劉萬忠 張超 張杰

（湖北荷普藥業(yè)股份有限公司，武漢 430048）

過氧化氫納米霧滅菌技術用于GMP車間滅菌效果研究

劉萬忠 張超 張杰

（湖北荷普藥業(yè)股份有限公司，武漢 430048）

為了考察過氧化氫納米霧滅菌技術對GMP車間潔凈區(qū)的滅菌效果，采用兩種不同的過氧化氫消毒液及不同的滅菌參數(shù)(不同的噴霧體積、不同的密閉時間）對滅菌效果進行驗證。當所用消毒液的噴霧體積大于5 mL/m3時，過氧化氫納米霧可以用于GMP車間潔凈區(qū)滅菌，密閉90 min以上，即可達到對空間和表面的滅菌要求（即可殺死1×106的孢子）。

納米霧；超干霧；GMP車間；滅菌

對GMP車間潔凈區(qū)定期進行滅菌是保證生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要環(huán)節(jié)。目前在我國對空間進行滅菌的常用方法是比較傳統(tǒng)的甲醛熏蒸法，甲醛的殺菌能力不容置疑，但是隨著科學技術的發(fā)展，越來越受到專家質(zhì)疑，因為甲醛是一級致癌物質(zhì)。為了解決甲醛滅菌時間過長以及毒性和殘留問題（會產(chǎn)生結晶狀殘留物），國內(nèi)也有少數(shù)企業(yè)采用了汽化過氧化氫滅菌技術[1-5]，即VHP滅菌技術。汽化過氧化氫滅菌技術由于滅菌時間較短、無毒、無殘留，且滅菌效果容易驗證，廣泛被歐盟國家認可。我國的GMP認證要與歐盟接軌，潔凈區(qū)采用過氧化氫滅菌技術必然為大勢所趨。但目前的 VHP滅菌技術成本較高，而且要采用高濃度的過氧化氫溶液（一般大于30 %），腐蝕性較強，特別是容易對彩鋼板和環(huán)氧地面造成腐蝕。這就限制了這種滅菌技術在GMP車間大規(guī)模使用。

為了克服上述缺點，我們采用納米霧滅菌技術對GMP 車間的滅菌效果進行了研究，結果如下。

1 試劑與儀器

（1）生物指示劑（嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子，孢子量106CFU/片，含同一批號生物指示劑專用培養(yǎng)液）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）。

（2）活性過氧化氫消毒劑（過氧化氫濃度6 %）。

（3）活性氧免洗消毒液（過氧化氫濃度1.5 %）。

（4）GY-02型過氧化氫氣體濃度探測器。

（5）NMW-1型納米霧TM消毒滅菌儀。

（6）試驗場地：某GMP車間，潔凈區(qū)高 2.8 m、寬 4.4 m、長 6.5 m，空間總體積約 80 m3。

2 使用流程

整個過氧化氫納米霧滅菌過程分為8個階段，流程如下。

（1）將設備帶入潔凈區(qū)前 ，先將設備表面灰塵用75 %酒精或者0.5 %活性過氧化氫消毒液擦拭清除干凈；

（2）設置電子時控智能開關的自動開機時間和關機時間；

（3）根據(jù)潔凈區(qū)域空間的大小，計算消毒液的霧化體積，或者根據(jù)霧化速度計算霧化開始和結束時間；

（4）通過漏斗向霧化微粒出口（消毒液注入口）將消毒液加入至設備的儲液器中；

（5）將配備的萬向噴霧頭插入設備的霧化出口內(nèi)；

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（6）關閉房間內(nèi)所有循環(huán)風機，接通電子時控智能開關電源，當?shù)竭_設定的啟動時間后設備即開始自動霧化消毒；

（7）當?shù)竭_設定的關機時間后設備即停止霧化消毒，自動關閉電源后，密閉60～180 min；

（8）當達到規(guī)定的密閉時間后，開啟空調(diào)系統(tǒng)通風通過潔凈空氣置換以排除房間內(nèi)部殘留的過氧化氫，從而使房間內(nèi)空氣中過氧化氫氣體濃度低于職業(yè)允許暴露水平，0.001 ‰（1 ppm）。

3 實驗方法

用NMW-1型納米霧TM消毒滅菌儀對上述80 m3的潔凈車間進行滅菌試驗。根據(jù)潔凈區(qū)空間大小，按照使用流程，分別采用6 %活性過氧化氫消毒液或者1.5 %活性氧免洗消毒液，采用不同的噴霧體積和密閉時間進行納米霧滅菌試驗。

霧化時將設備置于車間正中間，5片生物指示劑分別放置在車間中間（編號3）和四個不同角落（設備噴霧頭前方兩個角落點編號分別為1和2，設備噴霧頭后方角落兩個點編號分別為4和5），所有生物指示劑離地面的高度均為1 m，并充分暴露于空氣中，當消毒液霧化完畢后，將房間密閉60～180 min，再排風60～120 min除去殘留的消毒劑，使其達到安全水平（空氣中過氧化氫濃度小于0.001 ‰），按無菌方法取出生物指示劑（芽孢條），放入對應編號的嗜熱脂肪芽孢培養(yǎng)液中，按照所購生物指示劑的使用說明書，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在（56±1）℃培養(yǎng)24 h后觀察。同時取同批生物指示劑1片作陽性對照。經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，若培養(yǎng)液變渾濁，顏色由紫色變?yōu)辄S色則判定為陽性；若培養(yǎng)液澄清，顏色不變色則為陰性；繼續(xù)培養(yǎng)至第7 d，如果培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，則判定為滅菌不合格；如果培養(yǎng)液仍為紫色，則判定為滅菌合格。

4 實驗結果

4.1 消毒液用量對滅菌結果的影響

固定密閉時間為90 min，用6 %活性過氧化氫消毒液分別噴霧不同體積，試驗空間滅菌效果，結果見表1所示。由表1可知，當6 %活性過氧化氫消毒液的霧化體積大于5 mL/m3時，即可滿足滅菌要求。

表1 活性過氧化氫消毒液用量對滅菌結果的影響Tab.1 Effect of the dosage of activated hydrogen peroxide disinfectant on the results of sterilization

固定6 %活性過氧化氫消毒液的霧化體積為5 mL/m3，改變霧化后的密閉時間，試驗滅菌效果，結果見表2所示。由表2可知，當消毒液霧化后的密閉時間大于90 min時，即可滿足滅菌要求。

4.3 不同消毒劑濃度對滅菌結果的影響

分別選用了6 %活性過氧化氫消毒液（專用殺孢子劑）和1.5 %活性氧消毒液2種不同濃度的消毒劑進行空間滅菌試驗，固定密閉時間為90 min和霧化體積為5 mL/m3，結果見表3所示。由表3可知，當霧化體積為5 mL/m3，密閉時間為90 min時，2種消毒劑均可滿足滅菌要求。

4.4 對表面的滅菌效果

采用 6 %活性過氧化氫消毒液進行納米霧空間滅菌，噴霧體積為 5 mL/m3，密閉時間為 90 min。滅菌完畢后，采用無菌棉簽擦拭滅菌后潔凈區(qū)內(nèi)各表面（4個墻面各2個點、地面隨機選8個點），每個點的擦拭面積為5×5 cm2，擦拭完后，用無菌手術剪刀把棉簽的頭部（棉花部位）剪斷，投入裝有50 mL 0.9 %無菌氯化鈉溶液的錐形瓶中并密閉。將裝有樣品的錐形瓶反復振搖，使棉簽上的微生物釋放到溶液中。取樣品溶液，用薄膜過濾法過濾后，取出濾膜，含菌面朝上，貼于TSA培養(yǎng)基上，30～35℃培養(yǎng)5 d，計數(shù)并與滅菌前的檢測結果進行對比。結果見表4所示。由表4可知，當霧化體積為5 mL/m3，密閉時間為90 min時，過氧化氫納米霧滅菌技術不僅可以用于空間滅菌，而且還可對物體表面進行滅菌，滅菌后，墻壁和地面的表面微生物水平均符合GMP的要求。

表2 密閉時間對滅菌結果的影響Tab.2 Effect of sealing time on the results of sterilization

表3 活性過氧化氫消毒劑的濃度對滅菌結果的影響Tab.3 Effect of the concentration of activated hydrogen peroxide on the results of sterilization

表4 滅菌前后微生物污染水平的比較Tab.4 Comparison of microbial contamination levels before and after sterilization

4.5 過氧化氫殘留量的測定

滅菌結束后用通風60～120 min，在房間的不同部位（與生物指示劑放置位置相同）用GY-02型過氧化氫氣體濃度探測器對過氧化氫的殘留量進行檢查，結果均小于＜0.001 ‰（見表5所示）。

表5 過氧化氫的殘留量檢測結果Tab.5 Detection results of residual hydrogen peroxide

5 結束語

（1）過氧化氫納米霧滅菌技術是近年來發(fā)展起來的一種新型空間滅菌技術[6-7]，它將分離干燥技術和文丘里原理相結合，可將消毒液霧化并進行分離干燥至1 μm以下的干燥小微粒，這種干燥的消毒劑小微粒能夠長時間懸浮在空氣中作無規(guī)則的布朗運動，從而保證了消毒劑與空氣中的微生物充分接觸而達到滅菌的目的。同時由于這種干燥的小微粒在接觸物體表面后會產(chǎn)生反彈作用，不會像濕顆粒一樣會凝結在一起形成液膜或液滴，因而不會潤濕被消毒滅菌的物體表面而產(chǎn)生腐蝕，特別是對彩鋼板和環(huán)氧地面沒有腐蝕作用，是目前用于各種可密閉空間和各種人造設備的一種比較理想的滅菌技術。

（2）本研究采用采用湖北荷普藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的NMW-1型過氧化氫納米霧TM消毒滅菌儀以及6 %活性過氧化氫消毒劑（專用殺孢子劑）和1.5 %活性氧免洗消毒液對GMP車間進行滅菌試驗，并用生物指示劑（嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子，孢子量106）進行驗證，結果均能使芽孢下降六個對數(shù)，滿足滅菌要求，且滅菌后過氧化氫殘留濃度也符合要求。

（3）過氧化氫納米霧滅菌技術目前已用于數(shù)家制藥企業(yè)GMP車間的滅菌，均取得了比較滿意的結果。

（4）納米霧滅菌技術設備結構簡單、價格低廉，僅為目前VHP滅菌設備市場價格的十分之一，不僅可以用于空間滅菌，而且還可以同時對物體表面如地面和墻壁進行滅菌，取得了一舉兩得的滅菌效果。而傳統(tǒng)的表面滅菌方法均是利用大量消毒液對物體表面進行擦拭，不僅浪費人力物力，還不能完全達到滅菌的效果。

（5）消毒劑（殺孢子劑）的具體用量應根據(jù)待滅菌的空間布局進行適當調(diào)整，當空間布局比較復雜（如含有大量設備影響空氣流通）時可適當增加殺孢子劑用量，反之則適當減少殺孢子劑用量。

（6）空氣過分潮濕會對滅菌效果產(chǎn)生一定的影響，建議使用時保持空氣相對濕度小于75 %，必要時要對待滅菌的空間進行除濕處理。

[1]史云. 汽化過氧化氫（VHP）常溫滅菌系統(tǒng)的應用探討[J]. 醫(yī)藥工程設計，2011，32（3）：12-14.

[2]Michelle Finnegan，Ezra Linley，Stephen P. Denyer et al. Mode of action of hydrogen peroxide and other oxidizing agents：differences between liquid and gas forms[J]. J Antimicrob Chemother 2010，65： 2108–2115.

[3] 丁曉玥，梁毅. 國外汽化過氧化氫（VHP）低溫滅菌系統(tǒng)的最新動態(tài)觀察與探討[J]. 機電信息，2010，272（26）：45-47.

[4]陳琦. 氣化過氧化氫的滅菌技術及其驗證分析[J]. 機電信息，2016，467（5）：41-48.

[5]郁朝陽. 汽化過氧化氫滅菌技術及其在動物設施消毒中的應用[J]，醫(yī)藥工程設計 2012，33（2）：49-53.

[6]劉萬忠，別明仿，張超. 一種超干霧發(fā)生器： 201610058240.6 [P]．2016.05.25.

[7]劉萬忠，別明仿，張超. 一種霧化噴頭： 201610149887.X [P]. 2016.06.01.

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Study of Effects of Using Hydrogen Peroxide Nano Fog in Sterilization for GMP Workshop

Liu Wanzhong, Zhang Chao, Zhang Jie
（Hubei Hope Pharmaceutical Co., Ltd, Wuhan 430048）

In order to examine the sterilizing effect of hydrogen peroxide nano technology sued in cleaning area in GMP workshop, two different sterilizing liquids of hydrogen peroxide and different sterilization parameters were used. It was concluded that when the volume of sterilizing liquid fog is larger than 5 mL/m3and the space is sealed above 90 min, hydrogen peroxide nano can be applied to sterilizethe cleaning area in GMP workshop, that is, the sterilization requirements for space and surface can be met.

nano fog; super-dry fog; GMP workshop; sterilization

TQ460.8+2

A

2095-817X（2016）06-0030-004

2016-05-24

劉萬忠（1964—），男，副主任技師，主要從事消毒劑和消毒設備等方面的研究工作。