周德平 褚長(zhǎng)彬 趙 崢 姜震方 吳淑杭*(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所 0403；上海東保農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海市閔行區(qū) 006)

基于高通量測(cè)序的肉牛墊料養(yǎng)殖床中細(xì)菌群落分析

周德平1,2褚長(zhǎng)彬1趙 崢1姜震方1吳淑杭1*(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所 201403；2上海東保農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海市閔行區(qū) 201106)

利用Roche 454GSFLX+高通量測(cè)序平臺(tái)分析了肉牛墊料養(yǎng)殖床中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，從發(fā)酵床樣品中共獲得17 772條有效序列，其中優(yōu)質(zhì)序列有13 301條，在97%相似水平上聚為1 603個(gè)OTU分類(lèi)單元；目水平上，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群集中在芽孢桿菌目（21.70%）、紅螺菌目（18.20%）、乳桿菌目（14.90%）、梭菌目（14.10%）、黃桿菌目（10.50%）、伯克氏菌目（5.50%）、黃單胞菌目（3.00%）、放線(xiàn)菌目（2.10%）和根瘤菌目（1.80%）；屬水平上，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群主要集中于醋酸桿菌屬（15.17%）、金黃桿菌屬（9.50%）、乳桿菌屬（6.90%）、芽孢桿菌屬（6.30%）、乳球菌屬（6.0%）、高溫放線(xiàn)菌屬（3.50%）、類(lèi)芽孢桿菌屬（2.40%）、梭菌目（2.10%）、伯克氏菌屬（2.10%）和葡萄糖醋桿菌屬（1.80%）。

墊料養(yǎng)殖；肉牛；細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)；高通量測(cè)序

有關(guān)研究表明，一頭泌乳牛日平均排泄糞便32.1 kg、尿20.2 kg，按此計(jì)算，一家千頭奶牛場(chǎng)的年均糞便產(chǎn)生量為11 717 t、尿7 373 t左右，由此對(duì)周邊環(huán)境造成了巨大壓力。目前，上海地區(qū)奶牛場(chǎng)配套的糞尿處理設(shè)施主要為沼氣發(fā)酵，但其本身作為一種能源工程，產(chǎn)生的沼渣、沼液也需進(jìn)行合理的處置，而目前所面臨的現(xiàn)狀是海量的沼液無(wú)處可排，對(duì)周邊農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)和水環(huán)境產(chǎn)生了較大威脅。墊料養(yǎng)牛技術(shù)是利用牛棚中鋪設(shè)的墊料基質(zhì)中功能微生物群落對(duì)糞尿進(jìn)行降解和消納，并利用翻耙設(shè)備定時(shí)將表面的糞尿與墊料混合，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了糞尿的自然降解，還可改善養(yǎng)殖環(huán)境。

為明確肉牛墊料養(yǎng)殖中的細(xì)菌群落組成，以生產(chǎn)中穩(wěn)定運(yùn)行2年的肉牛發(fā)酵床的墊料基質(zhì)為研究對(duì)象，利用Roche 454 GS FLX+高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)發(fā)酵床基質(zhì)中細(xì)菌16s V1-V3 區(qū)全長(zhǎng)進(jìn)行了測(cè)序、分析，以探尋其中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，從而尋找出發(fā)揮功效的主要微生物種群。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

試驗(yàn)用的肉牛發(fā)酵床基質(zhì)來(lái)源于上海牛奶集團(tuán)的躍一奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中已穩(wěn)定運(yùn)行2年，基本實(shí)現(xiàn)糞尿不外排。

1.2 目標(biāo)序列、所用引物及分析用數(shù)據(jù)庫(kù)

細(xì)菌分析16s V1～V3 區(qū)全長(zhǎng)，rDNA 通用引物序列為：

融合引物為：

細(xì)菌OUT聚類(lèi)分析用Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)信息。

2 結(jié)果與分析

圖1 細(xì)菌優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度分布

圖2 肉牛發(fā)酵床中主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群分布（目水平）

2.1 序列數(shù)分析

經(jīng)454焦磷酸測(cè)序后，從樣品中共獲得細(xì)菌群落17 772條有效序列，其中優(yōu)質(zhì)序列有13 301條，優(yōu)質(zhì)序列的長(zhǎng)度主要分布在440～540 bp的范圍間（見(jiàn)圖1），可滿(mǎn)足對(duì)細(xì)菌屬種水平分類(lèi)信息的需求。

表1 肉牛發(fā)酵床中主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群比例分析（屬水平）

2.2 目水平上，肉牛發(fā)酵床中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群分析

OTU（Operational Taxonomic Units 操作分類(lèi)單元）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。將序列按照一定的相似性歸為許多分類(lèi)單元，1個(gè)單元就是1個(gè)OTU。本研究對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度0.97進(jìn)行聚類(lèi)，以每個(gè)類(lèi)最長(zhǎng)的序列為代表序列，在Greengene(Release 13.8 http://greengenes.secondgenome.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，采用blast方法對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得每個(gè)OTU的分類(lèi)信息。

對(duì)目標(biāo)樣品中獲得的13 301條優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行聚類(lèi)，共獲得1 603個(gè)細(xì)菌OTU分類(lèi)單元。在目水平上，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群的分布（見(jiàn)圖2）。其中芽孢桿菌目（Bacillales）的比例最大，占細(xì)菌群落的21.70%，其次為紅螺菌目（Rhodospirillales），為18.20%，接下來(lái)依次為乳桿菌目（Lactobacillales）14.90%、梭菌目（Clostridiales）14.10%、黃桿菌目（Flavobacteriales）10.50%、伯克氏菌目（Burkholderiales）5.50%、黃單胞菌目（Xanthomonadales）3.00%、放線(xiàn)菌目（Actinomycetales）2.10%、根瘤菌目（Rhizobiales）1.80%等。

2.3 屬水平上，肉牛發(fā)酵床中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群分析

在屬水平上，肉牛發(fā)酵床中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群的分布（見(jiàn)表1）。其中種群比例最大的為醋酸桿菌屬（Acetobacter），占整個(gè)群落中的15.17%；其次為金黃桿菌屬，為9.50%；然后依次為乳桿菌屬6.90%、芽孢桿菌屬6.30%、乳球菌屬6.0%、高溫放線(xiàn)菌屬3.50%、類(lèi)芽孢桿菌屬2.40%、梭菌目2.10%、伯克氏菌屬2.10%、葡萄糖醋桿菌屬1.80%等。

3 小 結(jié)

分析結(jié)果表明，對(duì)肉牛發(fā)酵床墊料基質(zhì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序后共獲得13 301條優(yōu)質(zhì)序列，在97%相似水平上，所獲全部?jī)?yōu)質(zhì)序列共聚為1 603個(gè)OTU分類(lèi)單元。在細(xì)菌分類(lèi)中，目水平上，肉牛發(fā)酵床墊料基質(zhì)中主要的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群集中在芽孢桿菌目（21.70%）、紅螺菌目（18.20%）、乳桿菌目（14.90%）、梭菌目（14.10%）、黃桿菌目（10.50%）、伯克氏菌目（5.50%）、黃單胞菌目（3.00%）、放線(xiàn)菌目（2.10%）和根瘤菌目（1.80%）；屬水平上，肉牛發(fā)酵床墊料基質(zhì)中主要的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群集中于醋酸桿菌屬（15.17%）、金黃桿菌屬（9.50%）、乳桿菌屬（6.90%）、芽孢桿菌屬（6.30%）、乳球菌屬（6.0%）、高溫放線(xiàn)菌屬（3.50%）、類(lèi)芽孢桿菌屬（2.40%）、梭菌目（2.10%）、伯克氏菌屬（2.10%）和葡萄糖醋桿菌屬（1.80%）。

2016-05-27

崇明區(qū)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：CK2014-11）。

*為通訊作者。