張艷紅，魏秀平，王京曄

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·論著·

非小細胞肺癌患者核苷二磷酸激酶1和表皮生長因子受體表達情況及其臨床意義

張艷紅，魏秀平，王京曄

目的 分析非小細胞肺癌(NSCLC)患者核苷二磷酸激酶1(nm23)、表皮生長因子受體(EGFR)表達情況及其臨床意義。方法 選取2010年2月—2014年2月濰坊市婦幼保健院和濰坊市人民醫(yī)院收治的住院NSCLC患者72例作為觀察組，同期在濰坊市婦幼保健院和濰坊市人民醫(yī)院行肺大泡切除術(shù)者25例作為對照組，收集觀察組患者術(shù)中切除的癌組織標本及對照組患者術(shù)中切除的正常肺組織標本。采用免疫組織化學染色法檢測nm23、EGFR表達情況。結(jié)果 癌組織標本中nm23陽性表達率為66.7%，低于正常肺組織標本的84.0%(P<0.05)；癌組織標本中EGFR陽性表達率為58.3%，高于正常肺組織標本的16.0%(P<0.01)。不同性別、年齡、病理類型、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無吸煙史NSCLC患者nm23、EGFR陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者nm23陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者EGFR陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織標本中nm23陽性表達率與EGFR陽性表達率呈負相關(guān)(rs=-0.175，P<0.05)。結(jié)論 NSCLC患者癌組織中nm23呈低表達，EGFR呈高表達，兩者參與NSCLC的發(fā)生且nm23與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

癌，非小細胞肺；NM23核苷二磷酸激酶類；受體，表皮生長因子；免疫組織化學

張艷紅，魏秀平，王京曄.非小細胞肺癌患者核苷二磷酸激酶1和表皮生長因子受體表達情況及其臨床意義[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(10)：54-57.[www.syxnf.net]

ZHANG Y H，WEI X P，WANG J Y.Expressions and clinical significance of nm23 and EGFR in patients with non-small cell lung cancer[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(10)：54-57.

在全球范圍內(nèi)，肺癌是對人類健康威脅最大的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，平均每年新發(fā)肺癌病例約有135萬，死亡病例約有118萬[1]，預計至2030年，肺癌所致死亡將會占到全球所有死亡原因的3.1%[2]；在我國，肺癌發(fā)病率和病死率均位居所有惡性腫瘤首位[3]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占全部肺癌的80%以上，5年生存率約為15%[4]，早期發(fā)現(xiàn)與靶向治療對于改善早期NSCLC患者預后具有重要意義。近年來，分子生物學研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后與癌基因及其產(chǎn)物密切相關(guān)[5]，而關(guān)于NSCLC的研究對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、腫瘤抑制基因p53、核苷二磷酸激酶1(nucleoside diphosphate kinase 1，nm23)的研究報道較多。人nm23基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，而nm23蛋白具有核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK)活性，因此nm23也稱為NDPK或nm23/NDPK。研究表明，高轉(zhuǎn)移性腫瘤組織nm23表達水平明顯低于低轉(zhuǎn)移性腫瘤組織[6]。

基因過表達是癌基因、原癌基因激活的重要機制，EGFR、c-mt等癌基因?qū)倬哂欣野彼峒っ富钚缘纳L因子受體蛋白類癌基因，其中EGFR可通過受體自身擴增、受體配體過表達、活化突變及負性調(diào)節(jié)途徑缺乏等而異?；罨痆7]，進而導致腫瘤細胞異常生物學行為。研究表明，正常肺組織EGFR陽性表達率很低，而小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)組織則不存在EGFR過表達，但NSCLC組織EGFR陽性表達率則為53.1%～69.7%[8]。本研究旨在分析NSCLC患者nm23、EGFR表達情況及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年2月—2014年2月濰坊市婦幼保健院和濰坊市人民醫(yī)院收治的住院NSCLC患者72例作為觀察組，其中男41例，女31例；年齡32～76歲；由濰坊市婦幼保健院兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)2005年WHO標準評定腫瘤病理分型，結(jié)果一致則認可結(jié)果，結(jié)果不一致時則共同討論直至產(chǎn)生一致結(jié)果。選取同期在濰坊市婦幼保健院和濰坊市人民醫(yī)院行肺大泡切除術(shù)者25例作為對照組。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)經(jīng)細胞學或病理學檢查證實為NSCLC且無化療史；(2)未合并其他原發(fā)性腫瘤；(3)參照2009年國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)制定的肺癌TNM分期標準進行分期[9]；(4)臨床資料及實驗室檢查結(jié)果完整并可獲得。排除標準：(1)隨訪資料不完整；(2)隨訪期間因非肺部腫瘤導致死亡；(3)合并其他類型惡性腫瘤。

1.3 染色方法 收集觀察組患者術(shù)中切除的癌組織標本及對照組患者術(shù)中切除的正常肺組織標本，采用10%中性甲醛溶液固定，連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，行常規(guī)HE染色及免疫組織化學染色。(1)HE染色：切片依次經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟、水化，然后經(jīng)蘇木素染色，鹽酸及乙醇分化、氨水返藍后再經(jīng)伊紅染色，最后經(jīng)梯度乙醇及二甲苯脫水后封片。(2)免疫組織化學染色：常規(guī)切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次/5 min,140 ℃高溫修復2.5 min，冷卻后PBS沖洗，然后分別滴入nm23鼠抗人單克隆抗體、EGFR鼠抗人單克隆抗體，正常肺組織切片僅滴入PBS；4 ℃冰箱過夜后用PBS沖洗，滴入二抗后置于37 ℃溫箱0.5 h，用PBS沖洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；于顯微鏡下控制染色時間，之后用自來水沖洗，蘇木素染色，鹽酸及乙醇分化，最后經(jīng)梯度乙醇及二甲苯脫水后封片。免疫組織化學染色過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 染色結(jié)果判定 以腫瘤細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，其中nm23著色于細胞質(zhì)，EGFR著色于細胞膜和/或細胞質(zhì)。根據(jù)染色程度及陽性細胞計數(shù)進行染色評分：腫瘤細胞不著色計0分，出現(xiàn)淡黃色顆粒計1分，出現(xiàn)棕黃色顆粒計2分，出現(xiàn)棕褐色顆粒計3分；無著色腫瘤細胞計0分，著色腫瘤細胞占1%～24%計1分，占25%～50%計2分，占51%～75%計3分，占75%以上計4分。染色程度評分與陽性細胞計數(shù)評分之和為0分者記為(-)，1～2分者記為(+)，3～6分者記為(++)，7～12分者記為(+++)，最終以>4分為陽性表達，≤4分為陰性表達[10]。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以百分數(shù)表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)性分析。檢驗水準α=0.05(雙側(cè))。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學染色結(jié)果 EGFR在癌組織標本中呈高表達，在正常肺組織標本中呈低表達；nm23在癌組織標本中呈低表達，在正常肺組織標本中呈高表達(見圖1)。

2.2 nm23、EGFR陽性表達率 癌組織標本中nm23陽性表達率為66.7%，低于正常肺組織標本的84.0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.41，P=0.036)；癌組織標本中EGFR陽性表達率為58.3%，高于正常肺組織標本的16.0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.34，P<0.01)。

2.3 nm23、EGFR陽性表達率與NSCLC患者臨床病理特征間的關(guān)系 不同性別、年齡、病理類型、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期及有無吸煙史患者nm23、EGFR陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者nm23陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者EGFR陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

注：A為癌組織標本中EGFR的表達，B為正常肺組織標本中EGFR的表達，C為癌組織標本中nm23的表達，D為正常肺組織標本中nm23的表達

表1 nm23、EGFR陽性表達率與NSCLC患者臨床病理特征間的關(guān)系 (例)

2.4 相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織標本中nm23陽性表達率與EGFR陽性表達率呈負相關(guān)(rs=-0.175，P<0.05)。

3 討論

癌基因的激活和抑癌基因的失活在肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，抑癌基因的突變可導致細胞持續(xù)增殖而形成腫瘤[11]。近年來相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者相繼克隆了RB、p53、nm23等抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，學者們希望通過利用抑癌基因而使腫瘤細胞表型恢復正常或誘導腫瘤細胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，抑癌基因nm23在NSCLC患者癌組織標本中呈低表達，癌基因EGFR在NSCLC患者癌組織標本中呈高表達；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者nm23陽性表達率間有差異，而有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者EGFR陽性表達率間無差異，提示nm23的表達與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

nm23基因是通過甄別雜交(減法雜交)克隆技術(shù)而篩選成功的第23號非轉(zhuǎn)移克隆基因，因此稱為nm23。研究表明，將nm23基因?qū)肽[瘤細胞可導致高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榈娃D(zhuǎn)移性腫瘤細胞，其轉(zhuǎn)移率下降57%～96%[13-14]；乳腺癌、結(jié)腸癌患者癌組織中nm23表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。WEST等[15]研究表明，肺癌組織中nm23表達下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存期縮短相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織標本中nm23陽性表達率為66.7%，低于正常肺組織標本的84.0%；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者nm23陽性表達率間存在差異，提示nm23表達與NSCLC的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

EGFR屬具有酪氨酸激酶活性的生長因子受體蛋白類癌基因，是原癌基因表皮生長因子受體1(HER-1)的表達產(chǎn)物，廣泛參與細胞增殖、細胞凋亡及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等[16-17]。JNNE等[18]研究表明，隨著乳腺癌進展，EGFR、erbB2、p53基因及蛋白陽性表達率逐漸升高，且伴有局部轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移的患者腫瘤細胞中EGFR、erbB2、p53基因陽性率明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者。MOTOI等[19]研究表明，約60%的NSCLC患者存在表皮生長因子及其受體的過表達。JEMAL等[20]研究表明，EGFR突變常見于東方人群、女性、不吸煙及腺癌患者。仇曉軍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期NSCLC患者EGFR陽性表達率最高且與組織分型無關(guān)。陳萬青等[22]研究證實，將EGFR作為NSCLC的重要治療靶點，抑制EGFR的表達可阻止腫瘤細胞進一步生長及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織標本中EGFR陽性表達率為58.3%，高于正常肺組織標本的16.0%，提示EGFR表達與NSCLC的發(fā)生相關(guān)[23]；但未發(fā)現(xiàn)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者EGFR陽性表達率間存在差異，分析其原因可能與本研究樣本量較小及納入患者中早期NSCLC患者較多有關(guān)，有待于在今后的研究中擴大樣本量及優(yōu)化早、晚期NSCLC患者構(gòu)成，以進一步驗證本研究結(jié)果。

綜上所述，NSCLC患者癌組織中nm23呈低表達，EGFR呈高表達，二者參與NSCLC的發(fā)生且nm23與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床可通過檢測nm23 、EGFR而輔助NSCLC的早期診斷，用于NSCLC患者療效評估、復發(fā)監(jiān)測及預后預測等。

【延伸閱讀】

nm23基因是美國國立癌癥研究所的Steeg等1988年從7個轉(zhuǎn)移潛力不同的K-1735鼠黑色素瘤細胞株中用消減雜交分離克隆成功的，其在低轉(zhuǎn)移細胞株中的表達強度是高轉(zhuǎn)移細胞株的10倍。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在人基因組中存在兩個nm23基因，即nm23-H1和nm23-H2。人的nm23-H1和nm23-H2基因均編碼由152個氨基酸所組成的17 kD蛋白，其中nm23-H1和nm23-H2的氨基酸序列同源性達88%，且其氨基酸序列在疏水性和電荷上是高度保守的，有94%的氨基酸組成是相同的。nm23蛋白與核苷二磷酸激酶(NDPK)的氨基酸序列高度同源，nm23-H1的同源性達89%，nm23-H2的同源性達97%。

作者貢獻：張艷紅進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；魏秀平進行實驗實施、評估、資料收集；王京曄進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：鹿飛飛)

Expressions and Clinical Significance of nm23 and EGFR in Patients with Non-small Cell Lung Cancer

ZHANGYan-hong，WEIXiu-ping，WANGJing-ye.DepartmentofInternalMedicine，WeifangMaternalandChildHealthHospital，Weifang261011，China

ZHANGYan-hong，DepartmentofInternalMedicine，WeifangMaternalandChildHealthHospital,Weifang261011，China；E-mail：zhangyanhong0209@126.com

Objective To analyze the expressions and clinical significance of nm23 and EGFR in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods From February 2010 to February 2014 in Weifang Maternal and Child Health Hospital and the People′s Hospital of Weifang，a total of 72 inpatients with NSCLC were selected as observation group，a total of 25 patients undergoing pulmonary bullae resection were selected as control group，carcinoma tissue of observation group and normal lung tissue of control group were collected，and immunohistochemical staining was used to detect the expressions of nm23 and EGFR.Results The positive expression rate of nm2 of carcinoma tissue was 66.7%，was statistically significantly lower than that of normal lung tissue of 84.0%(P<0.05)；the positive expression rate of EGFR of carcinoma tissue was 58.3%，was statistically significantly higher than that of normal lung tissue of 16.0%(P<0.01).No statistically significant differences of positive expression rate of nm2 or EGFR was found in NSCLC patients with different gender，different age，different pathological types，different differentiated degrees，different TNM stages，with smoking history or not(P>0.05)；there was statistically significant difference of positive expression rate of nm2 in NSCLC patients with lymphatic metastasis or not(P<0.01)，while there was no statistically significant differences of positive expression rate of EGFR in NSCLC patients with lymphatic metastasis or not(P>0.05).Spearman rank correlation analysis results showed that，the positive expression rate of nm2 of carcinoma tissue was negatively correlated with the positive expression rate of EGFR of carcinoma tissue in patients with NSCLC (rs=-0.175,P<0.05).Conclusion The expression of nm2 of carcinoma tissue is low in patients with NSCLC，while the expression of EGFR is high，nm23 and EGFR play important roles in the occurrence of NSCLC，and nm23 is correlated with the lymphatic metastasis.

Carcinoma，non-small-cell lung；NM23 nucleoside diphosphate kinases；Receptor，epidermal growth factor；Immunohistochemistry

261011山東省濰坊市婦幼保健院內(nèi)科(張艷紅)，病理科(魏秀平，王京曄)

張艷紅，261011山東省濰坊市婦幼保健院內(nèi)科；E-mail：zhangyanhong0209@126.com

R 730.26

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2016.10.015

2016-06-18；

2016-09-10)