彭治桃,蔣國民,鄒 利,李金龍,程小飛,房麗娟,王曉清,劉 麗1,

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國 長沙 410128；2.湖南省水產(chǎn)原種場，中國 長沙 410153;3.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，中國 長沙 410153; 4.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中國 長沙 410012)

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錦鯽Clock基因表達量分析中的內(nèi)參基因穩(wěn)定性比較

彭治桃1,2,蔣國民3,鄒 利3,李金龍3,程小飛3,房麗娟4,王曉清1*,劉 麗1,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國 長沙 410128；2.湖南省水產(chǎn)原種場，中國 長沙 410153;3.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，中國 長沙 410153; 4.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中國 長沙 410012)

為研究錦鯽Clock基因表達量分析中的內(nèi)參基因穩(wěn)定性，采用qRT-PCR技術(shù)進行實時熒光定量分析，并用Ge Norm 和 Norm Finder軟件對5個內(nèi)參基因(RPL13，GAPDH，18SrRNA，β-actin和RPS29)進行穩(wěn)定性評估，篩選出不同組織中最適合的內(nèi)參基因，以準確定量Clock基因的相對表達水平.實驗結(jié)果表明，5個內(nèi)參基因中，18SrRNA在錦鯽的肌肉、心臟、肝臟中表達最穩(wěn)定，β-actin在腸中表達最穩(wěn)定，RPL13在腎中表達最穩(wěn)定；根據(jù)篩選的內(nèi)參基因定量Clock基因的相對表達水平發(fā)現(xiàn)，Clock基因在錦鯽肌肉中相對表達量最高，其次依次是肝臟、腎、腸，心臟中最低.本研究準確定量Clock基因, 為錦鯽生物鐘節(jié)律機制的下一步研究奠定了理論基礎(chǔ).

內(nèi)參基因；qRT-PCR；錦鯽；Ge Norm程序；Norm Finder程序

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)因具有靈敏度高、重復(fù)性好以及定量準確等優(yōu)點，被廣泛用于生物科學(xué)的各個研究領(lǐng)域.但這一技術(shù)能否準確定量取決于很多因素，如實驗材料質(zhì)量、RNA質(zhì)量、cDNA第一鏈合成效率及內(nèi)參基因的選擇[1].其中，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進行校正和標準化，獲得更接近于目的基因特異性表達的真實值是基因表達定量實驗中的關(guān)鍵[2].內(nèi)參基因，也叫看家(持家)基因，是用來做內(nèi)部參照的基因, 因具有在各個組織和細胞中表達相對恒定的特點而作為目的基因的相對表達水平時的參照基因.一個理想的內(nèi)參基因要在不同組織、不同發(fā)育階段以及不同處理因素下都能體現(xiàn)恒定的表達水平.然而，現(xiàn)實中穩(wěn)定表達的基因幾乎不存在，因此選擇合適的內(nèi)參基因用于基因表達差異分析非常關(guān)鍵.Clock基因是一種生物鐘基因，在動物的各個組織中廣泛表達[3]，在維持正常的近日節(jié)律中起著至關(guān)重要的作用.本研究選擇RPL13，GAPDH，18SrRNA，β-actin和RPS29共 5個候選內(nèi)參基因，采用 SYBR greenⅠqRT-PCR方法，利用Ge Norm程序和Norm Finder程序研究錦鯽Clock基因表達量分析中這5個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性.

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

樣品采集于湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所原種中心，取平均體重為(50±5) g的健康錦鯽中不同組織，包括肌肉、肝臟、心臟、腸、腎共5個.采樣前將錦鯽用 MS-222(80 mg/L)麻醉[4]，取樣時在放置有冰袋的解剖盤上進行， 樣品采集后迅速置于液氮中保存，再轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱儲藏備用.

1.2 總 RNA提取和 c DNA合成

分別取100 mg 凍存組織樣品，按照 Trizol試劑法(Invitrogen公司, 美國)提取總 RNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對28 S 和18 S rRNA的完整性進行鑒定，并用紫外分光光度計測定OD260/OD280的值，以檢測總RNA的純度和濃度.按照Prime Script TM reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程(TaKaRa公司,日本)，取2 μg總RNA合成cDNA第一鏈.置于-20 ℃ 備用.

1.3 Clock基因及內(nèi)參基因的引物設(shè)計

選擇不同功能的5個常用內(nèi)參基因，即RPL13(核糖體蛋白基因L13)，GAPDH(3′-磷酸甘油醛脫氫酶)，18SrRNA(18 S核糖體RNA)，β-actin(β-肌動蛋白基因)和RPS29(核糖體蛋白S29基因)進行研究.根據(jù) NCBI 中已公布的錦鯽及與其同源性較高的序列，用 Primer premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)，并驗證引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，引物合成和擴增產(chǎn)物的基因序列測定由上海生工公司完成.

表1 Clock基因及內(nèi)參基因的引物序列

1.4 Clock基因及內(nèi)參基因qRT-PCR分析

qRT-PCR反應(yīng)在CFX96TMReal-Time System(BIO-RAD公司,美國)中進行.參照SYBR? Premix Ex Taq II( Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書，準備反應(yīng)體系為熒光染料SYBR Premix 12.5 μL，cDNA 模板2.0 μL， Forward primer 1.0 μL，Reverse primer 1.0 μL，加無菌水補至總體積25 μL.反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性5 s, 65 ℃退火、延伸30 s, 40個循環(huán)繪制溶解曲線：65～95 ℃，每0.1 s讀板一次.

1.5 數(shù)據(jù)分析

實時熒光定量PCR結(jié)束后，實驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進行初步處理，采用2ΔCT法進行計算[5],即在Excel 中設(shè)定不同樣本中某一看家基因CT值最小者的表達量為1，其他樣本與此看家基因的相對表達量則為 2-ΔCT，將這些數(shù)據(jù)導(dǎo)入Ge Norm程序(http:∥medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/)計算內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度的平均值M(M值越小，表達越穩(wěn)定)，并通過看家基因標準化因子的配對差異分析(Vn/(n+1))來判定內(nèi)參基因的最適數(shù)目[6].另外，應(yīng)用 Andersen 編寫的程序 Norm Finder算出表明穩(wěn)定程度的S值(S值越小，表達越穩(wěn)定)，選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因與Ge Norm程序分析結(jié)果進行綜合比較，從而優(yōu)選出最佳內(nèi)參基因[6].公式為目的基因的表達量=2-ΔΔCT[7]，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)實驗組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組.采用SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One Way ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較，P<0.05具有顯著性差異，所有結(jié)果以平均值±標準差(±SE)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性分析

圖1 組織總RNA電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis of total RNA in different tissues

提取5個組織的總RNA用1.2%的瓊脂凝膠電泳進行檢測，發(fā)現(xiàn)28 S rRNA和18 S rRNA條帶清晰，沒有彌散現(xiàn)象，說明RNA的完整性良好,沒有降解(圖1).紫外分光光度計檢測OD260/OD280比值為1.9～2.1，說明所提取的組織總RNA符合下一步實驗質(zhì)量要求.對所設(shè)計的引物進行普通PCR驗證，其擴增片段的特異性和準確性均很好.熒光定量PCR的擴增曲線指數(shù)期較明顯，擴增曲線整體平行性較好，熔解曲線的熔點峰較窄而尖，無雙峰現(xiàn)象，說明產(chǎn)物特異性較好(圖2).

2.2 內(nèi)參基因的表達譜分析

CT值與基因的表達量成反比，即CT值越大,表達量越小,反之亦然.用Sigma Plot 10.0軟件對 20個樣品 5 種內(nèi)參基因的表達水平(CT)進行分析(圖3)，圖中箱代表四分位數(shù)，即分別代表第25 百分位數(shù)和第75百分位數(shù)，箱中間的線代表中位數(shù)，上下線分別代表最大值和最小值.結(jié)果顯示7個看家基因的CT值在17～33之間,其中18SrRNA，RPL13和β-actin的CT值較低，RPS29和GAPDH的CT值較高,說明各內(nèi)參基因在錦鯽中的表達量不同，而且差別比較大.

圖2 熒光定量PCR圖(A:擴增曲線;B:溶解曲線)Fig.2 Amplification curve (A) and Melting curve (B) of qRT-PCR

圖3 qRT-PCR中內(nèi)參基因的CT值分布Fig.3 The CT value distribution of five reference genes in qRT-PCR

2.3 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性比較

圖4顯示，通過Ge Norm 軟件分析得出M值來評價內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性不同.M值從大到小(基因穩(wěn)定性從最不穩(wěn)定到最穩(wěn)定)依次為：肌肉中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13和18SrRNA；心臟中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13和18SrRNA；肝臟中，RPS29，GAPDH，β-actin，18SrRNA和RPL13；腸中，18SrRNA，RPS29，GAPDH，β-actin和RPL13；腎中，RPS29，18SrRNA，β-actin，RPL13和GAPDH，說明肌肉、心臟和肝臟的2個最適合內(nèi)參基因均為RPL13和18SrRNA，而腸為β-actin和RPL13，腎為RPL13和GAPDH.通過Ge Norm標準化因子配對分析，發(fā)現(xiàn)本實驗5個內(nèi)參基因在5個組織中，Vn/(n+1)均小于1.5，說明有n個基因可以作為qRT-PCR 定量分析的內(nèi)參基因，無需再選擇使用≥n+1個基因作為內(nèi)參.

圖4 肌肉(A)，心臟(B)，肝臟(C)，腸(D)，腎(E)中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性比較(Ge Norm 分析和 Norm Finder分析)Fig.4 Expression stability of reference genes in different tissues by Ge Norm and Norm Finder(A, Muscle; B, Heart; C, Liver; D,Intestine; E,Kidney)

通過Norm Finder 軟件分析得出，S值從大到小(基因穩(wěn)定性從最不穩(wěn)定到最穩(wěn)定)依次為：肌肉中，β-actin，GAPDH，RPS29，RPL13，18SrRNA；心臟中，β-actin，RPS29，GAPDH，RPL13，18SrRNA；肝臟中，GAPDH，β-actin，RPS29，RPL13，18SrRNA；腸中，RPS29，18SrRNA，GAPDH，RPL13，β-actin；腎中，RPS29，18SrRNA，β-actin，GAPDH，RPL13. Ge Norm軟件分析的結(jié)果得出最適合的內(nèi)參基因數(shù)，而Norm Finder 軟件分析能選出穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因.因此，綜合比較 2 種軟件的評價結(jié)果，篩選出肌肉、心臟、肝臟中最佳內(nèi)參基因均為18SrRNA，而腸中最佳內(nèi)參基因為β-actin，腎中的為RPL13.

2.4 Clock基因的表達水平

圖5 錦鯽Clock基因相對表達水平 Fig.5 Relative expression levels of Clock genes in Carassius auratus

根據(jù)錦鯽內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價結(jié)果，肌肉、心臟、肝臟以18SrRNA作為內(nèi)參基因，腸以β-actin和腎以RPL13作為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR方法進行定量，檢測錦鯽不同組織中Clock基因表達量.圖5結(jié)果表明，Clock基因在肌肉中相對表達量最高，其次依次是肝臟、腎、腸，心臟中最低(P<0.05).

3 討論

到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)一種不受外界因素影響、能夠在所有組織細胞中都能穩(wěn)定表達的理想內(nèi)參基因[8].實驗時如果盲目選擇某單一內(nèi)參基因，勢必會影響到定量目的基因表達水平的檢測精度.目前國外文獻中都要求用qRT-PCR技術(shù)首先對內(nèi)參基因進行篩選和優(yōu)化，選擇最合適的看家基因作為內(nèi)參.我國也有關(guān)于內(nèi)參基因的篩選和優(yōu)化的相關(guān)文獻[9]，但90%以上的文獻還是以單個內(nèi)參基因進行定量，并未對所選內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性分析.

本研究采用Norm Finder和Ge Norm兩個軟件，對5個候選內(nèi)參基因β-actin，GAPDH，RPS29，RPL13和18SrRNA在錦鯽的5個組織中的表達穩(wěn)定性進行了分析.結(jié)果表明，5個內(nèi)參基因在錦鯽的肌肉、心臟、肝臟、腸和腎中表達穩(wěn)定性不同，18SrRNA在肌肉、心臟、肝臟中的表達最穩(wěn)定，β-actin在腸中的表達最穩(wěn)定，RPL13在腎中的表達最穩(wěn)定.有文獻報道，18SrRNA在絲光綠蠅的不同發(fā)育時期和長虹獵蝽的不同組織中的表達均較為穩(wěn)定，而在褐飛風(fēng)和桔小實蝶的不同組織中表達極不穩(wěn)定[10].蔣曉梅等[11]研究表明，在鹽脅迫和熱脅迫條件下，18SrRNA基因表達穩(wěn)定性最高.鮑相渤等[12]對饑餓脅迫下6個候選內(nèi)參基因在蝦夷扇貝的各個組織中的穩(wěn)定性表達進行研究，發(fā)現(xiàn)β-actin在鰓、腎、血淋巴中穩(wěn)定性最好，GAPDH受饑餓脅迫后各組織中的表達穩(wěn)定性較差，但受急性感染和升溫試驗時表現(xiàn)出較好的表達穩(wěn)定性.而周瑞雪等[13]以β-actin、18SrRNA和GAPDH3種內(nèi)參基因定量草魚早期發(fā)育時期肌球蛋白重鏈基因的mRNA表達量時優(yōu)選出β-actin和GAPDH作為看家基因.Nishimura等[14]通過Ge Norm 分析篩選出老鼠肝臟老化研究中合適的內(nèi)參基因為HPRT1和GAPDH. Schmidt 等[15]研究證明，GAPDH在煙草中表達不穩(wěn)定.劉金泊等[16]優(yōu)選出RPS18和RPL13作為內(nèi)參基因，分析赤擬谷盜受磷化氫誘導(dǎo)后的表達.李迪等[17]通過Ge Norm軟件分析發(fā)現(xiàn)，在鱖魚不同組織中B2M和RPL13為最佳內(nèi)參基因.綜上所述，必須根據(jù)不同的試驗對象和試驗?zāi)康倪x用多種內(nèi)參基因比較qRT-PCR 數(shù)據(jù)，以獲得相關(guān)目的基因的準確定量，特別是那些僅有細微表達差異的研究.

Clock基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的脊椎動物生物鐘基因[18]，具有高度保守性，在動物組織中廣泛表達，如Clock基因的 mRNA在小鼠視交叉上核、腦、心、肝、肺、腎、睪丸和卵巢均有表達[19].山羊中Clock基因的mRNA發(fā)育性表達模式具有組織特異性[20].塞內(nèi)加爾鰨中Clock基因廣泛表達于視網(wǎng)膜、視頂蓋、間腦、小腦和肝臟[22]，虹鱒中Clock1a在視網(wǎng)膜和下丘腦中表達較高[22]，瓦氏黃顙魚中Clock基因在大腦，肝臟和小腸有表達[23].可見，Clock基因在不同物種和不同組織中表達有差異，本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，Clock基因在錦鯽5個組織中相對表達量有差異，且在肌肉和肝臟中表達較高.

綜上所述，本研究運用Norm Finder和Ge Norm兩個軟件，成功篩選出了錦鯽5個不同組織中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，提高了錦鯽Clock基因表達量分析的準確性.Clock基因表達差異性表明，其在不同組織中的生物節(jié)律調(diào)控功能不同，這為進一步探明錦鯽生物鐘的調(diào)控機制奠定了一定的理論基礎(chǔ).

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(編輯 WJ)

Stability Comparison of Reference Genes on Expression Analysis ofClockGene inCarassiusAuratus

PENGZhi-tao1,2,JIANGGuo-min3,ZOULi3,LIJin-long3,CHENGXiao-fei3,FANGLi-juan4,WANGXiao-qing1*,LIULi1,3*

(1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China;2. Aquatic Products Seed Stock Station in Hunan Province, Changsha 410153, China;3. Fisheries Research Institute of Hunan Province, Changsha 410153, China;4. College of Basic Medicine, Central South University, Changsha 410012, China)

The aim of this study is to compare the stability difference of reference genes from the expression analysis ofClockgene inCarassiusauratus. The mRNA expression of five candidate reference genes such asRPL13,GAPDH18SrRNA,β-actin, andRPS29 were detected by using the qRT-PCR method, and Ge Norm and Norm Finder software packages. The optimal reference genes selected by analyzing and evaluating their mRNA expression stability were applied to accurately quantify the relative expression level of theClockgene in different tissues ofCarassiusauratus. Our results show that one of the most stable reference genes was 18SrRNAfrom three tissues, including muscle, heart, and liver, among the five reference genes, whereas that found in intestines wasβ-actinand in kidney wasRPL13. When these optimal reference genes were selected in five tissues, we found that the relative expression level of theClockgene was the highest in the muscle tissue, followed by liver, kidney, and intestines, and the lowest was in heart. In summary, this study has accurately quantified the relative expression levels of theClockgene in tissues, which should serve as the theoretical basis for the future investigation of theClockgene rhythm system.

reference gene; qRT-PCR;Carassiusauratus; Ge Norm software; Norm Finder software

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.06.007

2016-06-21

國家自然科學(xué)基金資助項目(31372530)

S917.4

A

1000-2537(2016)06-0037-06

*通訊作者,E-mail：wangxiao8258@163.com；hnhhliliu@163.com