃ 12 000 r/min離心15～20 min，收集上清用于后續(xù)實驗。

1.5 Western blot

收集好的蛋白樣品先用BCA法測蛋白濃度。根據測得的結果，對其進行調試。然后向調試后的蛋白樣品中加入4×Protein loading buffer，沸水煮10～15 min，在12% SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質，然后將蛋白轉移至PVDF膜上，再用5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別用β-actin 與Phospho-AKT Pathway Kit ( 其中一抗為AKT、p-AKT、p-GSK-3β、p-PTEN ) 中的一抗4℃孵育過夜，用羊抗兔IgG-HRP二抗封閉液封閉2 h，用ECL顯影曝光拍照，分析蛋白表達變化。

1.6 數據統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 低溫脅迫下魚運動能力的觀察

當水溫降低到8℃的時候，羅非魚不能維持身體平衡；斑馬魚能維持身體平衡，但是具有較少的游動；草魚能繼續(xù)保持活躍游動。運動能力比較如下：草魚 > 斑馬魚 > 羅非魚。

2.2 低溫對PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的影響

2.2.1 羅非魚PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的影響

在羅非魚鰓中，低溫抑制了p-PTEN蛋白的表達；而誘導了AKT、p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達(圖1)。

圖1 羅非魚鰓中p-PTEN、AKT、p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達情況

Fig 1 The expression level of p-PTEN,AKT(Ser473),p-AKT(Ser473) and p-GSK-3β(Ser9) in tilapia gill

a：Western blot檢測常溫28℃和低溫8℃下蛋白表達水平；b：低溫處理下蛋白表達情況柱形圖。β-actin作為內參；圖中所示為均值±標準誤，數據來自至少3次獨立的生物學重復；*表示顯著差異(P< 0.05)

2.2.2 斑馬魚PI3K/AKT/GSK-3β信號通路的影響

在斑馬魚鰓中，低溫抑制了AKT和p-AKT(Ser473)蛋白的表達；而誘導了p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達(圖2)。值得注意的是，檢測磷酸化PTEN的抗體，由于特異性較差，而未能捕獲到p-PTEN的表達。

圖2 斑馬魚鰓中p-PTEN、AKT、p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達情況

Fig 2 The expression level of p-PTEN,AKT,p-AKT(Ser473) and p-GSK-3β(Ser9) in zebrafish gill

a：Western blot檢測常溫28℃和低溫8℃下蛋白表達水平(n.d.表示未檢測到)；b：低溫處理下蛋白表達情況柱形圖。β-actin作為內參；圖中所示為均值±標準誤，數據來自至少3次獨立的生物學重復；*表示顯著差異(P< 0.05)

2.2.3 草魚PI3K/AKT/GSK-3β(Ser9)信號通路的影響

在草魚鰓中，低溫抑制了AKT和p-AKT(Ser473)蛋白的表達；而誘導了p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達(圖3)。 PTEN蛋白磷酸化水平在低溫下沒有顯著變化(圖3)。

2.2.4 3種魚之間蛋白表達差異

從圖1～3中可以看出，低溫在羅非魚中誘導了AKT和p-AKT(Ser473)的表達；而在斑馬魚和草魚中則相反。對于p-GSK-3β(Ser9)蛋白，低溫一致性誘導了其在3種魚鰓中的表達，呈現(xiàn)出不同的變化倍數：在羅非魚中上升10.72 ± 0.80倍；而在斑馬魚和草魚中分別上升1.47 ± 0.13倍和1.50 ± 0.08倍。低溫下羅非魚p-GSK-3β(Ser9)蛋白的上升倍數顯著高于其他兩種魚 (圖4)。

圖3 草魚鰓中p-PTEN、AKT、p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達情況

Fig 3 The expression level of p-PTEN,AKT,p-AKT(Ser473) and p-GSK-3β(Ser9) in grass carp gill

a：Western blot檢測常溫28℃和低溫8℃下蛋白表達水平；b：低溫處理下蛋白表達情況柱形圖。β-actin作為內參；圖中所示為均值±標準誤，數據來自至少3次獨立的生物學重復；*表示顯著差異(P< 0.05)

圖4 在3種魚中低溫誘導p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達變化

Fig 4 The fold changes of p-GSK-3β(Ser9) at low temperature (8℃) in three fish species

注：圖中表達變化為低溫和常溫下表達量的比值；數據所示為均值±標準誤，來自至少3次獨立的生物學重復；差異的顯著性用不同字母來表示

3 討論

在之前的研究中，作者通過轉錄組分析對極地魚類適應低溫的分子機制進行了解析[13]，還有通過在斑馬魚中對低溫脅迫下的轉錄組進行分析[12]，都發(fā)現(xiàn)低溫會強烈誘導與細胞周期相關基因的表達變化。PI3K/AKT通路[19]是調控細胞生長和存活的一條經典的重要通路，GSK-3β作為PI3K/AKT通路中下游重要的蛋白，不但能調控糖原的代謝，而且在調控細胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮了廣泛的作用。目前為止，PI3K/AKT/GSK-3β在魚類低溫脅迫和低溫適應中發(fā)揮的作用尚未可知。在本研究中，筆者通過對3種低溫耐受能力不同的魚類(低溫耐受能力：草魚 > 斑馬魚 > 羅非魚)進行低溫脅迫，發(fā)現(xiàn)低溫下AKT和GSK-3β蛋白在3種魚間呈現(xiàn)出不同的表達模式和表達水平的變化。這說明PI3K/AKT/GSK-3β通路在魚類低溫脅迫和適應中發(fā)揮了重要的作用。

在PI3K/AKT通路中，PI3K能夠磷酸化磷酯酰肌醇二磷酸(PIP2)生成PIP3，PIP3一旦被激活，能夠在空間上拉近PDK1與AKT的距離，從而讓PDK1磷酸化AKT第308位的絡氨酸來激活AKT[20]。 AKT的磷酸化修飾會隨后激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTORC1，來增強蛋白合成等；而另外一個哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTORC2能夠磷酸化AKT第473位的絲氨酸來進一步完全激活AKT?；罨腁KT通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、GSK-3、FKHR、p21Cip1、p27Kip1等，進而調節(jié)細胞存活、增殖、分化和凋亡等[21]，但在魚類中的研究尚未可知。筆者檢測了AKT蛋白的總量和p-AKT(Ser473)，發(fā)現(xiàn)在耐受能力較弱的羅非魚中(8℃低溫導致羅非魚失去平衡)，無論是AKT還是p-AKT(Ser473)被強烈地誘導；而在耐寒能力較強的斑馬魚和草魚中，AKT和p-AKT(Ser473)呈現(xiàn)出低溫抑制的趨勢。對于魚類來說，這可能是由于較弱的低溫應激會導致AKT的下調，在一定程度上可能通過上調細胞凋亡清除功能受到損害的細胞，維持組織的正常功能；而強烈的低溫應激會反饋調控AKT蛋白的上調，加速細胞增殖和分化以維持細胞存活。

與AKT蛋白作用相反，PTEN是一個腫瘤抑制因子，它能通過把PIP3去磷酸化成PIP2而抑制AKT的磷酸化，從而促進細胞凋亡。筆者在羅非魚觀察到了相應的表達模式：低溫誘導了AKT的表達，抑制了PTEN的表達。而在耐寒的草魚中，雖然磷酸化的AKT表達量降低，但是PTEN的表達水平保持穩(wěn)定。這暗示在草魚中AKT可能通過PTEN非依賴的途徑來激活。近年來，在哺乳動物乳腺癌研究中也表明有PTEN非依賴的途徑來激活AKT[22]。在草魚中，需要更多的研究證明這一點。

GSK-3β[23]是一個絲氨酸/絡氨酸蛋白酶，在調控細胞增殖分化和血糖水平中發(fā)揮了重要的作用，它的活性主要受到兩個氨基酸位點的控制：第216位的絡氨酸Tyr和第9位的絲氨酸Ser。 AKT能夠磷酸化GSK-3β第9位的Ser而抑制GSK-3β的活性。同樣，低溫脅迫下羅非魚中的AKT與GSK-3β第9位Ser的磷酸化水平都顯著升高，但二者之間具體的聯(lián)系還有待進一步探討。而在斑馬魚和草魚中，盡管AKT的表達受到低溫抑制，但是GSK-3β第9位Ser的磷酸化水平反而升高，一個可能的原因是在斑馬魚和草魚中GSK-3β中Ser的磷酸化水平主要是受到AKT第308位的Tyr調控而不是第473位的Ser。在3種魚中，低溫普遍誘導了GSK-3β中Ser的磷酸化水平而抑制了GSK-3β的活性。值得注意的是，盡管低溫都誘導了GSK-3β中Ser的磷酸化水平，但是其誘導水平有差異：與斑馬魚和草魚相比，羅非魚中GSK-3β磷酸化水平強烈升高。這樣會導致大量GSK-3β失活，從而嚴重影響羅非魚體內細胞代謝和糖原合成。結合3種魚中低溫下的運動能力，推測GSK-3β中Ser的磷酸化水平可能作為低溫應激反應的一個指標來揭示不同魚類之間低溫下的應激反應。

綜上所述，低溫誘導了PI3K/AKT/GSK-3β信號通路，在不同低溫耐受能力的魚中呈現(xiàn)出不同的表達模式，這些物種特異性的表達模式可能會影響魚類在低溫下細胞凋亡、生存、糖代謝等方面的耐受能力。其中一些表達差異的關鍵蛋白如AKT和GSK-3β等，能為研究魚類低溫脅迫或者適應的分子機制提供一個很好的切入點，但其確切的分子信號通路有待進一步探討。

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Effect of cold stress on PI3K/AKT/GSK-3β signal pathway in fishes

WANG Jing-feng1,2,HU Peng1,2,NIU Hong-bo1,2,CHEN Liang-biao1,2

(1.College of Aquaculture and Life; 2.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Ministry of Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

To investigate the PI3K/AKT/GSK-3β signaling pathway in fish cold regulatory mechanism,three fish species,including tilapia (Oreochromisniloticus),zebrafish (Daniorerio) and grass carp (Ctenopharyngodon-idellus),were exposed to the cold temperature (8℃).They were reared at a common temperature (28℃) but had different cold tolerance (grass carp > zebrafish > tilapia).The expression of protein in the PI3K/AKT/GSK-3β pathway were examined.Results showed that the swimming performance decreased in turn: grass carp,zebrafish and tilapia.In tilapia,the expression of p-PTEN was decreased at cold temperature,whereas the expression of AKT,p-AKT(Ser 473) and p-GSK-3β(Ser 9) was increased at 8℃.Both in zebrafish and in grass carp,the expression of AKT,p-AKT(Ser 473) was repressed at 8℃,whereas the expression of p-GSK-3β(Ser 9) was induced at 8℃.Although the expression of p-GSK-3β(Ser 9) was commonly induced at cold temperature,and the increased abundance varied in the three fish species.The induction of p-GSK-3β(Ser 9) at 8℃ in tilapia was more significantly than that in other two fishes.PI3K/AKT/GSK-3β signaling pathway is involved in cold response and whose regulation vary in the fish species,which may contribute to the various cold tolerance of fishes.

cold stress; fishes; AKT; GSK-3β; signal pathway

2016-01-22；

2016-02-14

收稿日期：國家“973”重點基礎研究發(fā)展計劃(2010CB126304)；國家基金委重點項目(31130049)；上海市一流學科水產基礎生物學(滬教科 2012-62)

王金鳳 ，碩士研究生，從事分子生物學研究，E-mail:jinyu1124829@163.com

陳良標,博士，教授，從事發(fā)育、分子生物學研究，E-mail: lbchen@shou.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.024

S917.4;Q75

A

2095-1736(2016)06-0024-05