魏 華 劉 萍 趙海燕 王 偉 黃海霞*

(1.首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學燕京醫(yī)學院，北京 100083)

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· 技術(shù)方法 ·

用高速壓力鉗技術(shù)觀察大鼠心室肌KATP通道的牽張敏感性

魏 華1劉 萍2趙海燕3王 偉2黃海霞2*

(1.首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學燕京醫(yī)學院，北京 100083)

傳統(tǒng)觀念認為，心臟的收縮活動是電活動控制的結(jié)果，但是心臟收縮時應力的變化對電活動也有反作用，這種反作用被稱作心臟機械-電反饋(cardiac mechano-electric feedback，MEF)[1]。臨床上有許多現(xiàn)象可歸結(jié)于MEF，如叩擊心前區(qū)可使心臟復蘇、心房壓增高常導致心房顫動(以下簡稱房顫)、心導管電極壓迫心內(nèi)膜會引起早搏等[2]。

在心臟MEF現(xiàn)象中，心臟電活動變化是在受到機械刺激時立即發(fā)生的，因此牽張激活離子通道(stretch-activated ion channels，SAC)就成為研究的重點。在心肌，已知的SAC有牽張激活陽離子非選擇性通道(stretch-activated cation non-selective channels，SACNS)和牽張激活鉀通道(stretch-activated K+-selective channels，SACK)[3]。

心肌ATP敏感鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)的基本作用是感受細胞內(nèi)ATP水平，并將細胞代謝與其電活動聯(lián)系在一起。有人[4]把KATP列為SACK的成員，但對其牽張敏感性的報道仍比較少。本實驗的目的在于聯(lián)合應用高速壓力鉗技術(shù)和單通道膜片鉗技術(shù)，在大鼠心室肌細胞上記錄KATP通道的活動，并確定其牽張敏感性。

1 材料和方法

1.1 取材、細胞制備

健康成年SD大鼠(雌性，250～300 g)，由首都醫(yī)科大學實驗科學動物部提供。經(jīng)腹腔注射肝素(25 00 U/kg)、戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，待其麻醉后，快速取出心臟，置于4 ℃臺式液(NaCl 133.5 mmol/L，KCl 4.0 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，Glucose 11.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，Taurine 30.0 mmol/L，用NaOH調(diào)pH至7.4)以沖洗和修剪多余組織。用Langendorff裝置依次灌流臺式液5 min、無鈣臺式液5 min、含膠原酶Ⅱ(1 g/L)和牛血清白蛋白(1 g/L)無鈣臺式液30～40 min。所有灌流液用混合氣[95%(體積分數(shù)) O2+5%(體積分數(shù)) CO2]平衡，并保持在37 ℃左右。將經(jīng)過酶解的心室組織剪碎、吹打，解離成單個細胞，置于4 ℃細胞保存液(KCl 40.0 mmol/L，KOH 80.0 mmol/L，KH2PO425.0 mmol/L，MgSO43.0 mmol/L，Glucose 10.0 mmol/L，Taurine 20.0 mmol/L，Glutamic Acid 50.0 mmol/L，EGTA 1.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，用KOH調(diào)至pH7.4)中保存。

1.2 單通道電流記錄

選擇柱狀無收縮、紋理清晰、折光性強、附壁良好的單個心室肌細胞用于實驗。用電極拉制儀(PB-10，日本NARISHIGE公司)將毛細玻璃管(BF150-110-10，美國Sutter Instrument公司)經(jīng)兩步法拉制出電極阻抗為4～6 MΩ的玻璃微電極。浴液和電極內(nèi)液為對稱鉀條件(L-門冬氨酸鉀 140.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，EGTA 5.0 mmol/L，用KOH調(diào)pH至7.2)。記錄KATP單通道電流在室溫下進行，采用內(nèi)面向外(inside-out)模式。電流信號經(jīng)膜片鉗放大器(Axopatch 200B，美國Molecular Devices公司)濾波、放大，經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器(Digidata 1322A，美國Molecular Devices公司)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，再由數(shù)據(jù)采集軟件(pClamp 9.2，美國Molecular Devices公司)記錄。通過壓力鉗放大器(HSPC-1，美國ALA Scientific Instruments公司)向細胞膜片施加牽張刺激(-10～-40 mmHg， 1 mmHg=0.133 kPa)，同時觀察通道電流的變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計學處理

采用pClamp 9.2軟件進行單通道數(shù)據(jù)分析，NPO按照公式∑nPn來計算(NPO：膜片上KATP通道的開放概率；N：膜片上KATP通道的個數(shù)；PO：膜片上單個KATP通道的開放概率；n：通道開放的級數(shù)，1≤n≤N；Pn：n個通道同時開放的概率)。

2 結(jié)果

2.1 心室肌KATP電流的鑒定

在細胞貼附(cell-attached)模式下，由于細胞完整，細胞內(nèi)ATP濃度較高，通道幾乎不開放；形成內(nèi)面向外(inside-out)模式后(膜電位為-60 mV)，通道活動明顯增加；在膜片內(nèi)側(cè)面(即浴液側(cè))加入MgATP(0.2 mmol/L)后，通道活動逐漸減少；對膜片施以-30 mmHg(持續(xù)時間為10 s)的負壓刺激時，通道活動明顯增加(圖1)。分別用K+濃度為140、70或35 mmol/L的電極內(nèi)液(浴液K+濃度均為140 mmol/L)，得到單通道電流的反轉(zhuǎn)電位分別為0、-16、-30 mV，與用Nernst公式估算出的K+平衡電位數(shù)值接近。在對稱鉀溶液條件下，該通道的電導值為(41±0.9) pS(+60 mV)、(54±1.8) pS(-60 mV)，n=7，呈弱內(nèi)向整流特性。

2.2 心室肌KATP的牽張敏感性

形成內(nèi)面向外(inside-out)模式后(膜電位為-60 mV)，在膜片內(nèi)側(cè)面(即浴液側(cè))持續(xù)加入MgATP(0.2 mmol/L)。對膜片施加階躍負壓刺激，KATP的活動呈現(xiàn)壓力強度依賴性增加，超過-30 mmHg的牽張可使多個通道同時開放(圖2)。0、-10、-20、-30和-40 mmHg牽張時的KATP開放概率(NPO)分別為0.101±0.040、0.162±0.045、0.211±0.067、0.350±0.063、0.510±0.092，n=7，其中-30、-40 mmHg與0 mmHg相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。單通道電流幅度分別為2.65±0.24、2.71±0.30、2.68±0.29、2.70±0.24、(2.68±0.40) pA(P>0.05，n=7)，表明負壓刺激改變的是KATP的開放概率而不是單通道電流幅度。

圖1 大鼠心室肌細胞膜內(nèi)向外膜片上的KATP電流

Fig.1 KATPcurrents in an inside-out patch from a rat ventricular myocyte

Cell-attached patches had little channel activity because of the inhibition by cytoplasmic ATP. Channel openings appeared upon inside-out patches, decreased with MgATP (0.2 mmol/L) and increased significantly with 30 mmHg suction.△1 mmHg=0.133 kPa；KATP:ATP-sensitive potassium channel..

圖2 大鼠心室肌KATP的牽張敏感性

Fig.2 The mechanosensitivity of KATPin rat ventricular myocytes

Channel openings increased with four 10-second suction pulses from-10 to-40 mmHg separated by 10-second relaxation periods. The right current traces (a, b, c, d, e) show the channel activities at a higher time resolution picked from the left trace marked with the corresponding letters.△1 mmHg=0.133 kPa；KATP:ATP-sensitive potassium channel.

3 討論

在機械信號轉(zhuǎn)導過程中，SAC具有非常重要的作用[5]。它通過感受機械刺激，從而觸發(fā)細胞的一系列生理生物化學反應，參與調(diào)控多種功能。在對SAC的研究中，給予機械刺激的方法很重要，要求做到快速、準確、穩(wěn)定。本課題組曾采用低滲液引起細胞腫脹、通過手動裝置向細胞膜片施以負壓刺激等來研究SAC的牽張敏感性，但是存在實驗條件不易控制、施加壓力的速度慢、輸出過程中壓力的損失、壓力不穩(wěn)定等問題。

壓力鉗技術(shù)(pressure clamp technique)是一種給細胞膜表面施加壓力的技術(shù)。“壓力鉗”的意思不僅是能快速、準確地控制施加在細胞膜表面的壓力，更能使輸出的壓力保持在人為指定的水平。壓力鉗放大器的基本原理是：通過輸出電壓指令控制壓電閥，使壓力室的正負壓力達到平衡，從而輸出所需要的壓力、通過膜片鉗電極夾持器作用在細胞膜上，同時還利用反饋電路隨時調(diào)節(jié)輸出壓力的大小，使其固定在指令水平。2002年Besch[6]實驗室又對其進行了改進，使壓力的鉗制速度更快，施加100 mmHg壓力的反應上升時間(0%～90%)僅為1.5 ms左右。目前該技術(shù)已廣泛應用于SAC的動力學研究。

心肌KATP受腺苷及胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控，生理條件下，KATP處于關(guān)閉狀態(tài)，心肌缺血缺氧時，KATP通道開放，促使細胞復極，減輕鈣超載，減少能量消耗，是重要的內(nèi)源性保護機制[7]。同時，作為SACK的成員，KATP對牽張刺激也具有敏感性。本文聯(lián)合應用高速壓力鉗技術(shù)和膜片鉗技術(shù)，在內(nèi)面向外(inside-out)模式下觀察了大鼠心室肌KATP的牽張敏感性。結(jié)果表明，心室肌KATP的開放呈牽張刺激強度依賴性，但其單通道電流不受牽張強度變化的影響。

目前，大量臨床現(xiàn)象和研究證實心臟MEF的存在，并且與SAC密切相關(guān)[8-10]。高速壓力鉗技術(shù)能夠快速、準確、穩(wěn)定地向細胞膜表面施加指令壓力，利用該技術(shù)可以對SAC的動力學特征(如通道對壓力變化的反應潛伏期、通道的開關(guān)、適應性、失活等)進行詳細的研究，為研究SAC及闡明心臟MEF機制提供了壓力控制方法上的保證。

[1] Quinn T A, Kohl P, Ravens U. Cardiac mechano-electric coupling research: fifty years of progress and scientific innovation[J]. Prog Biophys Mol Biol, 2014, 115(2-3): 71-75.

[2] Taggart P, Sutton P M. Cardiac mechano-electric feedback in man: clinical relevance[J]. Prog Biophys Mol Biol, 1999, 71(1): 139-154.

[3] Reed A, Kohl P, Peyronnet R. Molecular candidates for cardiac stretch-activated ion channels[J]. Glob Cardiol Sci Pract, 2014, 2014(2): 9-25.

[4] Van Wagoner D R. Mechanosensitive gating of atrial ATP-sensitive potassium channels[J]. Circ Res, 1993, 72(5): 973-983.

[5] Lyon R C, Zanella F, Omens J H, et al. Mechanotransduction in cardiac hypertrophy and failure[J]. Circ Res, 2015, 116(8): 1462-1476.

[6] Besch S R, Suchyna T, Sachs F. High-speed pressure clamp[J]. Pflugers Arch, 2002, 445(1): 161-166.

[7] Seino S, Miki T. Physiological and pathophysiological roles of ATP-sensitive K+ channels[J]. Prog Biophys Mol Biol, 2003, 81(2):133-176.

[8] Hu Y, Gurev V, Constantino J, et al. Effects of mechano-electric feedback on scroll wave stability in human ventricular fibrillation[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e60287.

[9] Kamkin A, Kiseleva I, Wagner K D, et al. Mechano-electric feedback in right atrium after left ventricular infarction in rats[J]. J Mol Cell Cardiol, 2000, 32(3): 465-477.

[10]Hamill O P. Twenty odd years of stretch-sensitive channels[J]. Pflugers Arch, 2006, 453(3):333-351.

編輯 孫超淵

北京市屬高校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃項目(CIT&TCD201404178)。This study was supported by the Importation and Development of High-caliber Talents Project of Beijing Municipal Institutions(CIT&TCD201404178)

時間：2016-12-14 20∶22

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2022.044.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.024]

2016-08-19)

*Corresponding author， E-mail：haixiah@aliyun.com