陳愉生，陳小燕，陳正偉，黃文森，李鴻茹，許能鑾

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·方法學研究·

單純煙霧暴露建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的方法學研究

陳愉生，陳小燕，陳正偉，黃文森，李鴻茹，許能鑾

目的 探討單純煙霧暴露建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型的方法，為COPD動物模型的建立提供參考。方法 將24只Wistar大鼠隨機分為對照組、煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組、煙霧暴露12組，每組6只。將煙霧暴露組大鼠置于自制玻璃染毒箱中，煙霧暴露2 h/d，5 d/周；對照組大鼠同時放在另一自制玻璃染毒箱中，自由呼吸空氣。觀察各組大鼠一般情況，比較各組大鼠肺功能指標、支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)及肺組織病理學檢查結(jié)果。結(jié)果 (1)一般情況：對照組大鼠整個實驗過程中活動正常，毛發(fā)白亮細密，精神佳，無氣促、發(fā)紺，食量好；煙霧暴露8周組大鼠活動減少，倦臥，毛發(fā)黃澀無光澤；煙霧暴露10周組大鼠活動進一步減少，精神不佳，毛發(fā)黃澀，食欲下降，間歇咳嗽偶有喘息；煙霧暴露12周組大鼠活動較煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組大鼠減少，精神萎靡，毛發(fā)枯糙發(fā)黃脫落，口唇及指抓發(fā)紺，消瘦。(2)肺功能指標：煙霧煙霧暴露12周組大鼠0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)和肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)低于對照組、煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組，吸氣阻力(Ri)和呼氣阻力(Re)高于對照組、煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組(P<0.05)；煙霧暴露8周組和煙霧暴露10周組大鼠Cdyn低于對照組(P<0.05)。(3)支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)結(jié)果：煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組、煙霧暴露12周組大鼠炎性細胞計數(shù)和中性粒細胞分數(shù)高于對照組，巨噬細胞分數(shù)低于對照組(P<0.05)；但4組大鼠淋巴細胞分數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(4)肺組織病理學檢查結(jié)果顯示，對照組大鼠支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，氣道黏膜上皮細胞排列整齊，肺泡大小均勻；煙霧暴露8周組大鼠肺組織以炎性細胞浸潤為主；煙霧暴露10周組大鼠肺組織炎性細胞浸潤更明顯，氣管壁平滑肌、纖維結(jié)締組織增生，可見少許肺泡壁破壞；煙霧暴露12周組大鼠氣道上皮脫落，氣道內(nèi)黏液和細胞阻塞，肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡擴張，肺泡間隔斷裂，相鄰肺泡融合形成肺大泡，小血管壁增厚。結(jié)論 在自制玻璃染毒箱中單純煙霧暴露12周可成功建立COPD大鼠模型。

肺疾病，慢性阻塞性；煙霧；大鼠；模型，動物；方法學研究

陳愉生，陳小燕，陳正偉，等.單純煙霧暴露建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的方法學研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(10)：58-62.[www.syxnf.net]

CHEN Y S，CHEN X Y，CHEN Z W，et al.Methodological study for modelling rat model of COPD caused by simple smog exposure[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(10)：58-62.

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種病因復雜的慢性常見病、多發(fā)病，可嚴重危害人類健康，且其確切發(fā)病機制尚未完全明確。目前，臨床上關(guān)于COPD的治療仍局限于對癥治療，而建立理想COPD動物模型對預防和治療COPD具有重要意義。國內(nèi)外學者目前比較認可采用單純煙霧暴露方法建立COPD動物模型，但該建模方法與其他建模方法相比尚不成熟。盡管目前臨床研究者對單純煙霧暴露建立COPD模型進行了較多研究，但方法學尚未統(tǒng)一，且國內(nèi)對該動物模型的疾病發(fā)展過程報道較少[1-2]。本研究旨在探究單純煙霧暴露建立COPD大鼠模型的方法，并擬通過動態(tài)評價肺組織病理學改變、肺功能指標、支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)等觀察COPD發(fā)展過程，為COPD動物模型的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠24只，雄性，周齡8周，體質(zhì)量(202±5)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司〔SCXX(滬)：SCXX(滬)2012-0002〕，飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學科SPF級動物實驗室〔SYXX(閩)2013-0004〕，所用飼料、水、墊料均經(jīng)過嚴格滅菌處理，并按照動物實驗的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 試劑及儀器 紅梅(軟黃)香煙由紅塔煙草(集團)有限責任公司生產(chǎn)，包含焦油量12 mg、煙氣煙堿量1.1 mg、煙氣一氧化碳量13 mg；自制玻璃染毒箱(見圖1)：大小80 cm×70 cm×60 cm，玻璃箱1/2處有一玻璃隔層，隔層上有16個孔均勻分布，頂端有一直徑5 cm的圓孔，前面是一可推拉的玻璃門，玻璃箱下1/2處放置一電風扇；RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone，美國)，小鼠灌胃針，細胞離心涂片機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)，AniRes2005動物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司)；自制氣管插管：臨床用一次性輸液器，使用時在細端1 cm處剪斷，剪切面的角度為15°。

注：A為示意圖，B為實圖

1.3 實驗分組及處理 大鼠正常飼養(yǎng)7 d無異常后進行分組。將24只大鼠隨機分為對照組、煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組、煙霧暴露12周組，每組6只。將煙霧暴露組大鼠放在自制玻璃染毒箱的隔層上，可自由活動、進食、飲水，在玻璃箱下1/2處點燃香煙，1 h/次，2次/d，每次間隔5 h以上，5 d/周。香煙量隨著周數(shù)增加而增多，第1周為9支/次、第2周為12支/次、第3周為15支/次、第4～12周為20支/次。對照組大鼠同時放在另一自制玻璃染毒箱中，自由呼吸空氣。

1.4 肺功能指標測定方法 實驗結(jié)束后各組大鼠采用3%戊巴比妥鈉(110 mg/kg)進行腹腔麻醉，麻醉滿意后分離氣管，在第3、4氣管環(huán)中間做一倒“T”形切口，將自制氣管插管插入氣管中，用手術(shù)縫合線系緊，放入體描箱，將氣管與體描箱氣路相連，并以相當于潮氣量3倍的氣量充氣造成深吸氣，然后立即放開，連接負壓〔-10 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)〕抽氣造成深呼氣。計算機通過容積變化計算0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)、吸氣阻力(Ri)、呼氣阻力(Re)及肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)。

1.5 支氣管肺泡灌洗炎性細胞計數(shù)方法 測定完肺功能指標后，腹主動脈放血處死大鼠，采用小鼠灌胃針氣管插管至右主支氣管，并結(jié)扎左主支氣管，向右肺灌注無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基5 ml，同時按摩肺臟30 s后回收，重復8次，回收率為90%。將回收的支氣管肺泡灌洗液置于尖底離心管中，1 000 r/min離心10 min，吸棄上清液。加入1 ml RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，充分吹打混勻。取10 μl細胞懸液，采用血球計數(shù)板進行總細胞計數(shù)；另取100 μl細胞懸液，采用細胞離心涂片機進行涂片，自然干燥，瑞士染色后進行炎性細胞分類計數(shù)。

1.6 肺組織病理學檢查方法 支氣管肺泡灌洗后，結(jié)扎右主支氣管，松開左主支氣管，并注入4%多聚甲醛至左肺膨脹，隨后在左肺大徑處取大約3 mm厚組織塊，采用4%多聚甲醛固定72 h，石蠟包埋，3 μm切片，常規(guī)HE染色，通過光學顯微鏡進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照組大鼠整個實驗過程中活動正常，毛發(fā)白亮細密，精神佳，無氣促、發(fā)紺，食量好；煙霧暴露8周組大鼠活動減少，倦臥，毛發(fā)黃澀無光澤；煙霧暴露10周組大鼠活動進一步減少，精神不佳，毛發(fā)黃澀，食欲下降，間歇咳嗽偶有喘息；煙霧暴露12周組大鼠活動較煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組大鼠減少，精神萎靡，毛發(fā)枯糙發(fā)黃脫落，口唇及指抓發(fā)紺，消瘦。

2.2 肺功能指標 4組大鼠FEV0.3/FVC、Ri、Re及Cdyn比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組、煙霧暴露8周組和煙霧暴露10周組大鼠FEV0.3/FVC、Ri、Re比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；煙霧暴露12周組大鼠FEV0.3/FVC和Cdyn低于對照組、煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組，Ri和Re高于對照組、煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；煙霧暴露8周組和煙霧暴露10周組大鼠Cdyn低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 4組大鼠肺功能指標比較

2.3 支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)結(jié)果 4組大鼠支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)、巨噬細胞分數(shù)及中性粒細胞分數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但4組大鼠淋巴細胞分數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。煙霧暴露8周組、煙霧暴露10周組、煙霧暴露12周組大鼠炎性細胞計數(shù)和中性粒細胞分數(shù)高于對照組，巨噬細胞分數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 4組大鼠支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)結(jié)果比較

2.4 肺組織病理學檢查結(jié)果 肺組織病理學檢查結(jié)果顯示，對照組大鼠支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，氣道黏膜上皮細胞排列整齊，肺泡大小均勻(見圖2A、2B)；煙霧暴露8周組大鼠肺組織以炎性細胞浸潤為主(見圖2C、2D)；煙霧暴露10周組大鼠肺組織炎性細胞浸潤更明顯，氣管壁平滑肌、纖維結(jié)締組織增生，可見少許肺泡壁破壞(見圖2E、2F)；煙霧暴露12周組大鼠氣道上皮脫落，氣道內(nèi)黏液和細胞阻塞，肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡擴張，肺泡間隔斷裂，相鄰肺泡融合形成肺大泡，小血管壁增厚(見圖2G、2H)。

注：A、B為對照組大鼠肺組織病理學檢查結(jié)果，C、D為煙霧暴露8周組大鼠肺組織病理學檢查結(jié)果，E、F為煙霧暴露10周組大鼠肺組織病理學檢查結(jié)果，G、H為煙霧暴露12周組大鼠肺組織病理學檢查結(jié)果

3 討論

臨床研究結(jié)果顯示，香煙煙霧暴露建立的COPD動物模型能夠模擬人類COPD相似的病理改變[1-2]。國內(nèi)外許多研究者在不同的實驗條件下建立了煙霧暴露COPD大鼠模型，但至今該造模方法尚未成熟，主要表現(xiàn)為動物暴露裝置、煙霧暴露時間、香煙支數(shù)和動物品種等方面尚未統(tǒng)一[2]，且國內(nèi)該方面的研究報道甚少。目前，香煙煙霧暴露建立COPD動物模型較多用于COPD發(fā)病機制及新藥物的研究，但煙霧染毒裝置種類少且價格昂貴。由于經(jīng)濟條件有限許多實驗室無法采購煙霧染毒裝置，故本研究根據(jù)相關(guān)研究報道自制玻璃染毒箱[3-4]，并采用該裝置成功建立單純煙霧暴露COPD大鼠模型。本研究結(jié)果證實，自制玻璃染毒箱空間和通氣孔足夠，可保證大鼠自由活動、通氣，還可有效避免實驗動物窒息死亡，且制造價格低，因此該裝置具有可行、安全、經(jīng)濟等優(yōu)點，可適用于大多數(shù)實驗室。據(jù)以往有關(guān)煙霧暴露建立COPD大鼠模型的報道，煙霧暴露時間為8～36周[1]，故本研究設(shè)置了8、10、12周3個時間點。

目前，COPD動物模型的成功標準主要依據(jù)肺組織病理學改變和肺功能改變，其中肺組織病理學改變主要如下：氣道黏膜下腺體增生肥大、分泌功能亢進，周圍大量炎性細胞浸潤、黏液分泌增多，纖毛細胞變性壞死，杯狀細胞增多、黏膜上皮局灶性增生及鱗狀上皮化生，氣道內(nèi)可見細胞和黏液阻塞；肺內(nèi)源性蛋白酶/抗蛋白酶失衡導致氣道平滑肌和纖維結(jié)締組織增生；肺內(nèi)呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴大，肺泡壁多處斷裂，部分肺泡融合形成肺大泡，肺泡數(shù)量及大小也出現(xiàn)不同程度改變[5-8]。肺功能改變主要如下：存在氣流阻塞、小氣道阻力增高、Cdyn下降；氣道重塑；伴有氣道高反應(yīng)性[9]。筆者認為一個符合臨床實際的理想COPD動物模型應(yīng)具備以下特點：致傷因素與臨床COPD常見病因基本一致；存在COPD肺組織病理學改變；存在氣流阻塞、小氣道阻力增高、Cdyn下降等肺功能改變。煙霧是COPD的常見病因，本研究結(jié)果顯示，隨著單純煙霧暴露時間延長大鼠肺組織出現(xiàn)了漸進性破壞，直至煙霧暴露12周大鼠出現(xiàn)了肺氣腫和氣道非特異性炎癥等典型COPD組織病理學改變；同時肺功能指標顯示，大鼠肺組織氣道阻力增高、Cdyn下降，提示單純煙霧暴露12周能復制出COPD動物模型。除此之外，本研究還觀察了支氣管肺泡灌洗液炎性細胞計數(shù)結(jié)果。有研究顯示，支氣管肺泡灌洗液細胞計數(shù)及分類能準確反映氣道炎癥，且COPD患者支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞以中性粒細胞為主[10]，本研究結(jié)果與之相符，進一步說明COPD動物模型建立成功。

臨床研究顯示，無呼吸道癥狀的吸煙者常規(guī)肺通氣功能指標常在參考范圍內(nèi)，但小氣道功能可能受損，且呼吸阻抗是判斷氣流阻塞的敏感指標[11]。但本研究結(jié)果顯示，單純煙霧暴露12周的大鼠Re、Ri才高于對照組，與以上研究結(jié)果不符，分析原因可能為大鼠的氣道解剖結(jié)構(gòu)與人類存在差異，大鼠缺少廣泛的氣管分支、無呼吸性細支氣管[12]，故無法復制煙霧導致人類早期小氣道損傷過程。黏液化生和氣管腔內(nèi)黏液過度分泌可導致氣流受阻和管腔閉塞，從而增加氣道阻力。本研究煙霧暴露12周組大鼠肺組織病理學檢查結(jié)果顯示大鼠氣道內(nèi)細胞和黏液阻塞，氣道阻力增加，這與肺功能檢查結(jié)果相一致。但由于實驗室條件有限，本研究未對肺組織病理切片進行形態(tài)定量分析，僅通過顯微鏡觀察肺組織病理學改變，故不能否定煙霧暴露8周組和煙霧暴露10周組大鼠未出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)改變。

綜上所述，在自制玻璃染毒箱單純煙霧暴露12周可成功建立COPD大鼠模型，且建造COPD大鼠模型的過程能在一定程度上復制人類COPD的主要病理特征。

作者貢獻：許能鑾、陳愉生、陳小燕進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；陳小燕、陳正偉、黃文森、李鴻茹進行實驗實施、評估、資料收集；許能鑾進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：謝武英)

Methodological Study for Modelling Rat Model of COPD Caused by Simple Smog Exposure

CHENYu-sheng，CHENXiao-yan，CHENZheng-wei，HUANGWen-sen，LIHong-ru，XUNeng-luan.DepartmentofRespiratoryMedicine，F(xiàn)ujianProvincialClinicalMedicineCollege(FujianProvincialHospital)，theFourthResearchLaboratoryforRespiratoryDiseaseofFujianProvince，F(xiàn)uzhou350001，China

XUNeng-luan，DepartmentofRespiratoryMedicine，F(xiàn)ujianProvincialClinicalMedicineCollege(FujianProvincialHospital)，theFourthResearchLaboratoryforRespiratoryDiseaseofFujianProvince，F(xiàn)uzhou350001，China；E-mail：xnlldc@163.com

Objective To explore the model replicating methods of rat model of COPD caused by simple smog exposure.Methods A total of 24 Wistar rats were randomly divided into control group，8-week smog exposure group，10-week smog exposure group，12-week smog exposure group，each of 6 rats.Rats of 8-week smog exposure group，10-week smog exposure group and 12-week smog exposure group were put in homemade glass box for infection，the frequency of smog exposure was 2 hours per day，5 days per week；rats of control group were put in other homemade glass box for infection with breathing the air.General conditions of the four groups were observed，index of pulmonary function，bronchoalveolar lavage fluid inflammatory cells count and pathology examination results of lung tissue were compared among the four groups.Results (1)General conditions：rats of control group performed normal activities during the experiment with white fine hair，good spirit and food intake，without anhelation or cyanosis；rats of 8-week smog exposure group performed less activity and tired of lying，with yellow unsmooth unglazed hair；rats of 10-week smog exposure group performed less activity and poor spirit，with yellow unsmooth hair and loss of appetite，intermittent cough and wheeze；rats of 12-week smog exposure group performed badly less activity than that of 8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group，with drooping spirit，dry rough yellow hair and alopecia，cyanosis of lips and fingernail，emaciation.(2)Index of pulmonary function：forced expiratory volume in 0.3 second and forced vital capacity ratio(FEV0.3/FVC)and pulmonary dynamic compliance(Cdyn)of 12-week smog exposure group were statistically significantly lower than those of control group，8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group，inhalation resistance(Ri)and exhalation resistance(Re) of 12-week smog exposure group were statistically significantly higher than those of control group，8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group(P<0.05)；Cdyn of 8-week smog exposure group and 10-week smog exposure group was statistically significantly lower than that of control group，respectively(P<0.05).(3)Bronchoalveolar lavage fluid inflammatory cells count：inflammatory cells count and neutrophil percentage of 8-week smog exposure group，10-week smog exposure group and 12-week smog exposure group were statistically significantly higher than those of control group，macrophage percentage of 8-week smog exposure group，10-week smog exposure group and 12-week smog exposure group was statistically significantly lower than that of control group，respectively(P<0.05)，while no statistically significant differences of lymphocyte percentage was found among the four groups(P>0.05).(4)Pathology examination results of lung tissue：rats of control group showed clear bronchial and alveolar structure，regular arrange of airway mucosa epithelial cells and well-proportioned pulmonary alveoli；rats of 8-week smog exposure group showed infiltration of inflammatory cells；rats of 10-week smog exposure group showed obvious infiltration of inflammatory cells，hyperplasia of gas pipe wall smooth muscle and fibrous connective tissue with a little destroyed alveolar walls；rats of 12-week smog exposure group showed airway epithelial shedding，mucus and cell blocks in the airway，obvious damage of lung tissue structure，alveolar ectasia，alveolar interval rupture，pulmonary bullae formation and small vessel wall thickening.Conclusion 12-week simple smog exposure in homemade glass box for infection can successfully make the rat model of COPD.

Pulmonary disease，chronic obstructive；Smog；Rat；Models，animal；Methodology research

福建省自然科學基金(2014J01288)

350001福建省福州市，福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院(福建省立醫(yī)院)呼吸內(nèi)科(陳愉生，陳小燕，陳正偉，黃文森，李鴻茹，許能鑾)；福建省呼吸四病研究室(陳愉生，李鴻茹，許能鑾)

許能鑾，350001福建省福州市，福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院(福建省立醫(yī)院)呼吸內(nèi)科，福建省呼吸四病研究室；E-mail：xnlldc@163.com

R 563.9

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2016.10.016

2016-07-12；

2016-10-12)

【編者按】 從科研設(shè)計之初，到科研實施與質(zhì)量控制，再到科研成果報告，方法學研究均發(fā)揮著不可忽視的作用；方法學研究涵蓋了流行病學調(diào)查方法、各種模型建立方法、調(diào)查量表制定與評價方法、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法、臨床指南實踐方法、數(shù)據(jù)庫建立與使用方法等。本期“方法學研究”欄目報道了陳愉生所在課題組采用單純煙霧暴露建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型的方法，實用性強，可重復性好，具有較高的借鑒參考價值，敬請關(guān)注！